Варианты и вариабельность дробления эмбрионов человека

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Последние десятилетия в связи с бурным развитием и коммерциализацией технологий «вспоможения за чатию» (репродуктивных технологий) доимпланта ционные зародыши человека стали предметом самого пристального внимания в буквальном смысле этих слов. Этические нормы и юридические ограничения позволяют использование только неинвазивных ме тодов изучения концептусов, т.е. только микроско пические наблюдения. Итогом тщательных феноме нологических исследований стала система оценок морфологии и темпов развития ранних эмбрионов человека in vitro, позволяющая с большей или мень шей степенью уверенности предсказывать появление имплантационно-компетентных («качественных») бластоцист [1, 2]. Внедрение в практику репродук тивной медицины инкубаторов, оснащенных устрой ством непрерывной видеорегистрации, существенно расширило возможности диагностики и прогнозиро вания качества эмбрионов [3-5]. В настоящее вре мя в архивах центров репродуктивной биологии че ловека накоплен огромный фактический материал, тщательный анализ которого может не только усо вершенствовать прогностические возможности мор фокинетического подхода к выявлению перспектив ных эмбрионов, но и углубить общие представления о раннем развитии плацентарных млекопитающих. Первая (меридиональная) борозда дробления по ляризованной зиготы плацентарных млекопитающих врезается на анимальном полюсе (в непосредствен ной близости к полярному тельцу) и распространя ется от анимального к вегетативному полюсу [6-10]. Борозды дробления бластомеров 2-клеточных эм брионов ортогональны первой борозде дробления и распространяются в плоскостях, приблизительно совпадающих с экваториальной и меридиональной плоскостями зиготы. Соответственно возможны че тыре варианта дробления бластомеров 2-клеточных эмбрионов: оба бластомера делятся экваториально (E) или меридионально (М) (варианты EE или ММ), либо первое деление меридиональное, а второе - эк ваториальное (вариант МE) и наоборот (вариант EМ). Перечисленные сочетания вторых делений дро бления описаны у эмбрионов мышей, причем вари анты 4-клеточных зародышей различаются «фено типами». При МЕ- или ЕМ-делениях бластомеры формируют тетраэдрическую структуру (т.е. про ецируются на вершины воображаемого тетраэдра). В результате ЕЕ- или ММ-делений бластомеры рас пределяются в виде «пластинки» или «розетки» [11, 12]. Согласно каноническим описаниям, 4-клеточный эмбрион человека в отличие от 4-клеточных эмбри онов мышей формируется в результате последова тельных меридиональных и экваториальных делений бластомеров 2-клеточных эмбрионов и соответствен но приобретает тетраэдрическую форму [6, 10, 13]. Между тем, существование принципиальных отли чий, в том числе в способах формирования 4-клеточ ных эмбрионов, на столь ранних (филогенетически древних) базисных этапах эмбриогенеза лаборатор ных млекопитающих и человека кажется маловеро ятным. Возникновение вариантов 4-клеточных эмбрионов в результате вторых делений дробления представля ется важным событием раннего онтогенеза. Различия в сегрегации ооплазмы сопряжены с различиями ди намического паттерна последующего развития эм брионов [14, 15], которое, вопреки этому, в норме за вершается формированием однотипной финальной структуры, т.е. бластоцисты. Иными словами, этот феномен следует полагать одной из причин вариа бельности последующего развития и соответственно наиболее ранним проявлением регуляционной спо собности эмбрионов млекопитающих. В соответствии с представленными выше посыл ками целью этого исследования стал (1) детальный анализ топографических особенностей второго де ления дробления культивируемых эмбрионов чело века; и (2) анализ вариаций временных параметров последующих этапов дробления у эмбрионов, раз личающихся вариантами второго деления дробления. Сопоставление генеалогии бластомеров с последо вательностью их делений позволило предположить роль дробления, предопределяющую нормальное развитие событий компактизации и кавитации эм брионов. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалом исследования послужили цейтра ферные видеорегистрации развития 101 эмбрио на человека (микроскоп Primo Vision, помещенный в термостат Thermo; видеозахват через каждые 15 мин), полученные в рамках стандартного протокола культивирования от 20 анонимных пациенток в воз расте от 27 до 44 лет (в среднем 34.7 г). Ориентацию первых трех делений дробления относительно ани мально-вегетативной оси зиготы и последователь ные моменты делений зиготы и каждого бластомера вплоть до 16-клеточной стадии развития определя ли, просматривая кадры цейтраферной съемки от дельных эмбрионов. Параллельно прослеживали генеалогию бластомеров. На основании этих реги страций 4-клеточные эмбрионы классифицировали в соответствии с вариантами делений второго цикла дробления и рассчитывали продолжительности зи готического периода (от оплодотворения до деления зиготы) и циклов дробления, т.е. разницы времен на ступления третьего и первого делений бластомеров (второй цикл дробления), седьмого и третьего де лений (третий цикл дробления) и 15-го и седьмого делений (четвертый цикл дробления). Определяли также продолжительности периодов, не сопровожда ющихся клеточными делениями (разницы времен на ступления второго и первого, четвертого и третьего, восьмого и седьмого делений), и периодов клеточ ных делений (разницы времен третьего и второго, седьмого и четвертого, 15-го и восьмого делений) второго, третьего и четвертого циклов дробления (см. рис. 2). Эти же измерения позволили вычислить продолжительности циклов отдельных бластомеров как разницы моментов делений соответствующих материнских и дочерних бластомеров. На основании этих данных можно восстанавливать и сопоставлять генеалогию бластомеров до наступления 16-кле точной стадии, используя в качестве маркировки бластомеров длительность их циклов. Результаты измерений анализировали и сравнивали с помощью непараметрических методов вариационной статисти ки с использованием пакетов программ Stadia (А.П. Кулаичев, МГУ им. М.В. Ломоносова) и Statistica v6 (StаtSoft). По истечении стандартного срока культи вирования диагностировали стадии развития заро дышей в соответствии с принятой классификацией [16, 17]. Уже в период первых делений дробления 33 эм бриона обнаружили разнообразные аномалии раз вития: чрезмерную фрагментацию, чрезвычайно короткие или длительные клеточные циклы (десят ки минут или двое и более суток, вплоть до полного отсутствия цитотомии на протяжении всего пери ода наблюдений), слияния бластомеров вскоре по сле деления, гигантские внутриклеточные вакуоли и внеклеточные полости у 4-8-клеточных эмбрионов. Эти зародыши были исключены из рассмотрения, но в отдельных случаях поддающиеся определению параметры их первых циклов сопоставляли с соот ветствующими параметрами у эмбрионов, развивав шихся без органических нарушений. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Взаимоотношения делящихся бластомеров Варианты ЕЕ-, ММ-, МЕ- и ЕМ-делений бластоме ров обнаружены у 10.3, 19.1, 27.9 и 42.6% 2-клеточных эмбрионов, развивавшихся без структурных анома лий (N = 68). В случае МЕ- или ЕМ-делений в силу ортогональности плоскостей деления бластомеров 2-клеточного зародыша две пары сестринских кле ток оказываются ориентированными почти взаимно перпендикулярно, а 4-клеточный эмбрион приобре тает близкую к тетраэдру конфигурацию. Со време нем геометрическая правильность такого тетраэдра совершенствуется за счет медленных перемещений сестринских пар бластомеров (рис. 1). В результате ЕЕ- или ММ-делений образуются своего рода «пла стинка» или «розетка» бластомеров. И в этих случаях сестринские пары бластомеров смещаются, ориен тируясь взаимно перпендикулярно. В результате, «пластинка» или «розетка» также принимают форму тетраэдра (рис. 1). Таким образом, форма 4-клеточ ных эмбрионов человека становится однотипной вне зависимости от ориентации предшествующих борозд дробления. Смещения клеточных пар, вероятнее все го, связаны с оптимизацией формы 4-клеточных за родышей в результате уравнивания механических напряжений, возникающих в ограниченном объеме зародыша после делений бластомеров. Ассоциация сестринских бластомеров, вероятно, связана с дли тельно сохраняющимися цитоплазматическими мо стиками [8, 11, 18]. Длительный контакт между се стринскими бластомерами способствует появлению клеточных кластеров - компактному размещению потомков бластомеров 2-, 4- и 8-клеточных зароды шей, образование которых мы наблюдали при вос становлении генеалогии бластомеров. Частоты встречаемости вариантов ЕЕ, ММ, МЕ и ЕМ у эмбрионов со структурными дефектами (30.3, 15.2, 24.2 и 30.3% соответственно; N = 33) не от личаются от частот у эмбрионов, развивавшихся без структурных аномалий (χ2 = 6.471, P = 0.091), но не соответствуют распределению, характерному для последних (χ2 = 15.130, P = 0.002). Это связано с тем, что доли ММ-, МЕ- и ЕМ-вариантов второго дробления в сравниваемых группах эмбрионов оди наковы (значения χ2 для соответствующих альтер нативных сравнений равны 0.17, 0.09, 0.65; P = 0.682, 0.763 и 0.419 соответственно). Частота ЕЕ-вариантов деления у аномальных эмбрионов имеет явную тен денцию к превышению (почти втрое) частоты у нор мальных эмбрионов (χ2 = 4.30, P = 0.038; с поправ кой Йейтса P = 0.072). Вероятно, следует полагать, что ЕЕ-эмбрионы склонны к органическим наруше ниям развития в большей мере, чем эмбрионы с ины ми вариантами вторых делений дробления. Такая же тенденция отмечена у ЕЕ-эмбрионов мышей [19]. Циклы и траектории дробления Варианты делений бластомеров во втором цикле дро бления небезразличны для последующего развития. Для ЕЕ-эмбрионов характерна сглаженная «волно образная» временная траектория развития. У ММ-, МЕ- и ЕМ-эмбрионов ярче выражена «ступенеобраз ная» траектория (рис. 2). Усредненные временные траектории (см. рис. 2) различаются между собой (парный критерий Вилкоксона; значимость разли чий (P) между ЕЕ- и ММ-, ЕЕ- и ЕМ-, ММ- и МЕ-, ММ- и ЕМ-вариантами равны 0.001; значимость раз личий между ЕЕ- и ЕМ-вариантами - 0.002; между МЕ и ЕМ - 0.023). Различия продолжительности циклов дробле ния становятся явными в третьем цикле дробления и усугубляются в 4-м. Наиболее продолжительны циклы у ЕЕ-, наименее - у ММ-эмбрионов. ЕМ и МЕ-эмбрионы занимают промежуточное положе ние. Удлинение полных циклов дробления связано, главным образом, с удлинением периодов клеточ ных делений. Соответственно частота делений мак симальна у ММ- и минимальна у ЕЕ-эмбрионов (табл. 1). ММ-эмбрионы достигают стадии 16 кле ток через 80.5 ± 4.85 ч (среднее ± стандартное от клонение); ЕМ-эмбрионы - через 87.7 ± 9.47 ч, а МЕ и ЕЕ-эмбрионы - через 94.8 ± 11.29 и 98.1 ± 5.05 ч (различия средних величин статистически значи мы за исключением различий для ЕЕ- и МЕ-групп (P = 0.197); критерий Ван-дер-Вардена). Вариабельность траекторий развития у МЕ и ЕМ-эмбрионов заметно выше, чем у ЕЕ- и ММ эмбрионов (см. рис. 2; сравните соответствующие значения стандартных отклонений, представленные в табл. 1). МЕ- и ЕМ-эмбрионы можно распределить на три группы в соответствии со сходством траек торий. Усредненные траектории развития как МЕ-, так и ЕМ-эмбрионов из разных групп значимо разли чаются между собой (P = 0.0007 для всех вариантов сравнений, парный критерий Вилкоксона). Эмбрионы второй группы отличаются большей продолжитель ностью циклов. Циклы дробления у эмбрионов тре тьих групп могут быть сравнимыми или превышать по продолжительности соответствующие циклы эмбрионов из первых групп, а в отдельных случа ях - циклы эмбрионов из вторых групп (см. детали в табл. 2). МЕ-эмбрионы первой, второй и третьей групп достигают 16-клеточной стадии развития через 85.1 ± 4.28 (среднее значение ± стандартное отклоне ние), 110.5 ± 6.10 и 94.6 ± 2.57 ч; ЕМ-эмбрионы - через 74.9 ± 3.10, 102.1 ± 5.20 и 88.8 ± 3.05 ч соответственно. Различия этих показателей статистически значимы (критерий Ван-дер-Вардена, P = 0.001, 0.024 и 0.001). В то же время усредненные траектории развития МЕ- и ЕМ-эмбрионов первой, второй и третьей групп не различаются (парный критерий Вилкоксона; P = 0.256, 0.158 и 0.112 соответственно). К завершению срока регистрации МЕ- и ЕМ эмбрионы из разных групп достигли разных стадий развития (табл. 2). Первые группы объединяют эм брионы, сформировавшие развитые бластоцисты (градации 4 и 5). Вторые группы включают медленно развивавшиеся эмбрионы, которые достигли стадии морулы или начинающей кавитировать бластоцисты. Третьи группы разнородны, поскольку к концу на блюдений составляющие их эмбрионы имеют весь спектр бластоцист, хотя большую часть составляют бластоцисты градаций 2 и 3 (табл. 2). Сопоставление альтернативных распределений (численности эм брионов, достигших градаций 5 и 4, с численностью более ранних эмбрионов в конце срока регистраций) показывает явное доминирование как МЕ-, так и ЕМ эмбрионов в группе 1 и соответственно доминирова ние отстающих в развитии зародышей в группе 2 (двусторонний точный критерий Фишера, P = 0.021 и 0.001). Такое же сопоставление групп 1 и 3 показа ло значимое различие альтернативных распределе ний у ЕМ-эмбрионов (P = 0.019), но сходство у МЕ эмбрионов (P = 0.277). Срок развития ММ-эмбрионов до 16-клеточной стадии занимает промежуточное положение между показателями для МЕ- и ЕМ-эмбрионов из первых групп, значимо короче первого показателя (крите рий Ван-дер-Вардена, P = 0.017), но длиннее второ го (P = 0.001). Усредненная траектория дробления ММ-эмбрионов отличается от траектории у МЕ и ЕМ-эмбрионов из первых групп (парный крите рий Вилкоксона, P = 0.001 и 0.000 соответственно). Альтернативное распределение (продвинутые про тив отстающих в развитии) в группе ММ не отлича ется от аналогичных распределений в первых груп пах МЕ- и ЕМ-эмбрионов (точный критерий Фишера, P = 0.590 и 0.148), но отличается от распределений во вторых группах (P = 0.015 для обоих сравнений). Усредненные параметры дробления (и соответ ственно траектории развития в период дробления) МЕ- и ЕМ-эмбрионов первых групп, так же как ММ эмбрионов (т.е., в совокупности, параметры быстро дробящихся зародышей), хорошо соответствуют про гностическим критериям успешно развивающихся зародышей (см. табл. 1 и 2). Генеалогия и циклы бластомеров Продолжительности циклов бластомеров у 4 и 8-клеточных эмбрионов с разными вариантами второго деления дробления, в целом, различны (кри терий Крускала-Уоллиса, P < 0.000 в обоих случа ях). Наиболее короткие циклы свойственны ММ эмбрионам, наиболее длительные - ЕЕ-эмбрионам. Промежуточное положение занимают МЕ- и ЕМ- эмбрионы, у которых циклы соответствующих бластомеров (особенно на 8-клеточной стадии) до статочно близки между собой (см. табл. 3). Циклы бластомеров первых групп МЕ- и ЕМ-эмбрионов короче, чем соответствующие циклы у эмбрионов из вторых и третьих групп (значения продолжитель ностей циклов и их статистические сравнения пред ставлены в табл. 4). В силу генеалогической иерархии время деления того или иного бластомера складывается из продол жительности цикла делящегося бластомера и про должительностей циклов предшествующих ему бластомеров. Неравенство циклов сестринских бла стомеров (рис. 3) является событием, «структури рующим» периоды делений бластомеров в каждом цикле дробления и траектории дробления в целом. Замена временных параметров траектории дро бления последовательностью (порядком) делений бластомеров (опосредующих сроки существования линий бластомеров, см. рис. 3) позволяет выявить вариабельность циклов отдельных бластомеров в со ставе различных эмбрионов. Распределения, связы вающие частоты делений сходных по происхожде нию бластомеров с последовательностью их деления в третьем и четвертом циклах траекторий дробления, значимо отличаются от соответствующих равнове роятных как для 4-клеточных ЕЕ-, ММ-, МЕ- и ЕМ эмбрионов (χ2 равны: 20.0, 40.3, 84.0 и 93.1 соответ ственно; пороговое значение χ2 (P < 0.05) равно 16.9), так и для 8-клеточных ММ-, МЕ- и ЕМ-эмбрионов (χ2 равны: 79.4, 98.9 и 133.8 соответственно; пороговое значение χ2 равно 66.3). Распределение для 8-клеточ ных ЕЕ-эмбрионов не отличается от равновероятного (χ2 = 56.0, P > 0.250), что связано с малочисленностью выборки таких эмбрионов. У 4-клеточных МЕ-эмбрионов бластомер 1 : 1 де лится раньше остальных в 78.9% случаев (χ2 = 31.7, P < 0.000), а бластомер 2 : 2 - в 84.2% (χ2 = 40.6, P < 0.000). Бластомеры 1 : 1 : 1, 2 : 2 : 2 и 1 : 2 : 2 зна чимо чаще делятся восьмыми, 15-ми и 14-ми (36.8, 42.1 и 36.8%; χ2 = 12.6, 26.1 и 15.1; P < 0.050, < 0.001 и 0.050 соответственно). Бластомеры 1 : 1 и 2 : 2 у 72.4 и 65.5% ЕМ-эмбрионов делятся четвертыми и седь мыми (χ2 = 40.6 и 34.6, P < 0.000); бластомер 1 : 1 : 1 - восьмым и девятым (в 34.5% случаев, χ2 = 36.9 и 22.0, P < 0.000 и < 0.005), бластомеры 1 : 1 : 2 и 2 : 2 : 2 - 14-ми и 15-ми (в 31.0 и 34.5%, χ2 = 35.8, P < 0.000) (см. рис. 4). У ММ-эмбрионов первыми и последни ми делятся бластомеры 1 : 1 и 2 : 2 (69.2%, χ2 = 16.8, P < 0.025) и бластомеры 2 : 2 : 1 и 2 : 2 : 2 (в 38.5% случаях, χ2 = 15.9 и 18.4, P < 0.050 и < 0.025 соответ ственно). Таким образом, на протяжении третьего и чет вертого циклов дробления в составе эмбрионов по являются и возрастают в численности бластомеры, у которых, вопреки сходству происхождения, су щественно различны последовательности делений (т.е. сроки существования линий бластомеров до мо ментов их делений). У подавляющего большинства 4-клеточных эмбрионов два бластомера преемствен но делятся первыми и последними, в то время как по следовательности делений двух других бластомеров переменны. У 8-клеточных эмбрионов вероятность преемственного раннего или позднего делений бла стомеров снижается, но увеличивается количество бластомеров, момент деления которых варьирует у разных эмбрионов. Если такая тенденция продол жается в пятом и шестом циклах дробления, то по следовательность делений всех бластомеров - 16 и 32-клеточных - станет стохастичной. Поскольку эмбрионы раньше или позже, но достигли финаль ной стадии развития (бластоцисты), можно полагать, что обсуждаемый феномен представляет собой одно из проявлений регуляционности бластомеров и за родышей в целом, возрастающей по мере дробле ния. Возрастание регуляционности, по определению, предполагает расширение спектра потенциальных дифференцировок. Соответственно можно ожидать расширение потенциальных возможностей к диф ференцировкам у бластомеров 8-клеточных и, тем более, 16- и 32-клеточных эмбрионов. Традиционно считается, что ооцит и зигота тоти потенты. Однако по цитологическим критериям ооцит и зигота, наследующая структуру ооцита, пред ставляют собой высокоспециализированные клет ки. Помимо характерной морфологии и специфиче ских синтезов, специализация зиготы проявляется в поляризованности, обеспеченной неравномерным распределением в объеме (и по протяженности кор тикального слоя) клеточных органелл и комплекса специфических регуляторных макромолекул [18-20 и др.]. Мы предполагаем, что только после элимина ции специфических особенностей организации зи готы и освобождения от влияний зиготических де терминантов бластомеры приобретают способность к собственным синтезам и регуляциям, к поляриза ции и формированию функциональных контактов и, в конечном итоге, к собственным специфическим дифференциациям [21-23]. На молекулярно-генети ческом уровне события, освобождающие бластомеры от «диктата зиготы» в период первых делений дро бления, исследованы слабо и, вероятнее всего, сопря жены с регуляциями клеточных циклов [24, 25]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ У плацентарных млекопитающих, в отличие от низ ших позвоночных, поляризованность («предразмет ка») зиготы достаточно лабильна, что предопределя ет вариабельность временных параметров раннего развития и при несовершенстве или недостаточности этой предразметки - довольно высокий уровень ано малий раннего развития. В результате реализации всех возможных комбинаций меридиональных и эк ваториальных борозд при дроблении 2-клеточных эмбрионов человека (так же как эмбрионов мышей и, вероятно, иных видов плацентарных млекопита ющих) формируются четыре варианта 4-клеточных эмбрионов. Бластомеры эмбрионов, относящихся к разным вариантам, включают в свой состав су щественно разные части зиготы, приобретая таким образом разные «дозы» детерминантов. Сегрегация зиготической цитоплазмы и детерминантов про должается в следующих делениях дробления. Это, в свою очередь, находит отражение в существенной вариабельности временных параметров (циклов бла стомеров, циклов дробления и траектории дробления в целом) в следующих раундах дробления каждого из вариантов 4-клеточных эмбрионов. Вариабельность, связанная со степенью «совершенства» организации зиготы, интерферирует с вариабельностью, при вносимой способом ее сегрегации, что проявляется в траекториях дробления. Примером могут служить траектории развития МЕ- и ЕМ-эмбрионов с суще ственно разными темпами дробления (первая, вто рая и третья группы). По предварительной оценке частоты формирования имплантационно-компетент ных бластоцист, восходящих к каждому из вариан тов 4-клеточных эмбрионов, различаются. Из этого следует, что вариант формирования 4-клеточных эмбрионов следует учитывать при раннем прогнозе перспективности отдельных зародышей. Замена временных показателей на порядковые (последовательности делений бластомеров в траекто рии дробления или, иными словами, опосредованные сроки существования линий бластомеров) позволила обнаружить еще одну форму вариабельности, свя занную с особенностями собственно процесса дро бления: изменчивость моментов вступления в следу ющий цикл дробления сходных по происхождению бластомеров в составе разных эмбрионов. Мы пред полагаем, что это явление связано с градуальным снижением эффектов детерминантов в результате последовательной элиминации специфической орга низации зиготы в ее фрагментах (т.е. бластомерах). Достигаемая таким образом дедифференциация бла стомеров предшествует и, возможно, разрешает осу ществление их собственной экспрессии, регуляции и, в конечном итоге, собственных дифференцировок. В большей или меньшей мере успешная дедиффе ренциация бластомеров предопределяет большее или меньшее временное смещение событий асимме тричных делений и компактизации, что, возможно, сказывается на соотношениях внутренней клеточной массы и муральной трофэктодермы в бластоцистах.

Об авторах

Ю. K. Доронин

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: ljh_rjycn@mail.ru
Россия

И. В. Сенечкин

Перинатальный медицинский центр, отделение лечения бесплодия и ЭКО

Email: ljh_rjycn@mail.ru
Россия

Л. В. Хилькевич

Перинатальный медицинский центр, отделение лечения бесплодия и ЭКО

Email: ljh_rjycn@mail.ru
Россия

M. A. Курцер

Перинатальный медицинский центр, отделение лечения бесплодия и ЭКО

Email: ljh_rjycn@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы