Полногеномный анализ метилирования ДНК мононуклеарных клеток крови больных различными формами рассеянного склероза

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Рассеянный склероз (РС) - это тяжелое нейродеге неративное заболевание центральной нервной систе мы (ЦНС) со сложным комплексом патогенетических процессов, среди которых важнейшую роль играет хроническое аутоиммунное воспаление, направлен ное на миелиновую оболочку нейронов и приводя щее к демиелинизации, гибели олигодендроцитов, разрушению аксонов, глиозу и нейродегенерации. Этиология РС остается не выявленной. Проведенные в последние годы полногеномные исследования ясно показали, что наблюдаемый тип наследования РС, характерный для полигенных заболеваний, действи тельно определяется совместным вкладом множества независимо действующих или взаимодействующих полиморфных генов [1-3]. Однако если исключить из рассмотрения гены главного комплекса гистосов местимости (HLA), то каждый из аллелей риска РС, взятый отдельно, дает относительно малый эффект: отношения шансов для отдельных однонуклеотид ных полиморфизмов (SNP) находятся, за редкими исключениями, в диапазоне 1.1-1.3 [4]. Совокупный вклад всех генетических вариантов, идентифициро ванных при полногеномных исследованиях, может объяснить менее 27% наследуемости [5] - проблема, получившая название «недостающей», или «потерян ной» наследуемости (missing heritability). Эти наблю дения, а также низкий уровень конкордантности РС у монозиготных близнецов [6], влияние некоторых факторов внешней среды [7] и большая распростра ненность РС среди женщин [8] привели к предполо жению о том, что, помимо генетических факторов, важную роль в развитии и течении РС могут играть эпигенетические механизмы. Эпигенетические модификации представляют со бой различные функциональные изменения в гено ме организма, которые влияют на экспрессию генов в различных клетках или тканях, но не связаны с из менением нуклеотидной последовательности ДНК. Один из наиболее хорошо изученных эпигенети ческих механизмов - метилирование ДНК, самым распространенным вариантом которого является присоединение метильной группы к цитозиновым основаниям в составе CpG-динуклеотидов в позиции С5 цитозинового кольца. Этот процесс модулирует экспрессию близлежащих генов. Хотя глобальное метилирование ДНК довольно стабильная эпигене тическая модификация, передающаяся дочерним клеткам в ходе митоза, различные факторы внеш ней среды могут вызывать динамические изменения эпигенома в течение жизни. Полученные в последние годы результаты свидетельствуют о том, что эпиге нетические модификации могут играть важную роль в формировании риска развития аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний, в частности РС [9, 10]. Сравнительный анализ метилирования отдель ных генов у больных РС и у здоровых доноров вы явил гипометилирование в промоторной области гена PAD2, кодирующего пептидиларгининдезами назу типа II, в белом веществе мозга [11] и в моно нуклеарных клетках периферической крови (МНК) [12]. Гиперметилирование гена протеинтирозинфос фатазы SHP-1 обнаружено в МНК больных РС [13]. В последние пять лет проведено несколько срав нительных исследований полногеномного профиля метилирования ДНК больных РС и здоровых инди видов. Анализ метилома проводили как в клетках крови (МНК, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитах) [6, 14-16], так и в ткани белого вещества мозга [17]. Хотя все исследования проводили на небольшом количестве образцов, в CD4+ Т-лимфоцитах наблюдали диф ференциальное метилирование генов HLA класса II и некоторых других генов иммунной системы, ассо циация которых с заболеванием была показана ранее [15], а в тканях белого вещества выявлено дифферен циальное метилирование генов, связанных с выжива емостью олигодендроцитов [16]. РС характеризуется выраженной клинической ге терогенностью [8]. В цитированных работах объектом эпигенетических исследований были больные с наи более распространенной формой РС - ремиттирую щим РС (РРС), для которого характерно чередование периодов обострения и ремиссии. Примерно у 10-15% больных наблюдается первично-прогрессирующий РС (ППРС), проявляющийся непрерывным нарас танием неврологического дефицита с начала заболе вания. Протекает ППРС значительно тяжелее, чем РРС; уже на ранних стадиях ППРС отчетливо вы ражены признаки атрофии мозга. Пока не предло жено какого-либо специфического лечения больных ППРС, а все известные в настоящее время иммуно модулирующие препараты и кортикостероиды, при меняемые при РРС, в этом случае малоэффективны. В настоящей работе впервые проведен полноге номный анализ профиля метилирования ДНК в МНК больных РРС и ППРС в сравнении со здоровыми ин дивидами контрольной группы для поиска диффе ренциально метилированных CpG-сайтов, ассоции рованных с развитием двух основных клинических форм заболевания, а также сравнили профили мети лирования ДНК у пациентов с РРС и ППРС. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Характеристика больных РС и контролей В работу включены 14 больных РРС (девять жен щин и пять мужчин) и восемь больных ППРС (шесть женщин и два мужчины) в возрасте от 29 до 58 лет. Диагноз поставлен согласно критериям МакДональда в последней версии 2010 года [18]. Средний балл по шкале инвалидизации (EDSS) у больных РРС составлял 2.32 ± 0.82, у больных ППРС - 4.29 ± 0.39. Включенные в исследование больные никог да не принимали иммуномодулирующих препара тов. В контрольную группу вошли шесть женщин и двое мужчин в возрасте от 28 до 50 лет без острых или хронических неврологических заболеваний. Все они проживали в Московском регионе; оба их роди теля были этническими русскими (по данным анке тирования). От всех участников получено инфор мированное согласие на проведение генетических исследований. Выделение ДНК и анализ полногеномного метилирования Образцы периферической крови больных РС (8 мл) собирали в пробирки с EDТА (Vacuette® EDTA Tubes, Greiner Bio-One). Мононуклеарные клетки периферической крови (МНК) выделяли с помо щью центрифугирования на градиенте фиколл-ги пака. Геномную ДНК выделяли с помощью набора DNA Midi Kit (Qiagen, Santa Clara, CA, США) по ме тодике производителя. Бисульфильтную конвер сию геномной ДНК проводили при помощи набо ра EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research). Уровень метилирования ДНК анализировали на сканере iScan (Illumina) с использованием чипов Infinium HumanMethylation450 BeadChip [19] в ЦКП «Геномика» СО РАН (ИХБФМ СО РАН). Биоинформатический анализ Первичная обработка данных и их нормализация были выполнены с помощью специально разрабо танных скриптов на языке программирования R [20]. Оценку уровня метилирования каждого CpG сайта в образце проводили с помощью вычисления показателя бета (beta-value), который представляет собой отношение интенсивности сигнала метилирова ния данной пробы к общей интенсивности этой пробы (суммы интенсивностей метилированного и немети лированного сигнала). Значение бета варьирует от 0 (неметилированная проба) до 1 (полностью метили рованная проба). Вычисление значений показателя бета для каждой пробы в каждом образе проводили с помощью пакета methylumi [21]. Из последующего анализа были исключены про бы, содержащие однонуклеотидный полиморфизм на расстоянии до 10 п.н. от исследуемого CpG-сайта, и пробы, перекрывание которых с повторяющимися последовательностями ДНК обнаружено на расстоя нии до 15 п.н. от исследуемого CpG-сайта. Исключены также пробы, у которых величина р значимости об наружения сигнала (detection p-value) была больше 0.05 более чем в 5% образцов, а также пробы, распо ложенные в Х и Y хромосомах. В итоге, из исходных примерно 485 000 CpG-сайтов анализировали 384 138. CpG-сайт считали дифференциально метилиро ванным (ДМС), если различия между уровнями его метилирования в двух группах удовлетворяли двум условиям: абсолютные величины разности сред них по группам значений показателя бета долж ны быть > 0.1, а соответствующая величина p < 0.01. Локализацию индивидуального CpG-сайта в CpG островке определяли с использованием аннотации UCSC в hg19; соседние области (shore) локализова ны в 2 т.п.н. от CpG-островков, отдаленные обла сти (shelf) - в 2 т.п.н. от соседних областей (shore) [19]. Для оценки величины р использовали t-тест Стьюдента, модифицированный по эмпирическому методу Байеса и предоставляемый пакетом limma [22] в программном обеспечении R. Малый размер выборки не позволял вводить поправки на число гипотез (проб). Визуализацию сигналов ДМС с помощью метода главных компонент (principal component analysis, PCA) и построение карт интенсивности сигналов (heatmap) осуществляли с использованием стандарт ных методов среды R и специально разработанных скриптов на языке программирования R [22]. РЕЗУЛЬТАТЫ C целью изучения возможности вовлечения эпигене тического механизма метилирования ДНК в разви тие разных форм РС мы провели полногеномное про филирование сайтов метилирования ДНК из МНК периферической крови в репрезентативных груп пах больных РРС, больных ППРС и здоровых до норов (контроль) и сравнили образцы больных РРС с контрольными образцами, образцы больных ППРС с контрольными образцами, а также образцы боль ных РРС и ППРС между собой. Карты интенсивности сигналов ДМС, выявлен ных при этих трех типах сравнения, представлены на рис. 1А-В. Всего обнаружено 136 ДМС, наблю давшихся при одном или более попарном сравне нии. Сравнительный анализ метилирования ДНК при всех трех попарных сравнениях выявил суще ственные различия в профилях метилирования. При иерархической кластеризации по уровню мети лирования 136 ДМС наблюдается четкое объедине ние образцов ДНК больных каждой из сравниваемых групп в отдельный кластер. Визуальное сравнение интенсивности сигналов ДМС (соотношение синего и желтого цветов) указывает на более высокий уро вень метилирования ДНК больных ППРС, чем в кон троле и у больных РРС. Проведена визуализация данных для этих ДМС с помощью метода главных компонент (рис. 2). Видно, что включенные в исследование образцы хорошо дискриминируются в трехмерном пространстве пер вых трех главных компонент в три группы, и эти группы соответствуют трем фенотипам: РРС, ППРС и отсутствие этих заболеваний. Характеристика найденных ДМС представлена в табл. 1. При сравнении больных РРС со здоровыми донорами (контроль) выявлены различия в уровнях метилирования 30 ДМС, больных ППРС с контроль ной группой - 67 ДМС, а при сравнении двух форм РС обнаружено различие в уровне метилирования 51 сайта. В случае РРС бóльшая часть проб гипоме тилирована в сравнении с контролем (из 30 ДМС ги перметилированы только 43%). Напротив, у больных ППРС число гиперметилированных проб повышено как по сравнению с контролем (86% проб гипермети лированы), так и по сравнению с больными РРС (82% проб гиперметилированы). Более половины ДМС расположены в генах: 18 из 30 при сравнении РРС vs контроль, 38 из 67 - при ППРС vs контроль, 35 из 51 при сравнении ППРС vs РРС (табл. 1). Поскольку в платформе HumanMethylation450 генные пробы составляют примерно треть всех проб [19], можно констатировать определенное превышение числа наблюдаемых вну тригенных ДМС над ожидаемым при случайном рас пределении ДМС среди проб. Некоторые гены содер жат по нескольку ДМС; поэтому число генов с ДМС меньше - 17, 25 и 22 соответственно. Список этих генов (отдельно белоккодирующих, которых боль шинство, и белокнекодирующих) также представлен в табл. 1. 53% генов содержат ДМС с более высоким уровнем метилирования в первой группе при сравне нии РРС vs контроль, 76% - при сравнении ППРС vs контроль и 86% - при сравнении ППРС vs РРС. В гене RPH3AL обнаружены два ДМС, из которых один ха рактеризуется повышенным, а второй - пониженным уровнем метилирования при сравнении больных РРС со здоровыми индивидами и при сравнении больных ППРС с РРС. Согласно принятому в работе критерию, CpG-сайт считается ДМС при 10% разнице в средних уров нях его метилирования в сравниваемых группах (абсолютные величины разности средних по груп пам значений показателя бета должны быть > 0.1). Некоторые ДМС характеризовались более суще ственными различиями в уровне метилирования. При сравнении групп больных РРС и здоровых ин дивидов абсолютное значение разности средних значений показателя бета для пяти сайтов изменя лось более чем на 20%. Из этих сайтов три находят ся в генах: средний уровень метилирования сайтов cg07629776 (FRMD4A) и cg16866567 (PLEKHA2) в группе больных РРС повышен на 21.5 и 25.1% со ответственно, а сайта cg09885502 (GNAS) - понижен на 43.5% в группе больных РРС по сравнению с кон тролем. При сравнении больных ППРС со здоровы ми индивидами для шести сайтов из 67 абсолютное значение разности средних значений показателя бета отличалось между группами более чем на 20%. При этом наибольшая разница в уровне метилиро вания, а именно, его повышение на 41%, наблюдалась для сайта cg11979743 в гене FAM110A, и это един ственный из шести сайтов, расположенный в гене. При прямом сравнении ППРС и РРС обнаружено семь ДМС, уровень метилирования которых из менялся более чем на 20% (диапазон 20.1- 31.9%). Из них пять ДМС находятся в трех генах: средний уровень метилирования сайта cg11979743 (FAM110A) повышен на 31.9%, а cg01324343 (ABCC5) - пони жен на 21.8% в группе больных ППРС по сравне нию с больными РРС. В третьем гене, RNF39, най дено 11 ДМС, средний уровень метилирования трех из них (cg13401893, cg12633154, cg10568066) повышен на 20.1-21.0% в группе больных ППРС. Анализ локализации выявленных ДМС пока зал, что более половины из них находятся в CpG островках и близлежащих зонах (табл. 2; см. также рис. 1). Это распределение примерно соответству ет доле таких проб среди всех проб платформы [19]. Сравнение больных РРС с контролем показы вает, что 50% ДМС расположено в CpG-островках и 10% - в соседних с ними областях, в случае боль ных ППРС доля таких ДМС возрастает до 63 и 16% соответственно, а при сравнении ППРС с PPC - 53 и 18% (табл. 2). Таким образом, метилирование ДНК при ППРС затрагивает функционально более значи мые области генома. Совокупность полученных данных складывает ся в целостную картину: ППРС отличается от РРС бóльшими изменениями в паттерне метилирова ния ДНК. Действительно, при ППРС бóльшее число ДМС выявляется в геноме и его (известной) кодиру ющей части, причем значительно больше полови ны ДМС и в геноме, и в генах гиперметилированы. Кроме того, при ППРС бóльшее число ДМС, выяв ляемых при сравнении с контролем, локализовано в CpG-островках и соседних областях (79%), тогда как при РРС их доля составляет 60%. ОБСУЖДЕНИЕ C целью установить, участвуют ли эпигенетические механизмы в формировании клинически различных форм РС, мы впервые провели полногеномный ана лиз метилирования ДНК в МНК больных двумя фор мами РС - РРС и ППРС - и сравнили профили их метилирования со здоровыми индивидами и между собой. Выявлены существенные различия в профи лях метилирования ДНК: при попарном сравнении этих трех групп (14 больных РРС, восемь больных ППРС, восемь индивидов контрольной группы) об наружено 136 ДМС, характеризующихся различием средних показателей бета > 0.1 и величиной p < 0.01 по t-тесту Стьюдента. При трехмерной визуализации этих ДМС с помощью метода главных компонент об разцы ДНК больных каждой из сравниваемых групп объединяются в отдельный кластер, что свидетель ствует об устойчивом вовлечении дифференциаль ного спектра метилирования ДНК в развитие разных форм РС. Анализ спектра ДМС показал, что ППРС, более агрессивная, чем РРС, клиническая форма РС, от личается от РРС бóльшими изменениями в спек тре метилирования ДНК при сравнении с нормой. При этом среди ДМС количество сайтов с более высоким уровнем метилирования ДНК у больных ППРС выше, чем в контрольной группе и при РРС. В то же время сравнение РРС с группой контро ля выявляет гипометилирование более половины ДМС. Сравнивать полученные результаты с опу бликованными данными мы можем только в случае РРС. Выявлено значимое гиперметилирование ДНК CD8+ Т-лимфоцитов у больных РРС [14], в то время как в CD4+ Т-лимфоцитах и в цельной крови не на блюдали изменений общего уровня метилирования ДНК [14] либо отмечали его небольшое уменьшение [15]. Анализ локализации дифференциально мети лированных при РС сайтов показал, что более по ловины из них расположены или в CpG-островках, или во фланкирующих зонах (в диапазоне 2 т.п.н. от CpG-островка, так называемый «берег») (см. табл. 2), что с высокой вероятностью указывает на функциональное значение наблюдаемого метили рования ДНК, которое, как известно, заключается в блокировании экспрессии ряда генов. Мы провели поиск информации о функциях обна руженных нами ДМС-содержащих генов, используя базу данных генов человека GeneCards [23], ресурс Национального центра биотехнологической инфор мации США (NCBI) Gene [24] и ряд других источ ников. Сравнение групп больных РРС и здоровых индивидов выявляет различия в метилировании ге нов, которые кодируют белки, участвующие в раз витии иммунного ответа (ASB2, LEFTY2, PLEKHA2), в метаболизме липидов (ILDR1, CERS5), везикуляр ном транспорте (RPH3AL, ZFYVE28) и работе ион ных каналов (ATP11A, CACNA2D3, KCNK15), а так же в регуляции экспрессии многих генов (ESRRG, HOXC4-HOXC6). Среди них заслуживает отдельно го внимания ген ESRRG, кодирующий эстроген-по добный рецептор гамма. Этот орфанный рецептор относится к семейству ядерных рецепторов и ра ботает как активатор транскрипции ряда генов, в том числе гена основной ДНК-метилтрансферазы соматических клеток млекопитающих - ДНК метилтрансферазы 1 (DNMT1), за счет прямого свя зывания с промотором [25] и тем самым регулирует уровень метилирования ДНК в клетке. Данные о генах, дифференциально метилиро ванных в МНК больных РРС по сравнению со здо ровыми индивидами, полученные в нашей работе, не совпадают с результатами других исследований [6, 14-17]. Это не вызывает особого удивления, по скольку к настоящему времени сравнительный ана лиз метилирования ДНК больных РРС и здоровых индивидов проводили только в клетках цельной кро ви, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитах [6, 14-16] и в тканях белого вещества мозга [17] и также не наблюдали со впадения результатов для клеток и тканей разного типа. Несовпадение результатов может быть связано не только с использованием разных популяций кле ток, но и с разными критериями выбора ДМС. Анализ функций генов, дифференциально мети лированных у больных ППРС по сравнению со здоро выми индивидами, показал, что среди них есть груп па генов, продукты которых в той или иной степени участвуют в развитии и дифференцировке нервной системы (GDF7, MTPN, VIPR2, NTN1, TBX1), в функ ционировании опиоидных рецепторов (OPCML) и в метаболизме различных ксенобиотиков, включая кокаин и героин (CES1). Метилирование генов этой функциональной направленности не было выявлено при сравнении больных РРС и здоровых индивидов. При ППРС дифференциальное метилирование за тронуло также гены, участвующие в развитии им мунного ответа (HLA-F, MTPN, VIPR2), в регуляции экспрессии многих генов (HKR1, HOXB13, LDB2, TCP10L, TBX1), в процессах аутофагии (ATG16L2), гемостаза (FAM110A) и в функционировании внекле точного матрикса (CSGALNACT2). Среди дифференциально метилированных ге нов, выявленных при сравнении каждой из форм РС с контролем, обнаружено совпадение всего двух генов - ILDR1 и WRAP73(WDR8), причем и у боль ных РРС, и у больных ППРС уровень метилирования ДНК был ниже, чем у здоровых индивидов. Точное функциональное значение продуктов каждого из этих генов до конца не выяснено, однако актив ность рецептора ILDR1, по крайней мере частично, связывают с метаболизмом липидов [26], а содержа щий консервативные WD-повторы белок WRAP73 может формировать мультимерные комплексы с другими белками, участвуя в митозе, передаче сиг нала в клетке [27] и в формировании ресничек [28]. В нашей работе впервые выявлены гены, метили рование которых отличается у больных двумя основ ными формами РС. Продукты этих генов участвуют в развитии и функционировании клеток иммунной системы (HIVEP3, GIMAP5, TRAF3), в регуляции экс прессии многих генов (AKAP12, RASA3, CBFA2T3), в процессах деградации (USP35), в работе эндокрин ной системы (PTH1R). Среди них заслуживают от дельного внимания два гена. Так, ген ICAM5 кодирует дендрит-специфичную молекулу адгезии суперсе мейства иммуноглобулинов, которая в ЦНС участву ет во взаимодействии нервных клеток друг с другом и с клетками иммунной системы [29]. Из 35 ДМС, обнаруженных при сравнении ППРС vs РРС и рас положенных в генах, 11 были локализованы в гене RNF39 и характеризовались более высоким уровнем метилирования ДНК при ППРС. У трех из этих ДМС разница в уровнях метилирования превышала 20%. Ген RNF39 расположен в области генов HLA класса I. Функция RNF39 пока не выяснена, однако показана ассоциация полиморфных вариантов этого гена с РС [30] и некоторыми другими аутоиммунными заболе ваниями [31]. Гиперметилирование этого гена в CD4+ Т-лимфоцитах выявлено также у больных системной красной волчанкой [32]. Результаты полногеномного анализа профилей метилирования ДНК в МНК больных РС, получен ные в нашей работе, свидетельствуют об участии метилирования ДНК - одного из основных способов передачи эпигенетической информации у млекопи тающих - в развитии РС. Впервые показано, что эпи генетический механизм метилирования ДНК вовле чен в формирование клинически различных форм РС - РРС и ППРС, причем в случае ППРС метили рование, судя по всему, приводит к подавлению экс прессии большего числа генов.

Об авторах

O. Г. Кулакова

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России; Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

M. Р. Кабилов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

Л. В. Данилова

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН; Johns Hopkins School of Medicine

Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

E. В. Попова

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России

Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

O. A. Батурина

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

E. Ю. Царева

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России; Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава России

Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

Н. М. Баулина

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России; Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава России

Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

И. С. Киселев

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России; Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава России

Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

A. Н. Бойко

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России

Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

A. В. Фаворов

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН; Johns Hopkins School of Medicine

Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

O. O. Фаворова

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России; Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава России

Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

В. В. Власов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: olga.koulakova@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы