Каскад термофильных ферментов как инструмент создания модифицированных нуклеотидов

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ 5′-Фосфорилированные нуклеозиды являются важными метаболитами биосинтеза ДНК и РНК, а также косубстратами и кофакторами огромного числа биохимических превращений [1-3]. Важная роль этих соединений в живой клетке определяет интерес к синтезу не только природных представи телей этого класса, но и их разнообразных анало гов с целью направленного влияния на метаболизм в норме и при патологии [4-8]. Большое число ну клеозидов, модифицированных по гетерооснованию и углеводному фрагменту, используются в качестве важных средств против вирусных инфекций и зло качественных новообразований [9-13]. Действие модифицированных нуклеозидов опосредовано че рез внутриклеточное превращение в первую оче редь в 5′-монофосфаты и далее, как правило, в 5′ ди- и трифосфаты, которые и выступают в качестве антиметаболитов. Известно, что первая стадия ме таболической активации модифицированных нукле озидов - превращение в 5′-монофосфаты - опре деляет их биологические свойства. Следует также отметить, что нуклеозид-5′-монофосфаты, моди фицированные по гетерооснованию и/или по угле водному фрагменту, представляют значительный интерес в качестве исходных соединений для химического синтеза производных по фосфату (пролекарств) и ферментативного превращения в 5′-трифосфаты для последующего включения в олигонуклеотиды [14-16]. Разработка эффек тивных биосинтетических подходов к получению 5′-монофосфатов модифицированных нуклеозидов привлекает большое внимание исследователей, ра ботающих в области повышения эффективности хи миотерапевтических средств. Моно- и полиферментативному синтезу нуклеозид-5′-моно и 5′-трифосфатов посвящено большое число публикаций [17-21], среди которых наше внимание привлекли фосфорибозилтрансфе разы, недавно успешно использованные в каскадном пятикомпонентном синтезе пуриновых рибозид-5′ монофосфатов [22-24]. Известно, что нуклеозид фосфорилазы термофильных микроорганизмов ме нее чувствительны к структуре субстратов [25, 26], что позволяет работать при 70-80оС и существенно увеличивает эффективность ферментативной ре акции за счет повышения растворимости гетероци клических субстратов [27]. Все эти данные вызвали наш интерес к получению рекомбинантных фер ментов: рибокиназы, фосфорибозилпирофосфат синтетазы и аденин-фосфорибозилтрансферазы из термофильных микроорганизмов и изучению их субстратных свойств с целью определения потен циала этих ферментов в каскадном синтезе пури новых нуклеозид-5-монофосфатов согласно схеме на рис. 1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Клонирование Гены TT_RS05985, TT_RS06430, TT_RS06315, коди рующие TthPRPPS1, TthPRPPS2 и TthAPRT, соот ветственно амплифицировали на матрице геномной ДНК штамма Thermus thermophilus HB27 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использова нием синтетических праймеров. Ген QT17_05185, кодирующий RK из Thermus sp. 2.9, был оптими зирован по встречаемости кодонов для экспрессии в Escherichia coli и синтезирован химико-фермен тативным способом из перекрывающихся олигону клеотидов. Все гены клонировали в экспрессионный вектор pET-23d+ по сайтам узнавания рестриктаз NcoI и XhoI. Культивирование штаммов-продуцентов Штаммы E. coli BL21(DE3), Rosetta(DE3) и C3029/ pGTf2 трансформировали полученными экс прессионными векторами pER-PRPPS1-Tth, pER-PRPPS2-Tth, pER-APRT-Tth и pER-RKTsp. Штаммы-продуценты, производные E. coli BL21(DE3) и Rosetta(DE3), культивировали при 37°С в среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Культивирование штаммов-продуцентов, произ водных E. coli C3029/pGTf2, проводили в среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, 20 мкг/мл хлорамфеникола и 1 нг/мл тетрациклина. После достижения культурами оптической плотности A595 = 0.8 вносили ИПТГ до конечной концентрации 0.4 мМ и продолжали культивирование при 23 и 37оС. Длительность выращивания варьировала от 4 до 16 ч в зависимости от штамма. По окончании культивиро вания клеточную биомассу отделяли центрифугиро ванием, гомогенизировали в соотношении 1 : 10 (w/v) в буферном растворе 50 мМ Трис-HCl, pH 8.5, 150 мМ NaCl, 2 мМ ПМСФ и разрушали с помощью уль тразвукового дезинтегратора Labsonic P (Sartorius, Германия) в течение 10 мин при 4oC (цикл - 0.4 с, амплитуда - 30%). Содержание целевых ферментов в растворимой и нерастворимой клеточных фрак циях определяли денситометрическим анализом электрофоретических гелей с помощью программы ImageLab 5.0 (Bio-Rad, США) [28]. Выбор останови ли на штаммах-продуцентах, содержащих макси мальное количество целевого белка в супернатанте: E. coli BL21(DE3)/pER-APRT-Tth (культивирова ние в течение 4 ч при 37°C после внесения ИПТГ), E. coli Rosetta(DE3)/pER-PRPPS1-Tth (4 ч при 37°C), E. coli С3029/pGTf2/pER-PRPPS2-Tth (5 ч при 37°С) и E. coli С3029/pGTf2/pER-RK-Tsp (16 ч при 23°С). Штаммы выращивали в 5-6 л культуральной среды. Выделение и очистка TthPRPPS1, TthPRPPS2 и TspRK Клеточную биомассу штаммов-продуцентов TthPRPPS1, TthPRPPS2 и TspRK ресуспендировали в буферном растворе 50 мМ Трис-HCl, pH 8.7, 1 мМ ПМСФ в соотношении 1 : 10 (w/v) и разрушали с по мощью ультразвукового дезинтегратора Labsonic P в течение 20 мин при +4oC (цикл - 0.5 с, амплитуда - 50%). Клеточный дебрис отделяли центрифугирова нием при 12000 об/мин в течение 30 мин при +4oC на центрифуге Hermle Z383K (HERMLE Labortechnik GmbH, Германия). При выделении TspRK осветлен ный клеточный лизат подвергали термической об работке в течение 10 мин при 65°С для осаждения примесных белков и ДНК. Осадок отделяли центри фугированием. Дальнейшее выделение ферментов осуществляли по одной схеме. Осветленный кле точный лизат наносили на колонку XK 16/20 (GE Healthcare, США) с сорбентом Ni2+-IDA (Qiagen, Германия), предварительно уравновешенным буфер ным раствором 50 мМ Трис-HCl, pH 8.7. Отмывали от балластных белков буферным раствором 50 мМ Трис-HCl, pH 8.7, 50 мМ имидазол. Целевой белок элюировали буферным раствором 50 мМ Трис-HCl, pH 8.7, 200 мМ имидазол. После аффинной хрома тографии к фракциям, содержащим целевой бе лок, добавляли EDТА до 5 мМ и концентрировали при помощи ультрафильтрационной ячейки Amicon 8200 объемом 200 мл (Millipore, США) на мембране YM 10 кДа (Millipore) при выделении TthPRPPS1 и TthPRPPS2, YM 30 кДа (Millipore) при выделении TspRK. Последующую очистку проводили на ко лонке HiLoad 16/60 с сорбентом Superdex 200 (GE Healthcare) в буферном растворе 20 мМ Трис-HCl, pH 8.5, 1 мМ ATP, 1 мМ МgCl2, 5% глицерина, 0.04% NaN3. Фракции, содержащие целевой белок, объ единяли и концентрировали с помощью ультра фильтрации до конечной концентрации 12 ± 1 мг/мл как описано ранее. Концентрацию белка определя ли по методу Бредфорд, используя БСА в качестве стандарта [29]. Чистоту белка определяли с помощью белкового электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [28]. Выделенные фер менты хранили при -80°С. Выделение и очистка TthAPRT Разрушение клеточной биомассы штамма-проду цента TthAPRT осуществляли по методике, описан ной для других ферментов. В осветленный клеточ ный лизат добавляли NaCl до концентрации 300 мМ и проводили термическую обработку в течение 10 мин при 65°С. После осаждения осадка белка цен трифугированием лизат наносили на колонку PD-10 с сорбентом Sephadex G-25 Medium (GE Healthcare, США), уравновешенным буферным раствором 20 мМ Трис-HCl, pH 9.0, 1.0 мМ EDТА. Раствор белка после обессоливания наносили на колонку XK 16/20 с сор бентом Q Sepharose XL (GE Healthcare, США), урав новешенным тем же буферным раствором. Целевой белок элюировали в линейном градиенте концентра ции NaCl (от 0 до 400 мМ). Фракции, содержащие це левой белок, объединяли и наносили на колонку XK 16/20 с Phenyl Sepharose HP (GE Healthcare, США), уравновешенной буферным раствором, содержа щим 20 мМ Трис-HCl, pH 7.6, 1 М (NH4)2SO4, 1.0 мМ EDТА. TthAPRT элюировали в линейном градиенте (NH4)2SO4 (от 1 до 0 М). Фракции, содержащие целе вой белок, объединяли и концентрировали ультра фильтрацией на полисульфоновой мембране PBGC 10 кДа до конечной концентрации 5.0 ± 0.5 мг/мл как описано ранее. Окончательную очистку проводи ли на колонке HiLoad 16/60 с сорбентом Superdex 200 20 мМ Трис-HCl-буфере pH 8.0, содержащем 50 мМ NaCl, 5% глицерина, 0.04% NaN3. Фракции, содержа щие целевой белок, объединяли и концентрировали путем ультрафильтрации до конечной концентрации 12 ± 1 мг/мл. Концентрацию и чистоту белка опре деляли как описано ранее [28, 29]. Выделенный фер мент хранили при -80°С. Определение активности ферментов Активность TspRK определяли радиохимическим методом по образованию D-рибофуранозо-5-[32P] фосфата в присутствии [γ-32P]ATP. Реакционная смесь (0.05 мл, 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0) содержала 0.4 мМ динатриевой соли ATP, 1 мМ D-рибозы, 5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 1 мМ KH2PO4, 6 мкКи [γ-32P]ATP и 0.15 мкг TspRK. Смесь термостатировали при 75°C. Аликвоты (0.8 мкл) отбирали через 10, 20 и 40 мин и наносили на пластинки с PEI-целлюлозой, затем элюировали водным 0.5 М дигидроортофосфатом ка лия. Количество образовавшегося D-рибофуранозо- 5-[32P]фосфата определяли на жидкостном сцинтил ляционном счетчике TRI-CARB 2100TR (Packard BioScience Co.). Активность TthPRPPS1 и TthPRPPS2 определяли в реакционной смеси, состоящей из 1 мM динатрие вой соли ATP, 1 мM динатриевой соли D-рибозо-5 фосфата, 5 мM MgCl2, 10 мM KH2PO4, 20 мM Трис- HCl, pH 8.0, при 75°C. Добавляли 0.75 мкг TthPRPPS на 0.5 мл смеси. Активность TthAPRT определяли в реакцион ной смеси, содержащей 1 мM аденина, 1 мM пента натриевой соли 5-фосфорибозил-α-1-пирофосфата (PRPP), 5 мM MgCl2, 20 мM Трис-HCl, pH 8.0, при 75°C. TthAPRT добавляли из расчета 0.125 мкг на 0.5 мл реакционной смеси. За единицы активности принимали количество продукта (мкмоль), образую щееся за 1 мин. Определение кинетических параметров рибокиназы Реакционная смесь (0.5 мл, 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0) содержала (а) динатриевую соль ATP (от 0.01 до 0.6 мМ) и D-рибозу (1 мМ); (б) D-рибозу (от 0.01 до 8.0 мМ) и ATP (1 мМ) для определения значений KM и Vmax для ATP и D-рибозы соответственно, 5 мМ MgCl2, 50 мM KCl, 10 мM KH2PO4 и 0.0175 мкг TspRK. Для каждого эксперимента готовили 16 реакцион ных смесей. Смеси термостатировали при 75°C в те чение 12 мин, каждый эксперимент повторяли триж ды. Затем определяли среднее значение скорости в трех опытах с одинаковой концентрацией фермен та. Концентрации субстрата и продукта определяли с помощью ВЭЖХ в изократическом режиме элюи рования 0.1 М KH2PO4 (вода, pH 6.0, скорость пото ка 0.5 мл/мин) с измерением на длине волны 254 нм (УФ-детектор Waters 2489; колонка Supelcosil LC- 18-T, 5 мкм, 150 × 4.6 мм). Определение кинетических параметров PRPPcинтетаз Для определения кинетических параметров фер ментов концентрацию ATP изменяли в интервале от 0.005 до 0.2 мM. Аналогичный интервал исполь зовали для D-рибозо-5-фосфата. Остальные усло вия были такими же, как при определении фермен тативной активности. Реакцию проводили в течение 2 мин в трех повторностях. Затем определяли сред нее значение скорости в трех опытах с одинаковой концентрацией. Концентрации ATP и AMP опреде ляли с помощью ВЭЖХ в изократическом методе элюирования 0.1 M KH2PO4, pH 6.0, скорость потока 0.5 мл/мин, длина волны - 254 нм (детектор Waters 2489; колонка Supelcosil LC-18-T, 5 мкм, 150 × 4.6 мм). Определение кинетических параметров APR трансферазы При определении кинетических параметров APR трансферазы концентрацию аденина изменяли в ин тервале от 0.005 до 0.2 мМ, а PRPP - от 0.05 до 1.2 мМ. Остальные условия были такими же, как при опре делении активности. Реакцию проводили в тече ние 1 мин в трех повторностях. Среднее значе ние скорости реакции определяли по результатам трех экспериментов с одинаковой концентрацией. Концентрации аденина и AMP определяли методом ВЭЖХ в изократическом методе элюирования 36% водным метанолом, скорость потока 0.5 мл/мин, дли на волны - 254 нм (детектор Waters 2489; колонка MZ PerfectSil 100 ODS-3, 5 мкм, 150 × 4.6 мм). Кинетические параметры определяли нелиней ным регрессионным анализом при помощи програм мы SciDAVis v.0.2.4. Наблюдаемую каталитическую константу (kcat) рассчитывали на одну субъедини цу, массу которой определяли исходя из аминокис лотной последовательности (32.0 кДа для TspRK, 34.5 кДа для TthPRPPS1, 34.6 кДа для TthPRPPS2 и 19.0 кДа для TthAPRT). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ С целью изучения возможности трехступенчатого биосинтеза нуклеотидов проведены комплексные работы по получению и исследованию субстратных свойств рекомбинантных ферментов нуклеинового обмена - рибокиназы, двух PRPP-cинтетаз и APR трансферазы из T. thermophilus. Ген QT17_05185, кодирующий RK из Thermus sp. 2.9, получен химико-ферментативным способом. Гены TT_RS05985, TT_RS06430, TT_RS06315, коди рующие TthPRPPS1, TthPRPPS2 и TthAPRT из T. thermophilus HB27, соответственно амплифици рованы с геномной ДНК с помощью ПЦР. Все гены были клонированы в плазмидный вектор pET-23d+. Созданные в результате экспрессионные векторы pER-PRPPS1-Tth, pER-PRPPS2-Tth и pER-RK-Tsp содержали гибридные гены, объединяющие в одной рамке считывания последовательности, кодирующие ферменты и аффинную метку из шести остатков ги стидина. Экспрессионный вектор pER-APRT1-Tth содержал немодифицированную последователь ность, кодирующую TthAPRT. Этими плазмидами трансформировали штам мы E. coli BL21(DE3), Rosetta(DE3) и C3029/pGTf2. Подбирали условия культивирования штаммов-про дуцентов, при которых целевые ферменты синте зировались в растворимой форме. Продуценты рас творимых рекомбинантных TspRK и TthPRPPS2 получены на основе E. coli С3029/pGTf2. Этот штамм создан путем трансформации клеток E. coli С3029 плазмидным вектором pGTf2 (Takara Bio Inc.), не сущим последовательности, кодирующие белки шапероны GroES-GroEL-Tig под контролем про мотора Pzt-1. Выбор штамма E. coli Rosetta(DE3) для биосинтеза TthPRPPS1 обусловлен тем, что ген TT_RS05985, кодирующий TthPRPPS1, содержит редко используемые в E. coli кодоны (один AGA, де вять AGG, 10 CGG, один AUA, один CUA и 15 CCC). В штамме Rosetta(DE) синтезируются тРНК для этих редких кодонов. Рекомбинантную TthAPRT в раство римой форме получали в штамме E. coli BL21(DE3). Выделение и очистка рибокиназы и двух PRPPcинтетаз включали стадии металл-хелатной и гель-фильтрационной хроматографии (табл. 1). Термическая обработка клеточного лизата при вы делении TspRK позволила значительно обогатить фракцию целевым белком за счет агрегации клеточ ных белков и ДНК. При выделении обеих TthPRPPS аналогичная обработка не давала положительных результатов, а приводила к потере целевого белка. В связи с высокой вероятностью протеолиза металл хелатную хроматографию проводили при охлажде нии, а к объединенным фракциям добавляли EDТА. После проведения последней стадии очистки с помо щью гель-фильтрационной хроматографии все бел ковые препараты концентрировали. Выделение и очистка TthAPRT включала ста дии термической обработки, обессоливания, ани онообменной, гидрофобной, гель-фильтрационной хроматографии и концентрирования (табл. 1). Как и в случае TspRK, на первой стадии проводи ли термическую обработку осветленного клеточного лизата, но при этом в раствор добавляли соль (до 300 мМ хлорида натрия), что значительно ускоряло агре гацию примесных клеточных белков и ДНК. При использовании разработанных методик вы ход всех рекомбинантных термофильных ферментов составил не менее 8-10 мг/л культуральной среды с электрофоретической чистотой не менее 95%. Далее определяли кинетические параметры и оп тимальные условия работы выделенных рекомби нантных ферментов. Специфическую активность TspRK опреде ляли радиохимическим методом по образованию D-рибофуранозо-5-[32P]фосфата в присутствии [γ-32P]ATP. За единицы активности принимали ко личество продукта (мкмоль), образующееся за 1 мин. Активность TspRK составила 5.5 ед/мг. Специфическую активность TthPRPPS1 и TthPRPPS2 определяли опосредованно по образо ванию AMP в реакционной смеси (по данным ВЭЖХ) в присутствии двух субстратов: ATP и D-рибозо-5 фосфата. У первого фермента она составила 0.85 ед/ мг, а у второго - 11 ед/мг. Учитывая большие раз личия в активности ферментов, более рациональным представляется использование для синтеза нуклео тидов второй синтетазы, учитывая более низкий рас ход белка. Свойства TthAPRT изучали на модельной реакции взаимодействия аденина с 5-фосфорибозил- α-1-пирофосфатом. Образование AMP наблюдали при помощи ВЭЖХ. Специфическая активность фер мента составила 8.8 ед/мг. При использовании в качестве субстрата рибозы в высокой концентрации обнаружено ингибирование ферментативной активности TspRK. Данный эффект описан для рибокиназы человека [30]. Таким обра зом, результаты экспериментов с ATP анализирова ли с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен V = Vmax×S/(KM + S). В опытах с D-рибозой исполь зовали уравнение, учитывающее эффект ингибиро вания субстратом в результате связывания второй молекулы V = Vmax×S/(KM + S + S2/Ki). Кинетические параметры природных субстратов ферментов приведены в табл. 2. Результаты определения оптимальных условий работы рекомбинантных ферментов приведены на рис. 2-4. Изученные ферменты активны в широком тем пературном диапазоне. Максимальная активность TspRK и TthPRPPS1 наблюдалась при 85°C, тогда как активность TthAPRT при этой температуре сни жалась на 35%. Поэтому было решено дальнейшие каскадные синтезы проводить при 75°C. В отсутствие ионов магния в буферном растворе активность ферментов была очень низкой. При до бавлении 0.25 мМ хлорида магния активность значи тельно увеличивается. В области более высоких концентраций зависи мость активности ферментов от концентрации ио нов магния выглядит следующим образом: у TspRK и TthPRPPS1 активность снижается, у TthAPRT повышается, в случае TthPRPPS2 - резко повыша ется. Таким образом, каскадные реакции с участием TthPRPPS1 целесообразно проводить при концен трации хлорида магния 0.25-0.5 мМ, а с участием TthPRPPS2 - при 5 мМ. Ферменты по-разному реагируют на добавление ортофосфата калия. Активность TspRK снижается, TthAPRT - практически не меняется, у обеих TthPRPPS существенно повышается, причем в слу чае TthPRPPS2 она начинает падать при концен трации свыше 25 мМ. Оптимальная концентрация для проведения каскадных реакций составляет 10- 25 мМ. Наиболее критичным оставался вопрос о субстрат ной специфичности каждого фермента по отношению к различным углеводам. D-рибоза и 2-дезокси-D-рибоза являются суб стратами TspRK (рис. 5), при этом активность по де зоксисахару составляет 57% от активности в отноше нии D-рибозы. Активность в отношении D-арабинозы и D-ксилозы превышает фоновую в 2 раза, что может указывать на их использование в качестве субстра тов, но значительно менее специфичных. Активность в отношении D-глюкозы и D-ликсозы не обнаружена. Проверена активность обеих TthPRPPS в отно шении 2’-дезокси-ATP, -GTP и 2’-дезокси-GTP. Активность при использовании 2’-дезокси-ATP со ставила 80% от активности с ATP. Активность в от ношении GTP и 2’-дезокси-GTP не обнаружена (дан ные не приведены). Можно предположить, что эти TthPRPPS относятся к ферментам первого типа [31]. Все реакции проводили в тех же условиях, в которых определяли активность, менялся лишь добавляемый субстрат. Оба фермента способны катализировать ре акцию с D-арабинозо-5-фосфатом (рис. 6). При этом активность в отношении 2-дезокси-D-рибозо-5 фосфата не обнаружена, что говорит о важности ги дроксильной группы по второму положению углевода для осуществления ферментативной реакции. С целью определения возможности использования различных гетероциклических оснований для син теза нуклеотидов проведено несколько реакций. Данные по синтезу нуклеотидов с помощью TthAPRT приведены в табл. 3. Из приведенных в табл. 3 данных очевидно, что TthAPRT специфична в отношении 6-аминопури нов. Хорошими субстратами оказались 2-хлораденин, N1-метиладенин, 2-метоксиаденин. Не обнаружено ферментативной активности в реакциях с гипок сантином, гуанином, N6-бензиладенином, амино бензимидазолом и 1,2,4-триазол-3-карбокси- N-метиламидом. В реакциях с 2-хлораденином равновесие оказалось сильно смещено в сторону об разования нуклеотида (98% через 1 сут). Реакцию проводили при 75°C, что в случае 2-хлораденина предпочтительней, ввиду его плохой растворимо сти. 2,6-Диаминопурин также оказался субстратом, в то время как в реакции с его 7-дезазааналогом об разования продукта не наблюдалось, что говорит о необходимости атома азота в седьмом положении пурина. После определения субстратной специфичности TthAPRT осуществлен каскадный синтез 2Cl-AMP и 2F-AMP из соответствующих гетероциклических оснований и D-рибозы. Результаты представлены на рис. 7. Процесс каскадного синтеза нуклеотидов контролировали с помощью хроматомасс-спектро метрического анализа реакционной смеси, пробы от бирали через 1, 2, 24 ч от начала процесса. На рис. 8 приведены масс-спектры целевых продуктов. Таким образом, на примере получения 2-хлор( фтор)-аденозинмонофосфата (2Cl-AMP и 2F-AMP) показана возможность использования системы тер мофильных ферментов для получения биологически активных нуклеотидов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные результаты свидетельствуют о возмож ности использования полиферментативного каскада термофильных ферментов нуклеинового обмена - рибокиназы, фосфорибозилпирофосфатсинтетазы и аденин-фосфорибозилтрансферазы для получе нии модифицированных нуклеотидов. Применение данного подхода создает предпосылки для замены химических методов получения нуклеотидов биока талитическими.

Об авторах

Р. С. Есипов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: esipov@mx.ibch.ru
Россия

Ю. A. Абрамчик

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: esipov@mx.ibch.ru
Россия

И. В. Фатеев

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: esipov@mx.ibch.ru
Россия

И. Д. Константинова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: esipov@mx.ibch.ru
Россия

M. A. Костромина

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: esipov@mx.ibch.ru
Россия

T. И. Муравьева

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: esipov@mx.ibch.ru
Россия

K. Г. Артемова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: esipov@mx.ibch.ru
Россия

A. И. Мирошников

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: esipov@mx.ibch.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы