ZAD-домен определяет ядерную локализацию инсуляторных белков Drosophila melanogaster

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Белки с ДНК-связывающим доменом «цинковые пальцы» С2Н2-типа - самый обширный класс транс крипционных факторов у высших эукариот [1]. Обычно C2H2-домены формируют кластеры, часть из которых отвечает за высокоспецифичное связы вание с ДНК. У членистоногих обнаружен подкласс транскрипционных факторов с цинковыми пальцами типа С2Н2, представители которого на N-конце со держат специфичный домен, названный ZAD (Zincfinger Associated Domain), в котором четыре остатка цистеина координируют ион цинка [2, 3]. В клетках Drosophila melanogaster насчитывается более 90 транскрипционных факторов (рис. 1) с доменами С2Н2 и ZAD [3]. Геномы других представителей чле нистоногих могут кодировать от четырех (дафния обыкновенная) до 120 (малярийный комар) факто ров этого класса. Кристаллическая структура ZAD домена фактора Grauzone (Grau) показала, что он представляет собой димер (рис. 2А) [4]. Кроме того, in vitro показано, что ZAD-домены белков Serendipity-δ и Weckle также образуют димеры [5, 6]. До настояще го времени это семейство транскрипционных факто ров остается почти неизученным, определена только функциональная роль некоторых из них [7-9]. Три транскрипционных фактора с ZAD-доменом (Pita, ZIPIC и Zw5) можно отнести к классу инсулятор ных белков (рис. 2Б) [10, 11]. Инсуляторами назы вают регуляторные элементы, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором только в том случае, если находятся между ними [12, 13]. Недавно было показано, что инсуляторы могут участвовать в установлении дистанционных взаимо действий и организации архитектуры хромосом [14, 15]. Белок Zw5 обнаружен в составе инсулятора SCS, расположенного на границе кластера генов теплового шока 70 [10]. Белки Pita и ZIPIC исходно идентифи цировали как партнеры инсуляторного белка СР190, который считается ключевым для формирования ар хитектуры хроматина [11]. Все инсуляторные белки связываются со специфическими нуклеотидными последовательностями длиной 9-15 п.н., мультипли кация которых формирует эффективный инсулятор [10, 11, 16]. С помощью полногеномного анализа по казано, что Zw5, Pita и ZIPIC преимущественно свя зываются с промоторами генов [11]. Предполагается, что ZAD-домен может участвовать в организации дистанционных взаимодействий между удаленными сайтами связывания одного и того же инсуляторного белка [15]. В настоящей работе изучена точечная мутация в ZAD-домене белка Zw5, которая приводит к ле тальному фенотипу. Показано, что эта мутация нарушает ядерную локализацию белка Zw5. ZAD-домены других двух белков, Pita и Grau, также нуж ны для ядерной локализации этих белков. Таким образом, одна из функций ZAD-домена состоит в ре гуляции ядерной локализации транскрипционных факторов. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Экспрессия и очистка белков ДНК, кодирующую ZAD-домен белка Zw5 (дикого типа и с заменой R14G) дрозофилы, клонировали в плазмиду pET32a(+) в рамке с шестью остатка ми гистидина и тиоредоксином. Плазмидами транс формировали компетентные клетки Escherichia coli штамма BL21(DE3). Экспрессию белка инду цировали 1 мМ ИПТГ, перед индукцией добавляли 0.2 мМ ZnCl2, культуру инкубировали в течение ночи при 18°C на качалке. Бактериальные клетки разру шали ультразвуком в 50 мМ HEPES-KOH-буфере pH 7.6, содержащем 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 1 мМ ФМСФ с добавлением 1 : 500 Proteinase inhibitor cocktail VII (Calbiochem). Белки выделяли из лизата бактериальных клеток с помо щью аффинной хроматографии на Co-IDA-сефарозе. Элюцию проводили 50 мМ HEPES-KOH-буфером pH 7.6, содержащем 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазол, 5 мМ β-меркаптоэтанол. Химическая сшивка белков После выделения белки диализовали против буфера PBS. К препаратам добавляли глутаральдегид до ко нечной концентрации 0.01 или 0.1%, инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Реакцию останавливали, добавляя глицин до кон центрации 50 мМ, и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Продукты сшивки визуализировали при помощи электрофореза в по лиакриламидном геле с последующим окрашиванием серебром. Окрашивание препаратов клеток S2 D. melanogaster кДНК, кодирующие либо полноразмерные белки дикого типа, либо мутантные, клонировали в рамке с 3×FLAG-пептидом в плазмиду для транзиентной экспрессии под контролем промотора гена актина 5С. Клетки трансфицировали по стандартной ме тодике с помощью реагента Cellfectin (Invitrogen). Окрашивание проводили на 3-и сутки после транс фекции. В 35-мм чашке Петри на покровное стекло наноси ли 1 мл суспензии S2-клеток. Инкубировали в тече ние ночи при 24°C для осаждения клеток на стекло. Среду с неприкрепленными клетками удаляли. Все растворы наносили по стенке чашки, чтобы не смыть клетки со стекла. Инкубацию проводили при комнатной температуре на качалке с низкой ско ростью. Стекло промывали 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) 2 раза по 5 мин. Клетки фиксировали 1 мл фик сирующего раствора (2% формальдегида, 50 мМ MgCl2 в PBS) в течение 20 мин. Промывали 1 мл PBS 3 раза по 5 мин. Для повышения проницаемости клеточных мембран клетки обрабатывали 1% раствором Triton X-100 в PBS в течение 10 мин. Промывали PBS (1 мл 3 раза по 5 мин). Инкубировали в блокирующем раство ре (1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0.05% Tween-20 в PBS) 2 раза по 30 мин. Инкубировали с 1 мл блокирующего раствора с первичными анти телами (1 : 30 антиламин (из коллекции Университета Айовы), 1 : 300 анти-FLAG (Sigma)) в течение 1 ч. Промывали раствором 0.25% BSA, 0.05% Tween-20 в PBS (3 раза по 15 мин). Инкубировали с 1 мл блоки рующего раствора с вторичными антителами, конъ югированными с флуорофором (Invitrogen), и TOPRO- 3 Iodide в течение 1 ч. Промывали раствором 0.25% BSA, 0.05% Tween-20 в PBS (3 раза по 15 мин). Промывали 1 мл PBS в течение 5 мин, промывали стекло водой, удаляли избыток воды. Добавляли сре ду Vectashield для закрепления на предметном стекле. Края покровного стекла покрывали лаком. РЕЗУЛЬТАТЫ Летальная мутация в ZAD-домене белка Zw5 не влияет на его способность к димеризации Ген dwg (deformed wings), кодирующий белок Zw5, экспрессируется преимущественно в процессе эм бриогенеза. Описано много мутаций в гене dwg, ко торые имеют летальный фенотип, что предполагает важную роль Zw5 в эмбриональном развитии. Одна из охарактеризованных мутаций, dwg8 или zw562jl, приводит к замене аргинина на глицин в положении 14 (R14G) ZAD-домена [10]. Эта рецессивная мутация летальна на личиночной стадии. Для доказательства того, что именно мутация zw562jl отвечает за леталь ный фенотип, получена конструкция, в которой ген dwg находится под контролем промотора гена hsp83. В качестве репортера для идентификации трансфор мантов использовали ген white, который определя ет пигментацию глаз. В результате трансформации в эмбрионы дрозофилы получены четыре транс генные линии с одной инсерцией конструкции. Все трансгены комплементировали летальный фенотип мутации zw562jl, что подтверждает роль этой мутации в проявлении летального фенотипа. Таким образом, точечная мутация в ZAD-домене приводит к полной инактивации функциональной ак тивности Zw5. Из этого можно сделать вывод о важ ности R14 в составе ZAD-домена. Выравнивание по следовательностей ZAD-доменов различных белков показало, что большинство ZAD-доменов содержат остаток аргинина в положении 14 (рис. 1). Из 93 ко дируемых геномом Drosophila транскрипционных факторов с ZAD-доменом аргинин в положении 14 (R14) найден у 81, у пяти аргинин заменен на лейцин, в трех - на фенилаланин, в двух - на цистеин, в од ном - на аспартат и гистидин. Ранее предположи ли, что R14 участвует в димеризации ZAD-домена [4], поскольку он (R5 у белка Grau) вовлечен в фор мирование водородных связей с Q74 (рис. 2А), хотя эти остатки являются лишь небольшой ча стью протяженного интерфейса димеризации двух ZAD-доменов. С целью проверки этого предполо жения в векторе pET32a(+) клонировали кДНК, ко дирующие домены ZADwt и ZADR14G, слитые с тио редоксином, и экспрессировали их в клетках E. coli. Оказалось, что мутантный ZAD-домен выделяется в существенно меньших количествах по сравнению с доменом дикого типа. Это может свидетельствовать о меньшей стабильности и нарушении правильной конформации мутантного ZAD-домена, экспресси руемого в бактериях. Для сравнения димеризации нормального и му тантного ZAD-домена был проведен опыт по сши ванию ZAD-доменов с помощью глутаральдегида. Как видно из рис. 3, в концентрации 10 мкМ оба ZAD домена с примерно одинаковой эффективностью об разуют димеры. Таким образом, точечная мутация R14G не влияет на способность ZAD-домена белка Zw5 к димеризации in vitro, однако нельзя исклю чать возможности снижения стабильности димеров при низких концентрациях белка в клетке. ZAD-домены нужны для ядерной локализации белков в культуре клеток S2 Установлено, что у мутантного ZAD-домена сохране на способность к димеризации, поэтому следующей задачей стало изучение распределения нормального и мутантного белков Zw5 в S2-клетках дрозофилы. C этой целью созданы векторы экспрессии, в кото рых гены, кодирующие нормальный и мутантный белки Zw5, слитые с эпитопом 3×FLAG, находились под контролем актинового промотора. Этими век торами трансфицировали клетки S2, и определяли распределение белков с использованием антител к эпитопу 3×FLAG, ламину и красителя TO-PRO-3 Iodide, который окрашивает ДНК (рис. 4). Белок Zw5-3×FLAG локализуется преимущественно в ядре. Неожиданно оказалось, что белок Zw5R14G- 3×FLAG находится почти исключительно в цито плазме. Таким образом, точечная мутация нарушает ядерную локализацию белка Zw5, что объясняет ле тальный эффект аллеля zw562jl. По данным сервиса NucPred [17], белок Zw5 не содержит выраженных сигналов ядерной локализации. Для выяснения роли ZAD-домена в ядерной лока лизации белков использовали два других хорошо из ученных белка с ZAD-доменом: Pita и Grau [4, 8, 11]. Эти белки имеют одинаковую структуру, сходную с Zw5: ZAD-домен находится на N-конце, и группа доменов цинковых пальцев типа C2H2 образует кла стер на C-конце (рис. 2Б). Показано, что домены типа «цинковые пальцы» могут определять ядерную лока лизацию белков [18, 19]. Согласно данным програм мы NucPred [17], Pita не имеет выраженных сигналов ядерной локализации (NLS), а у Grauzone выражен ный NLS находится в центральной части (170-190 аминокислот). Сервис PredictProtein [20] предсказы вает ядерную локализацию всех трех белков с низ кой степенью значимости у Zw5 и Pita и с высокой - у Grauzone. кДНК, кодирующие белки Grau и Pita с ZAD доменом и без него, были слиты с эпитопом 3×FLAG и встроены в экспрессионный вектор под контролем актинового промотора (Act5C). Полученными кон струкциями трансфицировали клетки S2, распреде ление белков изучали на препаратах с использова нием антител к эпитопу 3×FLAG и ламину (рис. 4). Белки Pita-3×FLAG и Grau-3×FLAG находятся преимущественно в ядре. Окрашивание эндогенных белков Grau, Zw5 и Pita (данные не представлены) выявило их равномерное ядерно-цитоплазматиче ское распределение. Делеция ZAD-домена приводи ла к локализации FLAG-антител преимущественно в цитоплазме, что объясняется потерей способно сти белков без ZAD-домена попадать в ядро клеток (рис. 4). ОБСУЖДЕНИЕ Полученные нами результаты предполагают, что то чечная замена аргинина на глицин в положении 14 (R14G) ZAD-домена нарушает ядерную локализацию белка Zw5. R14 в ZAD-домене Zw5 соответствует пя тому аминокислотному остатку ZAD-домена Grau. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, боковая цепь этого остатка экспонирована наружу и в то же время способна к образованию водород ной связи с Q74 [4]. На основе этого авторы статьи [4] предположили, что аргинин-5 участвует в димери зации ZAD-домена Grau. Однако, согласно нашим результатам, аргинин-14 в составе ZAD-домена Zw5 не нужен для димеризации белка. Вероятно, струк тура ZAD-доменов может значительно различаться, что объясняет, почему ZAD-домены предпочтитель но гомодимеризуются (неопубликованные данные). Предполагаемая локализация аргинина-14 на по верхности ZAD-домена может объяснить роль этого остатка во взаимодействии с белками, которые ре гулируют импорт в ядро. У белков Pita и Grau ZAD домены гомологичны между собой и с ZAD-доменом Zw5 не более чем на 58%. Однако эти ZAD-домены также необходимы для локализации соответствую щих белков в ядре. Интересно, что c помощью биоинформатических подходов сигналы ядерной локализации были пред сказаны в средней части Grau и не найдены в составе белков Pita и Zw5. При этом белок Pita представлен в клетках в виде двух изоформ, которые различа ются наличием первых 60 аминокислот, входящих в состав ZAD-домена [по данным Flybase]. Согласно экспериментальным данным, локализация транс крипционных факторов с ZAD-доменом в клетке подвержена сложной регуляции. Так, изменение ядерно-цитоплазматической локализации белка Weckle в процессе развития было показано ранее [6]. ZAD-содержащий белок Trade Embargo, который связывается с хроматином, равномерно распределен между ядром и цитоплазмой [21]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты нашей работы показывают, что ядер но-цитоплазматическое распределение ZAD содержащих транскрипционных факторов, по всей видимости, имеет важное регуляторное значение, а ZAD-домены играют ключевую роль в этом про цессе.

Об авторах

Н. A. Золотарев

Email: errinaceus@rambler.ru
Россия

O. Г. Максименко

Email: errinaceus@rambler.ru
Россия

П. Г. Георгиев

Email: errinaceus@rambler.ru
Россия

A. Н. Бончук

Автор, ответственный за переписку.
Email: errinaceus@rambler.ru

Список литературы

Дополнительные файлы