Эволюция опухолевых клонов при остром лимфобластном лейкозе взрослых

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Острые лейкозы представляют собой гетерогенную группу опухолевых заболеваний кроветворной тка ни, характеризующихся поражением костного мозга морфологически незрелыми (бластными) кроветвор ными клетками. В зависимости от принадлежности опухолевых клеток к той или иной линии гемопоэ за, острые лейкозы принято разделять на острые лимфобластные и острые миелобластные лейкозы. Без терапии течение заболевания быстропрогресси рующее и всегда заканчивается смертью больного. Наиболее часто причиной смерти являются тяжелые инфекционные и геморрагические осложнения, об условленные замещением нормальной кроветворной ткани бластными клетками. Основная цель терапии любых форм лейкозов - эрадикация опухолевого клона, восстановление нор мального кроветворения и достижение длительной безрецидивной выживаемости больных. Введение в клиническую практику цитостатических препара тов в конце 60-х годов позволило достичь полной ре миссии у 85-95% детей с ОЛЛ [1]. При этом важным прогностическим фактором является возраст, бессо бытийная выживаемость детей варьирует в разных возрастных группах от 83-97% (1-5 лет) до 49-66% (10-15 лет). На сегодняшний день Российской иссле довательской группой по лечению острых лимфо бластных лейкозов (RALL) показано, что в группах взрослых больных моложе 30 лет 5-летняя безре цидивная выживаемость составила 71.5%, в то вре мя как у больных 30-55 лет этот показатель был ниже - 61.8% [2]. Показано, что взрослые и дети, больные ОЛЛ, отличаются не только выживаемо стью, но также биологическими свойствами и прогно зом заболевания [3, 4]. В частности, к группе благо приятного прогноза у взрослых относят Т-клеточный вариант заболевания, в то время как у детей этот ва риант считается прогностически неблагоприятным. Кроме того, у взрослых чаще выявляют прогности чески неблагоприятные хромосомные аберрации (t(9;22), t(4;11)), миелоидные антигены на мембра не опухолевых клеток, в дебюте заболевания чаще определяют гиперлейкоцитоз, чаще диагностируют Т-клеточный иммунофенотип [3, 4]. Другой важный прогностический фактор при ОЛЛ - остаточное количество опухолевых клеток в костном мозге, или минимальная остаточ ная болезнь (МОБ). Оценка МОБ рассматривает ся не только как независимый фактор прогноза, но и как критерий разделения пациентов на группы риска развития рецидива [5-7]. Для оценки МОБ наиболее пригодны количественные методики с мак симальным уровнем чувствительности (10-4-10-5), такие, как ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с ис пользованием праймеров, специфичных для данного пациента, и многоцветная проточная цитофлуориме трия. Оценка МОБ у пациентов с ОЛЛ методом ПЦР основана на определении клональных реаранжиро вок генов Т-клеточных рецепторов (TCR) и имму ноглобулинов (IG) в опухолевых клетках и подборе пациент-специфичных праймеров к CDR3-области этих генов [8]. Клональные реаранжировки генов IG и TCR на ходят у 98% пациентов с В-ОЛЛ и у 95% больных с T-ОЛЛ [9]. Поскольку в опухолевых клетках, по лученных от разных больных, обнаруживают раз личные хромосомные аберрации, только перестро енные гены IG и TCR считаются универсальными маркерами, позволяющими отслеживать опухоле вые клоны практически у всех больных в течение болезни/терапии. Само по себе выявление клональ ности не является критерием для постановки диа гноза ОЛЛ. Клональные реаранжировки иногда обнаруживают и при реактивных (неопухолевых) процессах воспалительного, инфекционного или ау тоиммунного генеза. Как правило, в этих случаях клональный продукт определяется на поликлональ ном фоне. Дифференциальная диагностика опухо левой и неопухолевой лимфопролиферации пред ставляет определенную сложность при некоторых лимфомах, грибовидном микозе, синдроме Сезари, однако, исследование клональности при ОЛЛ, когда в периферической крови большинство лимфоцитов (> 20%) представлены опухолевыми клетками, таких затруднений не вызывает. ПЦР-РВ с пациент-специфичными праймерами, подобранными к уникальной по нуклеотидной по следовательности V-D-J-области клонально пере строенных генов IG или TCR, позволяет с высокой чувствительностью (10-4-10-5) оценить остаточное ко личество опухолевых клеток у пациентов с ОЛЛ [10]. Однако данные, полученные при изучении клональ ных перестроек в дебюте и рецидиве ОЛЛ у детей, свидетельствуют о том, что реаранжировки генов IG и TCR могут изменяться в течение заболевания, т.е. в рецидиве заболевания часть выявленных клональ ных реаранжировок исчезает и/или появляются но вые реаранжировки. Необходимо отметить, что речь идет именно о частичной смене клональных реаран жировок, так как полная смена генных реаранжи ровок IG и TCR в рецидиве указывает на возникно вение вторичного ОЛЛ [11, 12]. Частичные различия клональных реаранжировок в дебюте и рецидиве на блюдаются у 67-70% детей с В-ОЛЛ и 45-50% детей с Т-ОЛЛ [13-15]. Данные об эволюции опухолевых клонов у взрослых с ОЛЛ весьма ограничены [11]. У Szczepanski и соавт. приведены результаты оцен ки генов TCR у 9 взрослых с T-ОЛЛ [11]. Показано, что в целом стабильность генов TCR при взрослом Т-ОЛЛ выше (97%), чем при детском Т-ОЛЛ (86%) [11]. При этом реаранжировки генов IG в дебюте и ре цидиве заболевания не изучали. Смена клональных реаранжировок, т.е. клональ ная эволюция опухоли, может приводить к потере мишени для исследования МОБ и ложноотрицатель ным результатам. Таким образом, приемлемость той или иной реаранжировки для изучения МОБ при ОЛЛ определяется не только частотой ее выяв ления, но и стабильностью. Основные данные изуче ния стабильности и частоты различных реаранжи ровок при B-ОЛЛ и T-ОЛЛ суммированы в табл. 1 [5-11, 15-19]. Перестройки генов δ-цепи TCR (TCRD) - са мая ранняя из генных перестроек в T-лимфоцитах. Клональные перестройки генов TCRD встречаются примерно в 55% случаев Т-ОЛЛ [20], генов γ-цепи TCR (TCRG) - у 95% пациентов [21], генов β-цепи TCR (TCRB) - у 92% пациентов. Стабильность ре аранжировок TCRB при рецидивах T-ОЛЛ у де тей была ниже стабильности γ- и δ-цепей - 80 vs 86 и 100% соответственно (см. табл. 1) [11]. Несмотря на высокую частоту обнаружения и высокую ста бильность, моноклональные перестройки генов γ-цепи являются не самой удачной мишенью для кон троля МОБ, поскольку имеют короткий фрагмент нуклеотидной вставки [22]. Согласно опубликован ным данным, Т-ОЛЛ чаще, чем B-ОЛЛ, оказывает ся устойчивым к терапии и положительным по МОБ [23]. Выявлена высокая стабильность реаранжировок генов IGK (95%) при В-ОЛЛ у детей, завершенных V-D-J-реаранжировок генов IGH (88%), TCRB (89%) и TCRD (86%), относительно высокая стабильность реаранжировок генов TCRG (75%) и низкая стабиль ность неполных (D-J) перестроек генов IGH (57%) и неполных перестроек генов TCRB (67%) (табл. 1). Кроме того, в значительной части случаев детского B-ОЛЛ (26-30%) изначально определяется олигокло нальный характер реаранжировок [13-15]. При ОЛЛ возможно присутствие клональных продуктов с не завершенной реаранжировкой генов и производных от них клональных продуктов с завершенными ре аранжировками, что объясняется действием V(D) J-рекомбиназ и «текущим» продолжающимся про цессом реаранжировок генов иммуноглобулинов и TCR в ранних клетках-предшественниках [11, 15, 24]. Чаще других олигоклональность (наличие двух и более клонов) выявляют в генах IGH: полные реа ранжировки - в 30-40% случаев, неполные - в 50- 60%, гены δ-цепи TCR - в 20-25% случаев (табл. 1). Олигоклональные реаранжировки не рекомендовано использовать в качестве мишени для оценки МОБ: они нестабильны и часто дают ложноотрицательные результаты. Эволюцию опухолевых клеток (смену клональных реаранжировок генов TCR и IGH) в рецидиве заболе вания изучали в основном на детском ОЛЛ. Данные для взрослых больных ОЛЛ весьма ограничены. Учитывая то, что ОЛЛ у взрослых и детей имеют раз ные биологические свойства и прогноз заболевания, цель нашего исследования состояла в изучении харак тера клональных реаранжировок генов иммуноглобу линов и Т-клеточных рецепторов и их стабильности у взрослых с B-ОЛЛ и Т-ОЛЛ, проходивших лечение в Гематологическом научном центре МЗ РФ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Пациенты и образцы В исследование включено 63 больных ОЛЛ: 34 - с В-клеточным вариантом ОЛЛ, в том числе два с Ph+ ОЛЛ; 28 - с Т-клеточным вариантом ОЛЛ и один с бифенотипическим вариантом ОЛЛ (табл. 2). Всем больным проводили стандартное цитогенети ческое исследование, FISH-исследование клеток костного мозга с флуоресцентными зондами t(9;22) и t(4;11) (табл. 3). Нормальный кариотип имели 20 из 63 пациентов, у 17 из 63 не было митозов, у ше сти выявлены различные изменения хромосомы 9 и/или 22. Транслокация t(9;22) обнаружена мето дом FISH, а химерный транскрипт BCR/ABL (p190) идентифицирован молекулярно-генетическим ме тодом (Ph+ B-ОЛЛ). У пяти больных методом FISH выявлена транслокация t(4;11), а с помощью ПЦР химерный транскрипт MLL-EPS15. У семи больных найдены множественные хромосомные аномалии: у четверых - трисомия 21. Исследовали ДНК, полу ченную из всех 63 образцов костного мозга в дебюте заболевания. Возраст пациентов 19-59 лет (медиа на - 28). У шести из 63 пациентов изучали клональ ные реаранжировки в дебюте и рецидиве заболе вания. Время до рецидива составило от 5.4 до 11.6 месяцев. Больных наблюдали в отделении химио терапии гемобластозов и депрессий кроветворения Гематологического научного центра (далее ГНЦ). Диагнозы устанавливали в соответствии с класси фикацией ВОЗ. Согласие на обработку данных полу чено от всех пациентов, включенных в исследование. Кровь здоровых доноров получена на станции пере ливания крови ГНЦ. Анализ клональности по реаранжировкам генов IG/TCR Лейкоциты и ДНК из периферической крови вы деляли как описано ранее [25]. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически. Образцы ДНК хранили при -20°С. B- и T-клеточную клональность определяли с использованием мультиплексных си стем праймеров BIOMED-2 для фрагментного ана лиза [26]. B-клеточную клональность оценивали по перестройкам генов тяжелых цепей IGН (VH-JHFR1/ FR2/FR3/ DH-JH), легкой цепи κ IGK (Vk-Jk/ Vk-KDE/IntronRSS-KDE). T-клеточную клональ ность оценивали по перестройкам генов T-клеточных рецепторов TCRG (VG-JG), TCRB (VB-JB/DB-JB), TCRD (VD-JD/DD2-JD/VD-DD3/DD2-DD3). Все локусы генов IG и TCR анализировали при помощи мультиплексных реакций с большим количеством праймеров, разделенных на несколько пробирок в со ответствии с рекомендациями протокола BIOMED-2 (см. краткое описание в табл. 4). Для амплификации генов TCRB использовали коммерческий набор TCRB Gene Clonality Assay ABI Fluorescence Detection (Invivoscribe Technologies, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Смесь (25 мкл) для ПЦР генов IGH, IGK и TCRG, TCRD содержала 5 пмоль каждого праймера («Синтол», Россия), 100- 200 нг ДНК и 12.5 мкл 2 ×PCRMasterMix (Promega, США). Амплификацию проводили на автомати ческом термоциклере DNAEngine (BioRad, США). Условия ПЦР: 95°C (7 мин), затем 35 циклов - 95°С (45 с), 60°С (45 с), 72°С (45 с) и 72°С (10 мин). В каче стве положительного (клонального) контроля исполь зовали клеточные линии Jurkat и Daudi, в качестве поликлонального контроля - мононуклеары перифе рической крови здоровых доноров. Для фрагментно го анализа ПЦР-продуктов использовали автомати ческий анализатор нуклеиновых кислот ABIPRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). С этой целью 2 мкл разведенного в 20 раз ПЦР продукта смешивали с 10 мкл Hi-Di формамида (Applied Biosystems, США) и 0.04 мкл GeneScan 500-LIS Size Standard (Applied Biosystems, США). После денатурации при 95°C в течение 3 мин и по следующего охлаждения 10 мкл смеси вносили в лун ку 96-луночной плашки и проводили капиллярный электрофорез высокого разрешения на полимере POP-4 (Applied Biosystems, США). Флуоресценцию амплификатов и их профиль оценивали при помощи компьютерной программы GeneMapper v.4.0 (Applied Biosystems, США). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Клональные реаранжировки изучены у 34 паци ентов с В-клеточным вариантом ОЛЛ, 28 паци ентов с Т-клеточным вариантом, одного с бифе нотипическим вариантом заболевания. Частоты клональных реаранжировок генов γ-, β- и δ-цепей TCR и генов тяжелой и легкой цепей IG при B и Т-вариантах ОЛЛ представлены в табл. 5. У па циента с бифенотипическим вариантом выявлена биаллельная реаранжировка (два пика) генов TCRG и олигоклональная (четыре пика) генов TCRD. У па циентов с В-клеточным вариантом ОЛЛ наиболее часто встречались реаранжировки генов тяжелой цепи IG (82.4%) и γ-цепи TCR (76.5%), реаранжиров ки генов β-цепи TCR и генов κ-цепи IG обнаружены в 38.2% случаев, генов δ-цепи TCR - в 55.9%. У 89.3% пациентов с Т-клеточным вариантом ОЛЛ выявлены перестройки генов γ-цепи TCR. Перестройки генов δ-цепи выявлены в 64.3% случаев, генов β-цепи - в 60.7% случаев. Реже остальных при Т-ОЛЛ встре чались перестройки IGH - 28.6%. Перестройка генов легкой κ-цепи иммуноглобулина Vk/KDE найдена в одном случае Т-ОЛЛ. Наши данные по частоте кло нальных генных реаранжировок IG и TCR несколько отличаются от данных международных исследова ний, что мы связываем с небольшим размером вы борки. Олигоклональные реаранжировки (три и бо лее клональных пика) наблюдались как при B-ОЛЛ (IGH у 12% (4 из 34) пациентов, TCRD у 18% (6 из 34) пациентов), так и при Т-ОЛЛ (TCRD у 32% (9 из 28) пациентов). У шести пациентов клональные реаранжировки исследовали в дебюте и рецидиве заболевания. Всего в дебюте заболевания выявлено 17 клональных ре аранжировок генов TCR и 5 клональных реаранжи ровок генов IG. В рецидиве заболевания выявлено шесть клональных реаранжировок генов TCR и три клональные реаранжировки генов IG, которые отли чались от выявленных в дебюте (табл. 6). У двух пациентов с В-клеточным вариантом забо левания отмечена потеря одной из клональных реа ранжировок, выявленных в дебюте, при одновремен ном появлении новых реаранжировок (пациенты № 5 на рис. 1 и № 6 в табл. 6). У одной пациентки с диа гнозом раннего Т-ОЛЛ клональные реаранжировки генов γ-, β- и δ-цепей TCR, выявленные в дебюте за болевания, полностью совпадали с клональными ре аранжировками в рецидиве (№ 1). У одного пациента с диагнозом Т-ОЛЛ, при полном сохранении клональ ных перестроек, выявленных в дебюте, отмечено по явление новых реаранжировок (№ 2). У одного па циента в рецидиве заболевания сохранились только две из семи реаранжировок, выявленных в дебюте (рис. 2, № 4). У одного пациента в дебюте В-ОЛЛ вы явлена только одна клональная реаранжировка генов δ-цепи ТCR, которая сохранилась в рецидиве, но по явились несколько новых, в том числе клональные реаранжировки генов IGН и генов легкой κ-цепи IG. Нами показано, что у всех пациентов в рецидиве ОЛЛ сохранился хотя бы один клональный продукт из выявленных в дебюте (табл. 6). Это подтверж дает данные, согласно которым даже при развитии позднего рецидива ОЛЛ у детей (более чем через 5 лет с момента констатации ремиссии) сохраняется хотя бы один исходный клональный продукт [27]. В нашей работе у пяти из шести (83%) пациентов от мечено несоответствие клональных реаранжировок в дебюте и рецидиве заболевания. Даже при столь Таблица 6. Клональные продукты, выявленные в дебюте и рецидиве у шести пациентов с диагнозом ОЛЛ Пациент / диагноз № 1 T-ОЛЛ № 2 T-ОЛЛ № 3 B-ОЛЛ № 4 B-ОЛЛ № 5 B-ОЛЛ № 6 B-ОЛЛ Д Р Д Р Д Р Д Р Д Р Д Р TCRG-GA + + + + - - + - - + + + TCRG-GB + + - - - - + - - + - + TCRB-A + + - - - - + - - - - + TCRB-B - - - - - - - - - - + + TCRB-C - - - - - - - - - - - - TCRD-D1 + + + + 1 + + + + + + - - TCRD-D2 + + - - - + + - + - - - IGH-A/ IGH-B/ IGH-C - - - - - + - - + + 1 + + VK-A - - - - - + + - - - + - VK-B - - - - - - + + - - - - Примечание. «+» - моноклональная реаранжировка, «-» - поликлональная реаранжировка, «+1» - изначальная клональная реаранжировка выявляется с дополнительной, отличной от выявленной в дебюте заболевания, Д - дебют заболевания, Р - рецидив заболевания. небольшой выборке мы наблюдали клональную эво люцию в рецидиве заболевания, что делает акту альным вопрос о первоначальном выборе мишени для количественного определения МОБ. Для мини мизации риска ложноположительных результатов принято использовать как минимум две независимые мишени с высокой стабильностью. Однако на прак тике не ко всем мишеням удается подобрать паци ент-специфичный праймер, который обладает нуж ной специфичностью и чувствительностью. Прежде всего, это касается незавершенных реаранжиро вок или генных реаранжировок, где отсутствует D-сегмент, например TCRG (Vγ-Jγ). Нами обнару жена потеря пациент-специфичных мишеней, вы явленных у трех пациентов в дебюте заболевания. Для того чтобы зафиксировать минорные субкло ны в дебюте заболевания и оценить их поведение на фоне проводимой терапии, мы решили повысить первоначальную чувствительность метода. При по мощи праймеров, специфичных к семействам V и J, мы повторно исследовали первоначальный матери ал на предмет наличия клонов, возникших в реци диве. Использование таких праймеров увеличивает чувствительность определения опухолевых клеток с 10-1 до 10-2-10-3. Однако даже при такой чувстви тельности субклоны не были обнаружены в дебю те, что свидетельствует о малом размере субклонов и подтверждает данные других исследований. Так, в 77% (35 из 45) случаев детского В-ОЛЛ клоны с новыми реаранжировками в рецидиве присутствовали лишь в минимальных количествах при дебюте забо левания [28]. Размер таких резистентных субклонов варьировал от 10-2 до 10-5 клеток, и чем меньше было количество клеток, тем больше времени проходило до рецидива [29]. В последние годы показано, что острые лимфо бластные лейкозы имеют сложный и генетически не однородный состав опухолевых клеток в пределах одного заболевания [30, 31]. В большинстве случаев ОЛЛ клональная эволюция обусловлена реактива цией одного из минорных субклонов, резистентного к проводимой терапии [14, 29, 32]. Клональное раз нообразие является механизмом опухолевой про грессии. Часть клональных клеток, вероятно, имеет отличные от остальных клеток свойства (генетиче ские мутации, скорость деления, иммунологическую зрелость), что придает им устойчивость к воздей ствию химиотерапии. Причины поздней реактивации первоначального опухолевого клона до сих пор неиз вестны. Возможно, происходит ослабление иммуно логического надзора и механизмов противоопухолевого иммунитета или появление новых генетических мутаций в опухолевых клетках с их последующей реактивацией. Применение количественных методов оценки МОБ является независимым фактором про гноза и критерием разделения пациентов на груп пы риска развития рецидива. В течение заболевания спектр клональных реаранжировок может изме няться. Такой процесс может происходить в тече ние раннего индукционного курса терапии, что дает ложноотрицательные результаты определения МОБ и препятствует стратификации больных на группы риска. Успешный контроль минимальной остаточной болезни можно обеспечить только при подборе паци ент-специфичных праймеров для каждой клональ ной мишени, выявленной в дебюте заболевания. ЗАКЛЮЧЕНИЕ У пяти из шести (83%) пациентов отмечено несо ответствие клональных реаранжировок в дебюте и рецидиве заболевания, что говорит о клональной нестабильности на фоне проводимой полихимио терапии. Опухолевые клетки при ОЛЛ изначально имеют сложный генетически неоднородный состав, и в то время как одни клоны исчезают под воздей ствием полихимиотерапии, другие, не распознанные из-за недостаточной чувствительности метода, при обретают способность к пролиферации. Клональная эволюция служит одним из механизмов опухолевой прогрессии и является серьезной помехой для коли чественной оценки МОБ методом ПЦР. Нами показа но, что отсутствие амплификации с пациент-специфичными праймерами, подобранными к мишеням, секвенированным в дебюте заболевания, не может полностью гарантировать отсутствие остаточно го заболевания, так как мы показываем, что в ряде случаев при остром лейкозе опухолевые клоны не стабильны. Таким образом, в сомнительных слу чаях при подозрении на рецидив и отсутствии ам плификации с пациент-специфичными праймерами необходимо повторное исследование клональности. Изучение механизмов клональной эволюции, способ ности полихимиотерапии влиять на процессы кло нальной эволюции, возможно, будет способствовать разработке новых прогностических факторов и тера певтических подходов.

Об авторах

С. Ю. Смирнова

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

Ю. В. Сидорова

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

Н. В. Рыжикова

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

K. A. Сычевская

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: dusha@blood.ru
Россия

E. Н. Паровичникова

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Email: dusha@blood.ru
Россия

A. Б. Судариков

Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: dusha@blood.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы