Дизайн стабильных α-спиральных пептидов и термостабильных белков в биотехнологии и биомедицине

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Многочисленные исследования α-спиральных пеп тидов, проведенные за последние четверть века, не только способствовали лучшему пониманию сво рачивания белка в нативную, биологически актив ную конформацию, но и представляют значительный интерес для разработки лекарственных препаратов, эффективных при заболеваниях, связанных с на рушениями межбелковых взаимодействий [1-3]. С начала 1990-х годов собран большой объем экспе риментальных данных по сворачиванию и стабиль ности α-спиралей в мономерных пептидах [4, 5]. Эти данные показывают, что аминокислотные последо вательности α-спиралей, как правило, не оптимизи рованы для обеспечения высокой конформационной стабильности. Это может быть важным фактором в предотвращении накопления ошибочных интерме диатов сворачивания глобулярных белков. Поэтому конструирование коротких α-спиральных пептидов и белков с достаточной конформационной стабиль ностью при заданных условиях среды (температуры, рН и ионной силы) по-прежнему остается интересной и практически важной проблемой белковой инжене рии [1, 6]. Огромный объем экспериментальных данных по физическим взаимодействиям, которые влияют на стабильность α-спиралей в белках и мономер ных пептидах, позволяет создать теоретические мо дели, описывающие переходы α-спираль-клубок, и разработать на этой основе новые высокоэффективные вычислительные методы конструирования α-спиральных пептидов с высокой конформационной стабильностью. Стабилизацию α-спиралей неоднократно исполь зовали для конструирования промышленно важных ферментов, способных работать при повышенных температурах [7, 8]. В представленной работе обсуж даются также различные способы повышения термо стабильности глобулярных белков, включая такие молекулярные механизмы, как изменения аминокис лотного состава белков термофильных организмов, введение дополнительных ионных пар и водородных связей, использование аминокислот с повышенной склонностью к α-спиральной конформации, обра зование дополнительных дисульфидных мостиков, усиление гидрофобных взаимодействий, замены на остатки пролина в петлях, связывание с ионами металлов, более плотная упаковка и др. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ БЕЛКОВ Термостабильные ферменты используются во мно гих современных биотехнологических процессах как в лабораторных условиях, так и в широкомас штабном промышленном производстве [9, 10]. Природным источником термофильных белков служат гипертермофильные микроорганизмы, оп тимально растущие при температурах от 80 до 110°C. Эти организмы, первоначально найденные в горя чих геотермальных источниках, относятся в основ ном к архебактериям. Ферменты из этих организ мов также имеют оптимум активности при высоких температурах (>70°C), а некоторые из них активны при температурах значительно выше 100°C. При этом термостабильные ферменты обычно неактивны при температурах ниже 40°C [11]. Способность надежно предсказывать такие основ ные физико-химические свойства мутантных бел ков, как стабильность и растворимость в воде, имеет большое значение в молекулярной биологии и био технологии. Ранее во многих работах изучали фак торы, влияющие на стабильность и растворимость белков, а также разрабатывали модели для предска зания последствий точечных мутаций в белках [11- 14]. В настоящее время ясно, что существует много факторов, которые могут повредить стабильности белковой структуры или ее активности. Особенности структурной организации термо стабильных белков и ферментов, позволяющие им функционировать при температуре 100°С и выше, ак тивно изучали как в экспериментальных, так и в те оретических работах с середины 80-х годов (всего, согласно базе данных Medline, опубликовано около 3000 работ) [12, 15-18]. В основе дискуссии лежит сравнительный ана лиз гомологичных белков из мезофильных и тер мофильных микроорганизмов (далее мезофиль ных и термофильных белков соответственно). Описанные к настоящему времени пространствен ные структуры термостабильных белков не выяви ли в организации вторичной или третичной струк туры какой-либо особенности, специфичной только для термофилов, по сравнению с их мезофильными аналогами. Различия же, выявляемые на уровне аминокислотных последовательностей, весьма раз нородны. Такое разнообразие характеристик тер морезистентных белков может быть вызвано тем, что термофильность обусловлена суммированием действия различных факторов, возникающих бла годаря подходящей комбинации слабых взаимодей ствий, вовлеченных в стабилизацию белка. Недавно показали, что механизмы адаптации к высоким температурам у разных организмов мо гут зависеть от их эволюционной истории [19]. Вместе с тем замечено, что аминокислотные замены, предпо ложительно сопряженные с терморезистентностью белка, часто локализуются в α-спиралях [20-22]. Следовательно, анализ энергетического баланса мо лекулярных взаимодействий внутри α-спиралей мо жет прояснить причины стабильности термофиль ных белков при высоких температурах. Изменения в аминокислотном составе белков термофильных организмов Изменения в аминокислотном составе белков термо фильных организмов по сравнению с их мезофиль ными аналогами были одним из первых исследован ных факторов, влияющих на термостабильность [23, 24]. Этот статистический анализ показал, что в тер мофильных белках остатки глицина, серина, лизина и аспарагиновой кислоты часто заменены на аланин, треонин, аргинин и глутаминовую кислоту соответ ственно [25]. Функция этих замен в основном состо ит в повышении внутренней и понижении внешней гидрофобности термостабильных белков. Кроме того, эти замены несколько усиливают стабильность α-спиралей и плотность упаковки аминокислот в тер мостабильных белках. В последнее время предпри няты многие дополнительные исследования различ ных физических факторов, которые могут приводить к изменению аминокислотного состава термофиль ных белков (см. обзор на эту тему [18]). В серии работ [26-28] нами показано, что α-спирали термостабильных белков в целом более конформационно стабильны, чем такие же α-спирали из высокогомологичных белков мезофильных и псих рофильных бактерий. При этом состав α-спиралей термостабильных белков меняется за счет увеличения содержания аминокислот с высокой склон ностью к образованию α-спиралей (аланин, лей цин) и соответственно уменьшения содержания β-разветвленных остатков (валин, изолейцин и тре онин). Кроме того, обнаружено значительное уве личение представленности аминокислот, которые могут стабилизировать α-спирали за счет сильных взаимодействий их боковых цепей с боковыми це пями других аминокислот (например, глутаминовой кислоты и аргинина). Сходные результаты получены и в работе других исследователей, которые также обнаружили значительное уменьшение содержания β-разветвленных остатков с низкой склонностью к образованию α-спиралей в термофильных белках [29]. В работе Matthews и соавт. [30] показано, что вве дение остатков пролина повышает термостабиль ность белка за счет уменьшения энтропии разверну того состояния. Дополнительные гидрофобные взаимодействия яв ляются важным механизмом стабилизации структу ры в термостабильных белках. Показано, что в сред нем каждая дополнительная метильная группа, погруженная в структуру белка, добавляет примерно 1.3 (±0.5) ккал/моль в стабильность свернутой кон формации белка [31]. Ионные пары и связывание с ионами металлов Сравнение пространственных структур термофиль ных белков и их аналогов из мезофильных организ мов показало, что первые часто имеют существенно большее количество ионных пар, которые значитель но стабилизируют их структуру при высоких тем пературах [32]. Один из наиболее ярких примеров такого рода - увеличение содержания ионных пар, наблюдаемое в гипертермофильной люмазинсинтазе из Aquifexae olicus по сравнению с ее мезофильным аналогом из Bacillus subtilis более чем на 90% [33]. Уже давно известно, что ионы металлов часто стабилизируют и активируют некоторые фермен ты. Например, изомераза ксилозы из Streptomyces rubiginosus связывает два иона из набора Co2+, Mg2+ или Mn2+, один из которых непосредственно вовле чен в катализ, а второй преимущественно в стабили зацию структуры фермента [34]. Показано, что не которые термостабильные ферредоксины содержат атомы металлов, которых нет в их мезофильных го мологах [35]. Увеличение количества нековалентных взаимодействий Предполагается, что увеличение нелокальных неко валентных взаимодействий (например, ионных пар, водородных связей и Ван-дер-Ваальсовых контак тов), связывающих несмежные части белка, может значительно улучшать термостабильность белка. Данные, накопленные в последнее время, в целом подтверждают эту гипотезу. Например, на основе гомологичных белков рубредоксинов из Pyrococcus furiosus и Clostridium pasteurianum построены хи меры [36]. Относительные стабильности этих хи мер по сравнению с рубредоксинами P. furiosus и C. pasteurianum указывают на существенные для термостабильности белка взаимодействия между ядром белка и одним из β-листов за счет водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Причем от дельно ни ядро, ни β-лист не обеспечивают необхо димую стабилизацию. Сравнение одинаковых белков из термофильных и мезофильных организмов (373 пары белков http://phys.protres.ru/resources/termo_ meso_base.html) показало, что первые имеют более плотно упакованную опушку глобулы, а плотность упаковки внутренней части белка и его ядра свора чивания примерно одинакова в обоих случаях [37]. Водородные связи Другой такой фактор - образование дополнительных водородных связей, стабилизирующих структуру многих термостабильных белков при высоких тем пературах [38-40]. В частности, изучение механизма влияния водородных связей на термостабильность РНКазы T1 показало, что каждая дополнительная водородная связь в среднем добавляет 1.3 ккал/моль в стабильность этого белка [38]. В другой работе [39] обнаружили сильную корре ляцию между термостабильностью белка GAPDH (glyceroaldehyde-3-phosphate dehydrogenase) и ко личеством водородных связей между полярными незаряженными группами в нем. Предположили, что существуют две основные причины, объясняю щие, как наличие дополнительных водородных свя зей может влиять на термостабильность белка: 1) энергия дегидратации таких групп намного меньше, чем энергия дегидратации заряженных групп ион ных пар; 2) выигрыш в энтальпии для таких водород ных связей значительно выше из-за электростатиче ских заряд-дипольных взаимодействий. Образование дисульфидных мостиков Образование дополнительных дисульфидных мости ков - еще один важный фактор, стабилизирующий структуру белка при высоких температурах [41, 42]. Как полагают, этот эффект главным образом связан с уменьшением конфигурационной энтропии развер нутого состояния белка. В некоторых случаях эффект введения в струк туру белка множественных дисульфидных мостиков имел аддитивный характер [43]. В частности, в молекуле лизоцима фага T4 (фермент без дисульфидов) были спроектированы мутанты с дисульфидными мостами между остатками 3-97, 9-164 и 21-142, ко торые оказались значительно более термостабиль ными, чем белок дикого типа. Однако в других случаях такая аддитивность от сутствовала [42, 44, 45]. Более того, в некоторых слу чаях образование дисульфидных мостиков вообще не влияет на термостабильность белка [45] или даже понижает ее [42], что указывает на наличие в струк туре белка участков с различной термочувствитель ностью. Интересно, что, по крайней мере в некото рых случаях, величина эффекта термостабилизации белка с помощью искусственных дисульфидных мо стиков примерно пропорциональна логарифму ко личества аминокислотных остатков, разделяющих два остатка цистеина, образующих дисульфидный мостик [16, 43]. В последнее время этот подход к конструированию термостабильных белков приобрел дополнительную популярность в связи с появлением новых теорети ческих подходов, позволяющих на основе известной пространственной структуры белка рассчитывать не только все возможные комбинации искусственных дисульфидных мостиков, но и примерно оценивать их энергию и вероятность самопроизвольного обра зования [46]. Направленная эволюция Основным экспериментальным методом улучшения свойств ферментов является метод направленной эволюции [47]. Главное преимущество этого подхо да состоит в том, что он не требует знания никаких деталей структуры изменяемого фермента. Метод основан на контролируемом экспериментатором про цессе искусственной ускоренной эволюции микро организмов, поставленных в жесткие условия окру жающей среды. В отличие от естественной эволюции, это более интенсивный и избирательный процесс, он имеет определенную специфическую цель, огра ничен во времени и имитирует такие протекающие в природе процессы, как случайный мутагенез, ре комбинации и отбор. Работы по направленной эволюции промышленно важных белков с помощью химического и радиацион ного мутагенеза начали проводить с начала 80-х го дов, а в 90-х они получили широкое развитие в связи с наступлением эры промышленной молекулярной биотехнологии. Бурное развитие этой отрасли дикту ется необходимостью получения новых все более эф фективных и безопасных для здоровья человека био катализаторов природного происхождения. В 1994 г. появился новый подход - метод перетасовки ДНК [48], который доказал свою эффективность, и на его основе было создано множество различных разно видностей основного варианта. Например, с помощью этого подхода получен термостабильный субтилизин Е, в 15 раз более активный, чем белок дикого типа из B. subtilis при 37°C [49]. Изучение его структуры показало, что большинство мутаций, приводящих к повышению термостабильности белка, находятся в петлях, соединяющих элементы вторичной струк туры [50]. В другом эксперименте термостабильность и активность п-нитробензолэстеразы из B. subtilis были увеличены с помощью пяти циклов неточно го ПЦР, сопровождаемых одним шагом перетасов ки ДНК [51]. Термостабильность мутантного белка увеличилась на 10°C, а активность была выше, чем у фермента дикого типа при любой температуре. ВЫЧИСЛИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ДЛЯ РАЦИОНАЛЬНОГО КОНСТРУИРОВАНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ БЕЛКОВ Для предсказания конформационной стабильности белков и конструирования термостабильных мутан тов были предложены многие теоретические модели и компьютерные алгоритмы, основанные на физиче ских и химических принципах [52-54]. Полученные результаты достаточно убедительно показывают, что эти подходы могут стать надежным инструмен том белковой инженерии в ближайшем будущем. Метод молекулярной динамики (МД) - один из основных, хорошо зарекомендовавших себя вы числительных подходов к моделированию конфор мационной подвижности белков, сворачивания их в нативную конформацию и рационального дизайна мутантов с измененными свойствами [55]. Для того чтобы устранить необходимость моделировать слишком длинные молекулярно-динамические тра ектории, создана теоретическая модель и соответ ствующее программное обеспечение, позволяющее предсказывать подвижные и более стабильные об ласти в белках с известной пространственной струк турой без моделирования детальной молекулярной динамики этого белка [56]. Многократные траектории MД того же самого бел ка при идентичных условиях позволяют определить структуру и последовательность его промежуточ ных состояний при термическом разворачивании [57]. Эти наблюдения могут обеспечить подсказки о том, как ферменты начинают разворачиваться и какие их области наиболее подходят для стабилизации [58]. Кроме МД применяются и другие подходы, ос нованные на современных методах перебора и оп тимизации энергии конформеров боковых цепей аминокислотных остатков исследуемых белков [59]. Например, используя компьютерный алгоритм гло бальной оптимизации, основанный на DEE-теореме, накладывающей условия для выявления ротамеров, которые не могут быть членами конформации, обладающей глобальным минимумом энергии [60]. При помощи данного подхода был сконструирован термостабильный мутант G-белка стрептококка [61]. Мутантный белок имел температуру плавления бо лее 100°C, что на 20°C больше по сравнению с белком дикого типа. Недавно был разработан энергетический по тенциал для оценки влияния точечных мутаций на стабильность глобулярных белков с известной пространственной структурой [62]. Эти расчеты до ступны также через Интернет-сервер http://foldx. embl.de/. Расчеты включают не только оценки изме нения свободной энергии белка при заменах амино кислот, но и расчеты положения заряженных групп, водных мостиков и центров связывания металлов, которые также могут оказывать значительное влия ние на конформационную стабильность белков. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА КОНФОРМАЦИОННУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ α-СПИРАЛЕЙ В КОРОТКИХ ПЕПТИДАХ В отличие от белков в коротких пептидах длиной 10-20 остатков, отсутствуют многие возможности стабилизации структуры, которые есть у глобу лярных белков. Еще в начале 80-х годов считалось, что короткие пептиды не могут поддерживать ста бильные конформации в воде даже при относительно низких температурах [63]. Однако в середине 70-х годов в теоретических работах Финкельштейна и Птицына было предсказано, что короткие пеп тиды, состоящие из аминокислот с высокой склон ностью к α-спиральной структуре, могут иметь достаточно стабильные α-спиральные конформа ции в водных растворах [64-68]. Позднее эти те оретические предсказания были подтверждены экспериментально на основе исследования синте тических пептидов, последовательности которых по вторяли последовательности α-спиралей рибонукле азы А [69, 70]. Теоретическая модель, разработанная Финкельштейном и Птицыным, описывает вероят ности образования α-спиралей, β-структур и изгибов в коротких пептидах и глобулярных белках на основе классического подхода Зима-Брэгга с модификаци ями, позволяющими учесть некоторые дополнитель ные взаимодействия, такие, как электростатические взаимодействия заряженных боковых цепей между собой и с макродиполем α-спирали, а также гидро фобные взаимодействия боковых цепей некоторых аминокислот. На основе этой теоретической модели создана компьютерная программа (ALB), способная успешно предсказывать не только примерный уро вень конформационной стабильности α-спиральных пептидов [4], но и, с вероятностью ~65%, распреде ление элементов вторичной структуры в глобуляр ных белках [71]. Основной недостаток этой моде ли - отсутствие учета некоторых взаимодействий (например, так называемый CappingBox и/или на личие пролина в первом N-концевом положении α-спирали), позиционных зависимостей склонности аминокислот в первом и последнем витке спирали, а также влияние различных специальных после довательностей соседних с α-спиралью участков рассматриваемого пептида, которые, как показано позднее, играют значительную роль в стабилизации α-спиральной конформации в белках и пептидах. Начиная с конца 80-х и особенно в 90-е годы, описано большое количество экспериментов, в ко торых для изучения различных взаимодействий в α-спиралях использовали аминокислотные замены в коротких синтетических пептидах на основе поли аланина [72]. Этот подход позволил накопить доста точно данных и перейти к количественному описа нию кооперативных механизмов конформационных переходов в α-спиральную конформацию для пепти дов с произвольными последовательностями [5, 73]. В настоящее время считается, что у каждой из 20 природных аминокислот имеется характерная вну тренняя, связанная с ковалентной структурой, тен денция к участию в образовании α-спиральных конформаций в пептидах и белках (например, из менения конфигурационной энтропии боковых цепей аминокислот при переходе из случайной в α-спиральную конформацию) [74]. Кроме этого, на стабильность α-спиральных конформаций бел ков влияют взаимодействия боковых цепей (между остатками в положениях i,i+3 и i,i+4), электроста тические взаимодействия заряженных и полярных остатков с макродиполем α-спирали и Capping взаимодействия между остатками, примыкающи ми к α-спирали со свободными NH- и CO-группами основной цепи белка в первом и последнем витке α-спирали [5, 73]. Кроме того, описаны локальные мотивы аминокис лотных последовательностей, включающие остатки, прилегающие к α-спирали, которые либо специфически упаковываются против остатков первого (N-концевого) и последнего (С-концевого) витка спи рали, либо образуют с ними сеть специфических во дородных связей [75]. Обычно предполагается, что структурные склон ности аминокислот не зависят от их положения в α-спирали [4, 76, 77]. Однако первый и последний виток α-спирали не эквивалентны остальной части спирали. Как можно видеть из рис. 1, подвижность боковой цепи валина в центральных позициях спи рали сильно ограничена по сравнению с положением в ее первом витке. Отсутствие учета этого фактора значительно снижает точность теоретических моде лей переходов α-спираль/случайный клубок в описа нии экспериментальных наблюдений по измерению стабильности α-спиральных пептидов со сложными аминокислотными последовательностями [78-80]. ХИМИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ СТАБИЛИЗАЦИИ α-СПИРАЛЬНЫХ СТРУКТУР Поскольку α-спирали часто служат структурной основой межмолекулярных интерфейсов белковых комплексов, их часто используют в разработках пеп тидных ингибиторов, направленных против обра зования этих комплексов. Прицельное разрушение определенных белок-белковых взаимодействий с по мощью α-спиральных или β-структурных пептидов является актуальной проблемой химической биоло гии, активно решаемой в настоящее время. Однако использование пептидных ингибиторов имеет свои серьезные ограничения. Прежде всего, это недостаточная стабильность α-спиральной кон формации коротких пептидов с аминокислотными последовательностями, полученными из природ ных белков. Кроме того, такие пептиды плохо про никают через клеточную мембрану и легко дегра дируются протеазами. В течение последних 30 лет разработаны различные методологии химической модификации коротких α-спиральных пептидов для повышения стабильности α-спиральных кон формаций, а также их устойчивости к действию протеаз (рис. 2). Химические модификации для ста билизации α-спиральных конформаций включают: 1) введение в аминокислотную последовательность пептида остатков с ограниченной подвижностью, таких, как α-α-диалкилированные остатки [81]; 2) ковалентное сшивание боковых цепей аминокислот, расположенных на соседних витках α-спиралей, включая образование ковалентных мостиков на ос нове дисульфидных связей [82], лактамных струк тур [83] и углеводородов [3]; 3) кэппинг группы на N- или С-концах пептида [84]; а также различные комбинации всего вышеперечисленного [2]. В некоторых случаях химические модификации, стабилизирующие α-спирали, одновременно оказа лись способными улучшить и клеточную проницае мость этих пептидов, что делает их хорошими инги биторами внутриклеточных мишеней. В частности, за последнее время появилось большое количество данных о повышенной проницаемости мембран не которых типов раковых клеток человека для хими чески модифицированных α-спиральных пептидов [85]. КОНСТРУИРОВАНИЕ СТАБИЛЬНЫХ α-СПИРАЛЕЙ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ГЛОБАЛЬНОЙ ОПТИМИЗАЦИИ ИХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Одним из эффективных способов решения задачи стабилизации структуры биологически активных α-спиральных пептидов с использованием только природных аминокислот является SEQOPT - недав но разработанный метод глобальной оптимизации аминокислотных последовательностей α-спиралей в мономерных пептидах и глобулярных белках [1]. Этот метод позволяет конструировать α-спирали белков с максимально возможной конформационной стабильностью при данных условиях (конформаци онное окружение, pH, температура и ионная сила раствора) с помощью глобальной оптимизации ами нокислотных последовательностей с произвольным фиксированием любых комбинаций аминокислот. Теоретической основой предлагаемого метода явля ется модель AGADIR, описывающая термодинамику сворачивания α-спиралей при различных условиях окружающей среды (температура, pH и ионная сила раствора и т.д.) [77], успешно использованная также для конструирования мутантных белков с повышен ной конформационной стабильностью [7]. Эта модель хорошо воспроизводит имеющиеся эксперименталь ные данные по стабильности α-спиральной конфор мации огромного количества коротких пептидов [73, 77-80, 86-88]. Зависимость энергетических параметров модели от температуры, pH и ионной силы растворителя была включена в расчеты как описано в работе [86]. Хотя гарантированная сходимость к глобальному минимуму в настоящее время не может быть полу чена для большинства практически значимых много мерных задач, показано, что разработанный метод имеет высокую эффективность в оптимизации ами нокислотных последовательностей α-спиральных пептидов. Измерения КД нескольких синтетических пептидов с оптимизированными последовательно стями оказались в хорошем согласии с теоретически ми расчетами как в терминах абсолютных, так и от носительных величин α-спирального содержания [6]. Как известно, короткие пептиды обычно весьма подвижны и не имеют какой-то одной выделенной конформации. На рис. 3 представлены распределе ния заселенностей всех возможных сегментов в ко ротких пептидах длиной 13 аминокислотных остат ков. Последовательность (AETAAAKFLRAHA) одного из этих пептидов (см. панель 3А) соответству ет α-спирали С рибонуклеазы А - одного из первых пептидов, значительная стабильность α-спиральной конформации которого в воде (HС ~21%, 5оС, pH 7, ионная сила 100 ммоль/л, N- и С-концы ацетили рованы и амидированы соответственно) показана экспериментально. Для сравнения на рис. 3Б пред ставлены данные для пептида такой же длины, но имеющего оптимизированную последовательность DYMERWYRYYNEF и HC ~ 88%. Из этих рисунков видно, что у пептида с аминокис лотной последовательностью, взятой из глобулярного белка, в растворе заселенными оказались в основном несколько спиральных сегментов, начинающихся с аланина в четвертом положении. При этом заселен ности каждого такого сегмента меняются случайным образом в зависимости от его длины и соответствен но аминокислот С-концевой части данного участка. В результате первые четыре, а также последние две аминокислоты этого пептида почти не имеют шансов участвовать в образовании α-спиральной конформа ции, средняя длина которой около шести аминокис лотных остатков. В результате спиральное содержа ние этого пептида довольно низкое - около 21%. Оптимизированная последовательность, в отличие от природной, ведет себя совершенно иным образом. Наиболее высокую заселенность имеет спиральный сегмент, покрывающий всю последовательность пептида. Следующими по заселенности идут сегмен ты, отличающиеся от максимально длинного одним или двумя остатками, потерявшими α-спиральную конформацию с N- и C-концов. В результате общее спиральное содержание пеп тида с оптимизированной последовательностью достигает почти 90%. Естественно, с увеличением длины пептида стабильность α-спиральной конфор мации возрастает, приближаясь к 100%. Значительно выше и средняя длина α-спирального участка пеп тида. Эти результаты показывают не только воз можности метода SEQOPT, но и то, что потенциал 20 природных кислот вполне позволяет получать достаточно стабильные конформации в коротких α-спиральных пептидах длиной всего 10-20 остатков. В обновленной версии SEQOPT (сервер доступен http://mml.spbstu.ru/services/seqopt/, см. рис. 4) введена новая, практически важная функция алго ритма, позволяющая установить минимально допу стимый уровень растворимости α-спиральных пеп тидов с оптимизированными последовательностями. Насколько известно авторам, это первая работа в но вой и многообещающей области глобальной оптими зации аминокислотных последовательностей белков. ПРОНИЦАЕМОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ДЛЯ ПЕПТИДОВ В последнее время высокостабильные α-спиральные пептиды, используемые в качестве высокоактивных и высокоспецифичных ингибиторов межбелковых взаимодействий, находят все большее практиче ское применение в медицине в качестве антибиоти ков различного назначения, а также для разруше ния некоторых комплексов, играющих ключевую роль в жизнедеятельности клеток человека [2]. Одна из главных проблем использования пептидов в меди цине состоит в возможности их проникновения через клеточные мембраны. Клеточная стенка препятствует попаданию чу жеродных молекул внутрь клетки, что затрудняет использование сконструированных высокостабиль ных пептидов в терапевтических целях. Известно не сколько подходов к решению этой проблемы. Один из них основан на использовании специальных ре цепторов, распознающих определенные химические соединения и включающих механизмы активного транспорта внутрь клетки [89]. Другим способом яв ляется разрушение клеточной мембраны и проник новение сквозь открывшиеся поры. Известен и хорошо изучен целый класс пептидов, обладающих антимикробными свойствами и прони кающих сквозь клеточные мембраны, в том числе способных переносить через мембрану как другие пептиды, так и химические соединения другой при роды [102, 103]. Эти пептиды были выделены из бел ков различных организмов - от вирусов до высших (табл. 1). Успешное применение пептидов с антибактери альной активностью для доставки лекарственных средств внутрь клеток показано в ряде эксперимен тов [101, 104, 105], при этом эффективность их про никновения в различные клетки существенным об разом не отличается. Сигнальные пептиды другой группы также способны проникать в клетки. Общий механизм их действия остается неустановленным [89]. В табл. 2 представлены аминокислотные после довательности пептидов и указана их способность проникать в клетки одноклеточных микроорганиз мов. Эти пептиды могут быть синтезированы или кло нированы вместе с необходимыми терапевтическими агентами. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ПРОТЕОЛИЗ α-СПИРАЛЬНЫХ ПЕПТИДОВ Одна из основных проблем, ограничивающих раз витие пептидных терапевтических средств, - их неустойчивость к протеолизу и связанные с этим проблемы с доставкой к молекулярным мишеням. Протеолиз обычно происходит в кишечнике, в микроворсинках на внутренних стенках тонкого ки шечника, в энтероцитах, гепатоцитах, антигенпред ставляющих клетках и плазме, поэтому пероральное применение пептидных препаратов, как правило, не представляется возможным и требуется инъек ционное введение. Однако даже при парентеральном введении деградация пептидных препаратов в крови в сочетании с быстрой почечной фильтрацией дела ют применение пептидных препаратов дорогим и не удобным [112]. Кроме того, синтетические терапев тические пептиды, как правило, по большей части неструктурированы и поэтому быстро расщепляются в естественных условиях внутриклеточными протеа зами, часто с периодом полураспада порядка минут. Устойчивость α-спиральных пептидов к действию протеаз можно усилить путем введения различных факторов, стабилизирующих конформационную стабильность α-спирали, - дополнительных солевых мостиковых связей или других модификаций, таких, как лактамные мостики [113, 114], а также образова ния пептидных олигомерных структур [115]. Поскольку природные пептиды в целом обладают сравнительно коротким временем жизни в плазме, для его увеличения разработаны несколько подхо дов. Первый подход направлен на ограничение фер ментативной деградации путем выявления возмож ных сайтов расщепления пептида с последующими структурными модификациями, например, замеще нием аминокислот в сайте расщепления. Повысить степень устойчивости пептидов к расщеплению мож но также путем усовершенствования укладки вто ричной структуры пептида. Такой подход предпо лагает использование структурно-индуцированных проб - (SIP)-хвост, лактамных мостиков, а также сшивки либо циклизацию пептидной цепи [3, 83, 116]. Для увеличения времени жизни пептида исполь зуют также стратегии связывания пептидов с цир кулирующим белком альбумином в качестве транс портного средства и пептидное ацилирование [117]. Связывание полиэтиленгликоля с пептидами часто применяют для увеличения периода полувыведения пептидных препаратов из плазмы крови [118]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ За последние годы биологически активные пептиды приобретают все большую популярность в качестве потенциальных лекарственных средств в связи с их высокой активностью, нетоксичностью и умеренной стоимостью. Проблемы, связанные с недостаточной конформационной стабильностью, способностью проникать через клеточные мембраны, а также с бы строй деградацией внутриклеточными протеазами, в значительной мере удается преодолеть с помощью современных методов конструирования высокоста бильных пептидов на основе только природных ами нокислот или с использованием нескольких типов их химических модификаций. SEQOPT - недавно раз работанный вычислительный метод конструирова ния α-спиральных пептидов, содержащих только 20 природных аминокислот, позволяет получать пеп тиды с максимально возможной стабильностью их α-спиральной конформации. Метод позволяет учесть конформационное окружение, условия окружающей среды (pH, температура и ионная сила раствора), ми нимально допустимый уровень растворимости, а так же произвольно фиксировать любые комбинации аминокислот, необходимые для биологической ак тивности пептидов. Конформационная стабильность мономерных пептидов с оптимизированной струк турой приближается к конформационной стабиль ности α-спиральных участков вторичной структуры глобулярных белков.

Об авторах

A. П. Якимов

Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого; Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова НИЦ «Курчатовский институт»

Автор, ответственный за переписку.
Email: yaleks@nanobio.spbstu.ru
Россия

A. С. Афанасьева

Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого; Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова НИЦ «Курчатовский институт»

Email: yaleks@nanobio.spbstu.ru
Россия

M. A. Ходорковский

Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого

Email: yaleks@nanobio.spbstu.ru
Россия

M. Г. Петухов

Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого; Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова НИЦ «Курчатовский институт»

Email: yaleks@nanobio.spbstu.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы