Биосинтез сополимера поли-3-оксибутират-со-3-окси-4-метилвалерата штаммом Azotobacter chroococcum 7Б

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В связи с интенсивным развитием таких биомеди цинских направлений, как регенеративная медици на, биоинженерия (в том числе тканевая инженерия), биофармацевтика, нанобиотехнология, возрастает потребность в создании новых биоматериалов, осо бенно биосовместимых и биоразлагаемых полимеров. В качестве материалов для изготовления медицин ских изделий и лекарственных форм используют целый ряд природных и синтетических полимеров: полиоксиалканоаты (ПОА), полиангидриды, поли алкилцианоакрилаты, полифосфазены, полифосфо эфиры, полиортоэфиры, некоторые полисахариды (хитозан, гиалуроновая кислота, агароза, декстран, альгинаты, хондроитинсульфат) и белки (коллаген, фибрин, фиброин щелка, спидроин, желатин) [1-5]. Эти полимеры применяются в медицинских имплан татах при восстановительной хирургии [4, 5], тка невой инженерии [3, 6, 7], для создания новых ле карственных форм в биофармацевтике [8, 9], новых материалов для стоматологии и в других приложе ниях [1, 2]. Несмотря на широкий ассортимент используемых в медицине полимеров, подавляющее большинство из них получают химическим синтезом или выделяют из природного сырья (водорослей, высших растений, грибов, ракообразных, тканей домашних животных). К сожалению, методы химического синтеза и выделе ния полимеров из природного сырья не могут в полной мере обеспечить набор свойств, необходимый для по лимеров биомедицинского назначения. Требуется глубокая и очень дорогая очистка получаемых по лимеров, которые должны иметь заданную в узких рамках химическую структуру и свойства, а также быть биобезопасными и т.п. Кроме того, синтетические полимеры и продукты их биодеградации могут быть токсичными, а природные полимеры могут обладать выраженной иммуногенностью или быть загрязнены вирусами или прионными белками [10, 11]. Среди разрабатываемых и используемых биоме дицинских полимеров особое внимание привлекают биоразлагаемые поли-3-оксиалканоаты - поли-3 оксибутират (ПОБ) и его сополимеры (согласно отечественной химической номенклатуре высокомо лекулярных соединений и ИЮПАК [12]). В отличие от природных полимеров (хитозана, альгината, дек страна, коллагена и др.) и химически синтезируемых полимеров, ПОА получают биотехнологическим пу тем, что позволяет добиваться высокой степени чи стоты, контролировать и задавать в узких пределах основные физико-химические свойства биополиме ров в процессе их биосинтеза. ПОА обладают набором уникальных свойств: высокой механической прочно стью и термопластичностью, что обеспечивает про стоту переработки и позволяет получать широкий спектр изделий, способностью к образованию ком позитов с синтетическими полимерами, неорганиче скими материалами и лекарственными веществами, а также к полному биоразложению с образованием нетоксичных продуктов, биосовместимостью (в том числе гемосовместимостью) с тканями и органами че ловека и животных и экологической безопасностью. В связи с этим ПОА считаются перспективными для применения в медицине [13-16]. ПОА обладают также уникальной нанострукту рой. Будучи частично кристаллическими, ПОА могут формировать различные супрамолекулярные струк туры, такие, как ламеллы и сферолиты. Подобная частично кристаллическая структура и морфология во многом определяют биологические свойства ПОА, например кинетику биодеградации [17, 18]. Однако ПОА, как и другие полимерные материалы, в частности гомополимер ПОБ, может обладать и не которыми недостатками: высокой гидрофобностью и кристалличностью, длительной биодеградацией и низкой пластичностью, что в ряде случаев серьезно ограничивает их применение в качестве биоинженер ных материалов в медицине, например для изготов ления протезов сосудов [19, 20]. В связи с этим разра ботка новых биотехнологических методов получения новых сополимеров ПОБ биомедицинского назначе ния с оптимальным сочетанием физико-химических и биологических свойств и биоматериалов на их осно ве считается наиболее перспективным направлением в современной биоинженерии [1, 2, 13-16]. Ранее мы показали возможность биосинтеза раз личных сополимеров ПОБ в высокоэффективном штамме-продуценте ПОА Azotobacter chroococcum 7Б с использованием различных методических под ходов, провели комплексное исследование физико химических и биологических свойств полученных полимеров. Этот штамм характеризуется непри хотливостью к условиям культивирования и биотех нологического процесса (необходимо только самое базовое оборудование, не требуются высокоспеци фичные культуральные среды, газовое питание, высокоточный контроль специальных параметров и т.п.), высокой продуктивностью (высокий выход биомассы, содержание полимера и сухой биомассы в клетках до 80% и выше), высокой молекулярной массой синтезируемого полимера (более 1.5 × 106 Да). Такие характеристики крайне важны для биотехно логической продукции полимеров биомедицинского назначения в связи с необходимостью технически простой и глубокой очистки, помимо обеспечения их эффективной наработки [15, 21]. Однако у таких продуцентов имеются ограничения в синтезе сопо лимеров ПОБ, содержащих мономеры 3-оксикарбо новых кислот с длиной более пяти атомов углерода [22, 23]. Биосинтез нового сополимера ПОБ, поли- 3-оксибутират-со-3-окси-4-метилвалерата, пока зан с использованием таких бактериальных про дуцентов, как Ralstonia eutropha, Burkholderia sp., Chromobacterium sp., способных к биосинтезу ПОА с короткоцепочечными и длинноцепочечными моно мерами карбоновых кислот [24-27]. Однако химиче ская структура этого сополимера (мономер 3-окси-4 метилвалерат имеет Y-образную R-группу) особенно интересна для изучения его биосинтеза именно таки ми бактериальными продуцентами, как Azotobacter sp., из-за указанных ограничений. Возможность биосинтеза новых сополиме ров ПОБ такими бактериальными продуцентами, как Azotobacter sp., представляет большой научный и практический интерес. Нами изучена возмож ность биосинтеза нового сополимера ПОБ - поли- 3-оксибутират-со-3-окси-4-метилвалерат - вы сокоэффективным штаммом-продуцентом ПОА A. chroococcum 7Б, определены физико-химические свойства этого сополимера и его биосовместимость in vitro. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Реактивы Натриевая соль валериановой кислоты, или вале рат натрия (ВК), натриевая соль 4-метилвалериа новой кислоты, или метилвалерат натрия (4МВК), натриевая соль гексановой кислоты, или гексано ат натрия (ГК); компоненты культуральной среды: K2HPO4·3H2O, МgSO4·7H2O, NaCl, Na2MoO4·2H2O, CaCO3, FeSO4·7H2O, цитрат натрия, CaCl2, KH2PO4, сахароза, агар, фосфатно-солевой буфер (ФСБ). Все реактивы закуплены в компании Sigma Aldrich (Германия) и использованы в том виде, в котором по лучены. Биосинтез полимеров Для биосинтеза полимеров использован высокоэф фективный штамм-продуцент ПОБ A. chroococcum 7Б, несимбиотическая азотфиксирующая бакте рия, способная к сверхпродукции полимера (до 80% от сухого веса клеток) [28-31]. Штамм был выделен из ризосферы пшеницы (дерново-подзолистая по чва) и поддерживался на среде Эшби, содержащей 0.2 г/л K2HPO4·3H2O, 0.2 г/л МgSO4·7H2O, 0.2 г/л NaCl, 0.006 г/л Na2MoO4·2H2O, 5.0 г/л CaCO3, 20 г/л саха розы и 20 г/л агара. Все эксперименты проведены в лабораторных условиях. Для достижения высокой продуктивности клеток культуру Azotobacter выра щивали в качалочных колбах в микробиологической качалке Innova 43 (New Brunswick Scientific, США) при постоянном перемешивании и 30°C на среде Берка в условиях избыточного содержания источни ка углерода в среде, содержащей 0.4 г/л МgSO4·7H2O, 0.01 г/л FeSO4·7H2O, 0.006 г/л Na2MoO4·2H2O, 0.5 г/л цитрата натрия, 0.1 г/л CaCl2, 1.05 г/л K2HPO4·3H2O, 0.2 г/л KH2PO4 и 17 г/л (50 мМ) сахарозы как основ ного источника углерода. Объем среды в колбе со ставлял 100 мл, что при высокой продуктивности штамма A. chroococcum 7Б при отборе проб в конце эксперимента позволяет анализировать процессы биосинтеза и иметь достаточное количество проб для статистической обработки (каждый эксперимент проведен в восьмикратной повторности). Для био синтеза сополимеров ПОБ в культуральную среду добавляли соли карбоновых кислот (пропионовой, валериановой, 4-метилвалериановой, гексановой) в качестве дополнительных источников углерода. В качестве предшественника мономера 3-оксивале рата в составе ПОА в культуральную среду добав ляли ВК в концентрации 5 и 20 мМ сразу и через 12 ч культивирования штамма-продуцента. Эти концен трации и временные интервалы выбраны для полу чения сополимера ПОБВ с различным содержанием 3-оксивалерата в цепи получаемого сополимера [28, 29]. В качестве потенциальных предшественников мо номеров 3-окси-4-метилвалерата и 3-оксигексаноата в составе синтезируемого ПОА в культуральную сре ду добавляли 4МВК и ГК в концентрации 5, 10, 20 и 35 мМ через 12 ч культивирования штамма-продуцента и в концентрации 20 мМ через 0 ч. Такие концентра ции этой карбоновой кислоты выбраны по аналогии с другими карбоновыми кислотами, используемыми для биосинтеза новых сополимеров ПОБ и согласно [24-27, 29]. Штамм-продуцент культивировали в те чение 72 ч. Оптическую плотность культуральной среды контролировали при помощи нефелометрии. Рост и накопление полимера контролировали также при помощи световой микроскопии с использованием микроскопа Биомед-1 («Биомед», РФ) с цифровой ка мерой. Параметры биосинтеза сополимеров: урожай биомассы (г/л среды) и общее содержание полиме ра в клетках (вес. % от сухого веса клеток) (табл. 1) измеряли согласно ранее разработанным методикам. Процесс выделения и очистки полимера из биомассы штамма-продуцента включал экстракцию хлорофор мом, фильтрование, осаждение изопропиловым спир том, очистку путем нескольких циклов растворения осаждения и высушивание [28-31]. Исследование химического состава полимера методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) Спектры 1H ЯМР 1% (вес/об.) растворов полиме ров в дейтерированном хлороформе были сня ты на спектрометре MSL-300 300 МГц (Bruker, Германия) с экспериментальными параметрами: температура 313 K, релаксационная задержка 2.5 с, ширина спектрального окна 4000 Гц, и на спек трометре Bruker Avance III 500 МГц с трехканаль ным криодатчиком TCI Prodigy (Bruker, Германия) с экспериментальными параметрами: температура 310 К, релаксационная задержка 3.3 с, ширина спек трального окна 10000 Гц. Химические сдвиги (в мил лионных долях) выставлены по сигналу остаточных протонов CDCl3 (7.24 м.д. по ТМС). Процентное со держание мономеров 3-оксивалерата (3ОВ) в со полимере ПОБВ рассчитывали по соотношению интегральных интенсивностей сигнала метильной группы гидроксивалерата (0.89 м.д.) и суммарных сигналов метильной группы гидроксивалерата (0.89 м.д.) и метильной группы гидроксибутирата (1.27 м.д.) [29, 31]. Процентное содержание мономеров 3-окси-4-метилвалерата (3О4МВ) в сополимере ПОБ4МВ рассчитывали по соотношению суммы ин тегральных интенсивностей сигналов 4-метильной группы (g) (0.90 м.д.) и -CH (f) (1.91 м.д.) и суммы интегральных интенсивностей сигналов 4-метиль ной и -CH-групп остатка 3-окси-4-метилвалерата и метильной группы остатков 3-оксибутирата (1.27 м.д.) (рис. 2). Определение молекулярной массы полимеров Молекулярную массу (ММ) полимеров определя ли методом гель-фильтрационной хроматографии (ГФХ). Данные, полученные методом ГФХ, были со отнесены с вискозиметрическими данными [28-31]. Получение экспериментальных образцов полимерных пленок С целью изучения физико-химических свойств и ро ста клеток in vitro на полимерных пленках получе ны экспериментальные образцы полимерных пленок толщиной 40 мкм и диаметром 30 мм. Для изготовле ния образцов использовали синтезированные в бак териях полимеры: ПОБ, ПОБВ1 (2.5 мол. % 3ОВ), ПОБВ2 (7.8 мол. % 3ОВ) и ПОБ4МВ, характеристики которых приведены в табл. 2. Полимерные пленки готовили из 2% (вес/об.) растворов соответствующих полимеров в хлороформе путем испарения раство рителя на стеклянной подложке. Вес пленок изме рен с помощью весов AL-64 (Max = 60 г, d = 0.1 мг, Acculab, США) и составил 61 ± 8 мг. Толщина пле нок, измеренная магнитным толщинометром, со ставила 38 ± 6 мкм. Для работ с культурами клеток пленки стерилизовали автоклавированием, их пред варительно инкубировали в дистиллированной воде при 37°С в термостате (ЕС 1/80 СПУ, РФ) в течение 2 ч [30, 31]. Дифференциальная сканирующая калориметрия Теплофизические характеристики полимерных пле нок (температуры плавления и кристаллизации, те плоты плавления и кристаллизации) измеряли с по мощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии согласно [32, 33]. Температуру начала и максимума пика плавления или кристаллизации обозначали как Тпл. 0, Тпл. пик и Ткр. пик соответственно. Кристалличность ПОА (Xc) рассчитывали согласно [33]: Xc = ΔHm(ПОА)/ΔH0 m(ПОБ) × 100%, где ΔH0 m(ПОБ) - теоретическое значение термо динамической энтальпии плавления, которая у 100% кристаллического ПОБ могла составить 146.6 Дж/г [34], а ΔHm(ПОА) - экспериментальная энтальпия плавления соответствующего образца ПОА. Расчеты степени кристалличности образцов и температуры плавления произведены для данных, полученных на втором цикле нагрева полимеров, температура кристаллизации - на основании данных, полученных на первом цикле охлаждения. Данные представлены как средние значения из трех измерений. Измерение контактного угла смачивания Гидрофильность поверхности полимерных пленок оценивали, измеряя контактный угол смачивания, формирующийся между каплей воды и поверх ностью полимерной пленки, с помощью цифрово го угломера - системы анализа формы капли Drop Shape Analysis System - DSA100 (KRÜSS, GmbH, Германия) согласно [30, 31]. Исследование роста стромальных клеток на полимерных пленках Стромальные клетки (СК) выделяли из костного моз га бедренных костей 3-дневных крыс линии Вистар по стандартной методике [35]. Животных забивали декапитацией, выделяли бедренные кости, отреза ли эпифизы, костный мозг вымывали из диафизов с помощью шприца (2 мм, игла 27G). Полученную су спензию инкубировали в среде DMEM с коллагена зой типа 1 (1075 ед/мл) («ПанЭко», Россия) в течение 1 ч при 37°С, центрифугировали (10 мин, 100 об/мин), осадок высаживали на культуральный пластик. На следующий день меняли ростовую среду и далее культивировали до появления первичной монослой ной культуры. Жизнеспособность клеток оценивали с исполь зованием теста XTT - аналога широко применя емого теста MTT [30, 31, 36]. Этот тест, основанный на превращении неокрашенной соли тетразолия в окрашенные соединения формазана под действием NADPH-зависимых оксидоредуктаз, позволяет оце нить активность митохондриальных дегидрогеназ. Использовали набор для ХТТ (XTT Cell Proliferation Kit, Biological Industries, Израиль). Задачей нашей работы была не проверка цитоток сичности, а выявление пролиферации клеток на ма триксах, т.е. биосовместимости полимерных пленок. Клетки поддерживали в среде DMEM (Dubecco’s Modified Eagle Medium, «ПанЭко», Россия), содер жащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biological Industries, Израиль), 100 МЕ/мл пени циллина и 100 мкг/мл стрептомицина («ПанЭко»), при 37°C в атмосфере с 5% CO2. Среду меняли каж дые 3 дня. Стерильные образцы пленок ПОБ, ПОБВ1 и ПОБ4МВ (стерилизация автоклавированием) (n = 6) помещали в лунки 96-луночного планшета, клеточную суспензию наносили сверху из расчета 1500 клеток на образец. Использовали клетки вто рого пассажа, так как пролиферация клеток перво го пассажа была не вполне стабильной, в повторных экспериментах наблюдались значительные разли чия в росте клеток первого пассажа на полимерных пленках. Мы определяли жизнеспособность клеток, культивируемых на полимерных пленках, на 1, 3, 7 сут, так как важно было оценить данный параметр в динамике. Установлено, что рост клеток стабилен в этом временном промежутке, а данные точки наи более полно описывают динамику роста СК на плен ках. После заданного времени культивирования уда ляли среду из лунок, вносили 100 мкл свежей среды в новые чистые лунки и переносили туда наши об разцы. Это делалось для того, чтобы учитывать толь ко клетки, прикрепленные к полимерной подложке, и не учитывать клетки, которые могли открепиться от подложки и прикрепиться к полимерному план шету. Затем добавляли 50 мкл свежеприготовлен ного раствора ХТТ (по методике). По прошествии 4 ч инкубации при 37°С при плавном покачивании вынимали образцы и измеряли оптическую плот ность на приборе Zenyth 3100 Microplate Multimode Detector (Anthos Labtec Instruments GmbH, Австрия) при 450 нм против 690 нм [30, 31]. Статистический анализ Статистическую обработку параметров биосинтеза полимеров, контактного угла смачивания полимеров и их биосовместимости in vitro на культуре клеток проводили с использованием программного паке та SPSS/PC+ Statistics™ 12.1 (SPSS). Использовали однофакторный дисперсионный анализ (One-way ANOVA). В таблицах и на рисунках данные пред ставлены в виде средних величин и стандартной ошибки среднего (М ± SD) при уровне значимости p < 0.05, в подписях к рисункам и в примечании к та блицам указано число измерений (n). Представлены средние значения физико-химических свойств по лимеров, вычисленные из трех измерений. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Биосинтез сополимеров П3ОБ с использованием дополнительных источников углерода Результаты изучения биосинтеза сополимеров ПОБ штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б при до бавлении различных дополнительных источников углерода (солей пропионой, валериановой и 4-ме тилвалериановой и гексановой кислот) в культу ральную среду приведены в табл. 1. Результаты изучения биосинтеза сополимера ПОБВ подтверж дают полученные ранее данные: мономеры 3-ок сивалерата включаются в цепь сополимера ПОБВ при добавлении валериановой и пропионовой кислот в качестве дополнительных источников углерода, тогда как в присутствии более длинноцепочечной гексановой кислоты синтеза сополимеров не проис ходило. Причем молярное содержание 3ОВ в син тезируемом сополимере прямо зависит от концен трации ВК, добавляемой в культуральную среду. Молекулярная масса сополимера ПОБВ была ниже, чем у гополимера ПОБ, что, вероятно, связано с инги бирующим действием валерата на синтез полимера. Если же сахароза служит единственным источником углерода, то штамм-продуцент синтезирует высоко молекулярный ПОБ (1710 кДа) [29, 37-39]. С целью улучшения параметров биосинтеза по лимеров используют различные дополнительные источники углерода. Показано, что дополнительные источники углерода не только влияют на молекуляр ную массу синтезируемых полимеров, но и приво дят к синтезу сополимеров с новыми и модифициро ванными физико-химическими и биомедицинскими свойствами [29-31, 40-46]. Используя этот метод, показали возмож ность биосинтеза нового для штамма-продуцента A. chroococcum 7Б сополимера ПОБ4МВ путем до бавления в культуральную среду 4МВК в каче стве дополнительного источника углерода и пред шественника мономера 3О4МВ в цепи сополимера. Вхождение остатков 3О4МВ в состав синтезиро ванного полимера ПОБ4МВ подтверждено также данными спектроскопии ЯМР 1H. На спектре ЯМР 1H 4-метильная группа (е) и -CH-группа (ж) моно мера 3О4МВ представлены пиками 1.91 и 0.90 м.д. соответственно (рис. 2), тогда как у гомополимера ПОБ и сополимера ПОБВ в этой области нет сиг налов. Мы предполагаем, что полученный сопо лимер, как и ПОБВ, является мультиблок-сополи мером, и его синтез осуществляется по следующей схеме: 4МВК → 4-метилвалерил-КоА → 3-кето-4-метилвалерил-КоА→ D-3-окси-4-метилвалерил-КоА → 3О4МВ в составе ПОБ4МВ, т.е. подобно биосинтезу ПОБВ: ВК → валерил-КоА → 3-кетовалерил-КоА → D-3-гидроксивалерил-КоА → 3ОВ в составе ПОБВ [29, 37-39] (рис. 1). Максимальное вхождение мономеров 3О4МВ в со став синтезированного полимера ПОБ4МВ состав ляло 0.6 мол. % при добавлении в культуральную среду 4МВК в концентрации 20 мМ в качестве до полнительного источника углерода, при других кон центрациях карбоновой кислоты-предшественника вхождение мономеров было гораздо ниже. Тем не ме нее подтвержден сам факт синтеза этого сополимера. Кодируемая геном phbC ПОБ-синтаза являет ся полимеразой короткоцепочечных карбоновых кислот, таких, как 3-гидроксибутират и 3-гидрок сивалерат. Эта полимераза не способна использо вать для синтеза ПОА средне- и длинноцепочечные 3-гидроксикарбоновые кислоты, а именно кислоты, длиннее 3-гидроксивалериановой кислоты (5С 3-ги дроксикарбоновая кислота), т.е. 3-гидроксигекса новую и 3-гидроксигептановую кислоты этот фер мент не может инкорпорировать в состав растущей цепи ПОА [22, 23]. Тем не менее в качестве добав ки мы использовали ГК, которая как изомер 4МВК может служить контролем, поскольку известно, что присутствие ГК не приводит к синтезу сополи мера ПОБ клетками A. chroococcum. Однако влия ние ГК на сам процесс биосинтеза необходимо было проконтролировать. Полученные нами данные под тверждают ограничения по длине используемых мономеров для ПОБ-синтазы, что, по-видимому, связано со строгой специфичностью этого фер мента по отношению к субстратам, используемым для синтеза полимера. Включение остатков 3-окси-4 метилвалерата лишь подтверждает это ограничение, так как несмотря на то, что 3-окси-4-метилвалерат является остатком 6С 3-гидроксикарбоновой кисло ты, его боковая группа имеет вилкообразную форму, что не приводит к увеличению длины боковой цепи. А вот линейная молекула - 3-оксигексановая кисло та (6С линейная 3-оксикарбоновая кислота) не может быть включена ферментом в состав растущей цепи полиэфира по тем же причинам. Интересно, что добавление в культуральную среду ВК и 4МВК вызывает небольшое снижение молеку лярной массы синтезируемого полимера, что можно объяснить ингибирующим действием карбоновых кислот на процесс биосинтеза ПОА (табл. 1). Однако если добавить 4МВК в культуральную среду не че рез 12 ч, а сразу же, то будет наблюдаться не только значительное снижение молекулярной массы поли мера, но, прежде всего, практически не будет син тезироваться собственно сам сополимер ПОБ4МВ. Аналогичный эффект наблюдается и при начальном добавлении ВК в культуральную среду, но в этом случае синтезируется сополимер ПОБВ с гораздо меньшим содержанием мономеров 3ОВ. Снижение молекулярной массы происходит и при добавлении в культуральную среду ГК, хотя сополимер при этом не синтезируется. Это также может быть связа но с ингибирующим действием карбоновых кислот на ПОБ-синтазу, которое на ранних стадиях био синтеза полимера приводит к снижению включения молекул-предшественников в растущую цепь сопо лимера, хотя теоретически, напротив, должно приво дить к синтезу сополимеров с большим содержанием 3ОВ и 3О4МВ. Влияние карбоновых кислот на биосинтез поли меров подтверждают результаты изучения роста культуры A. chroococcum 7Б. Полученные резуль таты свидетельствуют о том, что добавление в среду карбоновых кислот приводит к заметному подавле нию роста клеток, снижению содержания полимера и, как следствие, продукции полимера, причем сте пень такого ингибирующего влияния на рост клеток зависит от химической природы добавки [29]. Так, несмотря на то, что при использовании ГК в качестве дополнительного источника углерода, сополимер не синтезируется, ГК значительно подавляет рост клеток и продукцию полимера (табл. 1). Несмотря на некоторое снижение параметров био синтеза ПОБ4МВ, следует отметить высокую про дуктивность (урожай биомассы - 3.4 г/л; содержание сополимера - 76.7%) штамма-продуцента и высо кую молекулярную массу сополимера (1.3 × 106). Биосинтез ПОБ4МВ был показан ранее с исполь зованием различных продуцентов: R. eutropha, Burkholderia sp., Chromobacterium sp., однако, со держание полимера в клетках штаммов-продуцен тов редко превышал 50%, а сам биотехнологический процесс требовал высокоспецифичных технических условий, что может существенно ограничивать ис пользование этих методик для продукции новых полимеров биомедицинского назначения. Вероятно, в связи с подобными препятствиями биосовмести мость синтезированных по разработанным методи кам сополимеров не тестировали [24-27]. Поэтому ис пользование высокопродуктивных и неприхотливых к условиям культивирования штаммов-продуцентов для получения новых сополимеров, таких, как A. chroococcum 7Б [15, 29-31], представляется особенно важным. Добавление в культуральную среду карбоновых кислот также вызывает изменение морфологии бак териальных клеток (рис. 3). A. chroococcum харак теризуется высокой склонностью к плеоморфизму клеток, чем и может быть объяснен этот эффект. Так, если при добавлении валериановой кислоты в низ ких концентрациях (5 мМ) морфология клеток поч ти не изменялась, то добавление ВК в относительно высоких концентрациях (20 мМ) приводило к выра женному изменению клеточной морфологии - кок коидные клетки трансформировались в бациллярные формы (рис. 3Б). Добавление 20 мМ ГК приводило даже к возникновению нитеобразных клеток, хотя коккоидные и бациллярные формы также присут ствовали (рис. 3В). Такое влияние карбоновых кис лот на морфологию бактериальных клеток сходно с хорошо известным эффектом различных стресс индуцирующих веществ (кислот, щелочей, пептона) на форму клеток [47, 48]. Исследование физико-химических свойств полимеров Изучение физико-химических свойств полиме ров, синтезируемых штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, выявило значительное отличие фи зико-термических свойств и гидрофильности сопо лимеров ПОБ - ПОБВ1 (2.5 мол. % 3ОВ), ПОБВ2 (7.8 мол. % 3ОВ) и ПОБ4МВ от гомополимера ПОБ, несмо тря на низкое молярное содержание 3ОВ и 3О4МВ в сополимерах ПОБВ1 и ПОБ4МВ соответственно (табл. 2). На рис. 4 представлены термограммы ДСК со полимеров ПОБВ и ПОБ4МВ в сравнении с ПОБ. Термограмма плавления полимеров содержит вы раженные пики плавления полукристаллических полимеров и их кристаллизации. Пики плавления сополимеров ПОБВ и ПОБ4МВ в сравнении с гомо полимером ПОБ характеризовались: - незначительным изменением пика плавления, что свидетельствует об отсутствии значительного из менения температуры плавления сополимеров; - смещением пика кристаллизации ПОБ4МВ в об ласть более высоких температур, что свидетельству ет об увеличении температуры кристаллизации этого сополимера; - уменьшением площади пика плавления, что сви детельствует об уменьшении энтальпии плавления и соответственно кристалличности сополимеров. Расчет физико-термических параметров, полу ченных из анализа данных ДСК-термограмм, при веден в табл. 2. Из табл. 2 следует, что сополиме ры как ПОБВ, так и ПОБ4МВ обладают значительно меньшей степенью кристалличности, чем ПОБ (на 21.9 и 25.1% соответственно), причем у нового сопо лимера ПОБ4МВ степень падения кристаллично сти даже выше, чем у сополимера ПОБВ1, несмотря на то, что молярное содержание 3О4МВ в ПОБ4МВ составляет всего 0.6 против 2.5% 3ОВ в сополимере ПОБВ, и сравнима со степенью кристалличности сополимера ПОБВ2, у которого молярное содержа ние 3ОВ составляет 7.8%. Частично такое падение кристалличности сополимеров может быть связано с более низкой их молекулярной массой (на более 300 кДа по сравнению с ПОБ). Сами показатели кри сталличности (рассчитанные по первому и второму циклам прогрева полимерных образцов, табл. 2) со ответствуют опубликованным данным [49]. Показано, что уменьшение молекулярной массы полимеров мо жет приводить к довольно значительному (до 10% и более при уменьшении ММ в 2 раза) падению сте пени их кристалличности [49]. Однако основной вклад в падение степени кристалличности вносят мономе ры (3ОВ и 3О4МВ) в сополимерах с более длинной бо ковой группой, чем у 3ОБ. Это подтверждает данные о том, что введение мономеров 3ОВ в полимерную цепь ПОБ приводит к получению сополимера с изме ненными физико-химическими свойствами: с более низкой температурой плавления, с меньшей кристал личностью, более пластичного, менее прочного и об ладающего большей скоростью биодеградации [22, 32], причем кристалличность сополимера ПОБВ зна чительно падает при увеличении молярного содер жания мономеров 3ОВ в составе его цепи [32]. Однако в случае ПОБ4МВ мы наблюдаем гораздо более вы раженный эффект: по своим физико-химическим свойствам сополимер ПОБ4МВ с молярным содер жанием 3О4МВ всего 0.6% соответствует сополиме ру ПОБВ с молярным содержанием от 2.5 до 7.8%. Аналогичную картину мы наблюдаем при анализе гидрофильности полимеров. Если контактный угол смачивания (как показатель гидрофильности поверх ности полимеров) гомополимера ПОБ и его сополимера ПОБВ1 не различались, то у сополимеров ПОБВ2 и ПОБ4МВ этот показатель был значительно выше, но при этом контактный угол смачивания у ПОБ4МВ был лишь незначительно ниже ПОБВ2. Ранее пока зали, что контактный угол смачивания сополимера ПОБВ возрастает при увеличении в нем молярного содержания мономеров 3ОВ, а гидрофильность по лимерной пленки падает из-за увеличения концен трации гидрофобных групп на ее поверхности [50]. Таким образом, по данным анализа гидрофильно сти полимеров сополимер ПОБ4МВ с содержанием 3О4МВ всего 0.6% соответствует сополимеру ПОБВ с молярным содержанием от 2.5 до 7.8%. Это может быть связано с гораздо более выраженным дестаби лизирующим влиянием вилкообразной боковой груп пы остатков 3О4МВ на кристаллическую структуру полимера по сравнению с эффектом линейной груп пы 3ОВ в сополимере ПОБВ (рис. 1), что и объясняет столь непропорционально большой вклад столь низ кого содержания 3О4МВ в изменение физико-хими ческих свойств полимера. Исследование роста стромальных клеток на пленках из полимеров Изучение биосовместимости in vitro полиме ров, полученных путем биосинтеза в клетках A. chroococcum 7Б с использованием культуры вы деленных из костного мозга стромальных клеток, вы явило значительное увеличение количества жизне способных СК на пленках из трех полимеров: ПОБ, ПОБВ1 (2.5 мол. % 3ОВ) и ПОБ4МВ в течение 5 сут. (рис. 5). Не наблюдали статистических различий в пролиферации клеток на пленках из различных по лимеров. Таким образом, новый сополимер ПОБ4МВ можно использовать для биомедицинских разрабо ток и исследований наряду с его аналогами - ПОБ и ПОБВ, в частности, для изготовления матриксов, применяемых в инженерии костной ткани [51, 52]. ВЫВОДЫ Нами показано, что добавление 4-метилвалериано вой кислоты в культуральную среду штамма-проду цента A. chroococcum 7Б приводит к включению в по лимерную цепь ПОБ мономеров 6С-оксикарбоновой кислоты - 3-окси-4-метилвалерата, и синтезу сополимера поли-3-оксибутират-со-3-окси-4 метилвалерат. Несмотря на малое молярное содер жание 3О4МВ в составе полученного сополимера, по своим физико-химическим свойствам ПОБ4МВ, содержащий всего 0.6% 3О4МВ, соответствовал со полимеру ПОБВ с молярным содержанием от 2.5 до 7.8% 3О4МВ. Рост СК, определенный по тесту ХТТ, на сополимере ПОБ4МВ in vitro не отличался статистически значимо от их роста на ПОБ и ПОБВ, что позволяет использовать его в биомедицинских разработках и исследованиях.

Об авторах

A. П. Бонарцев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

Г. A. Бонарцева

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

В. Л. Мышкина

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

В. В. Воинова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

T. K. Махина

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

И. И. Жаркова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

С. Г. Яковлев

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

A. Л. Зернов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

E. В. Иванова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

E. A. Акулина

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

E. С. Кузнецова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

В. A. Жуйков

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

С. Г. Алексеева

ОАО «Институт пластмасс»

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

В. В. Подгорский

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

И. В. Бессонов

Московский государственный технический университет им. Н.Э. Баумана

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

M. Н. Копицына

Московский государственный технический университет им. Н.Э. Баумана

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

A. С. Морозов

Московский государственный технический университет им. Н.Э. Баумана

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

E. Ю. Милановский

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

З. Н. Тюгай

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

Г. С. Быкова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

M. П. Кирпичников

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

K. В. Шайтан

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ant_bonar@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы