Эпигенетика древней ДНК

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Изучение ДНК, выделенной из археологических и палеонтологических образцов, позволяет по лучить информацию об эволюционном прошлом. Первое время работа с древней ДНК заключа лась в анализе нуклеотидных последовательно стей. На этом этапе исследователи сталкивались с множеством трудностей, связанных с качеством древней ДНК, ее контаминацией чужеродной ДНК и пр. Эти сложности удалось преодолеть, в частно сти, совершенствованием методов полногеномно го секвенирования. Однако развитие современных технологий секвенирования позволяет также ана лизировать информацию, содержащуюся в надгене тическом коде. С одной стороны, физические харак теристики, предрасположенность к заболеваниям и даже некоторые психологические особенности индивида обусловлены генетическими факторами. С другой стороны, нельзя забывать про воздействие окружающей среды. Экспрессия генов определяет ся не только нуклеотидной последовательностью, но и целым рядом адаптационно регулируемых процессов, которые приводят к изменению уров ня метилирования ДНК, гистонового кода, спектра микроРНК. Эти эпигенетические механизмы вовле чены в формирование структур хроматина, необхо димых для регуляции экспрессии генов. Благодаря комбинации высокотехнологического секвенирова ния и различных методических подходов получены карты полногеномного метилирования ДНК в раз личного типа клетках человека и мыши: соматиче ских, стволовых, половых, раковых и т.д. [1]. Основной характеристикой любой древней ДНК является ее деградация и дезаминирование остат ков цитозина. До недавнего времени считалось не возможным получить информацию о транскрипци онной активности генов на основе ДНК, выделенной через длительное время после смерти индивида. Тем не менее в 2010 году группой С. Паабо были предпри няты первые попытки получения карт метилирова ния древней ДНК, которые показали потенциальную возможность определения картины метилирования CpG in vivo в ДНК неандертальца [2]. Немного поз же с помощью бисульфитного аллель-специфично го секвенирования отдельных локусов ДНК бизона из образцов, относящихся к позднему плейстоцену, Б. Лламас и соавт. [3] показали, что в древней ДНК сохраняется метилирование. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДРЕВНЕЙ ДНК Дезаминирование метилированных остатков ци тозинов и их превращение в тимин, происходя щее после смерти, затрудняет количественный анализ метилированных цитозинов. Только в 2014 году был разработан метод, позволяющий прово дить полногеномный анализ метилирования древ ней ДНК [4-6]. При бисульфитном секвенировании неметилированные остатки цитозина химически конвертируются в остатки урацила, которые за тем считываются полимеразами, например Taq полимеразой, как тимины при ПЦР. В клетках позвоночных картирование таких С-Т-мутаций осуществляется с точностью до одного нуклеоти да. Аналогичное химическое превращение про исходит после смерти в естественных условиях в основном за счет гидролитического дезаминиро вания цитозинов, расположенных в одноцепочеч ных участках [7]. Применение Taq-полимеразы, например Taq platinum high fidelity (Hifi), нечув ствительной к присутствию урацила, приводит к увеличению количества С-Т-замен относитель но исходной цепи. Такие замены не могут наблю даться при использовании такой Pfu-полимеразы, как Phusion. Pfu-полимераза не способна продол жать синтез цепи в присутствии урацила. При этом 5-метилцитозин дезаминируется в тимин, в отли чие от немодифицированного цитозина, и может быть успешно амплифицирован Pfu-полимеразой (рис. 1). Таким образом, увеличение количества С-Т-замен при анализе древней ДНК позволяет от личить метилированные цитозины от неметилиро ванных [5]. Дезаминирование - это стохастический процесс, значит, всегда есть метилированные CpG динуклеотиды (MpG), не дезаминированные с тече нием времени, которые будут амплифицироваться как обычные CpG (рис. 1). Поэтому данный метод позволяет определить метилирование не всех цито зинов, а только дезаминированных. Для определе ния метилированных цитозинов с однонуклеотид ным разрешением необходимо увеличивать уровень покрытия. Так, в работе группы Р. Смита [8] показа на возможность определять статус метилирования одиночного CpG-динуклеотида, расположенного в мобильном генетическом элементе LINE-1, в об разцах древней ДНК, полученной из скелетов пяти североамериканцев, возраст которых составлял от 200 до 4000 лет до нашей эры. Если не требуется определять MpG с точностью до одного нуклеотида, то достаточно анализировать количество CpG-TpG замен на интересующем участке ДНК. Такой подход применен к анализу генома неандертальского, дени совского, палеоэскимосского человека [4]. Удалось показать, что в костном мозге и в волосяном фолли куле современных и древних людей метилирование ДНК практически идентично. АНАЛИЗ ЭПИГЕНОМА ДРЕВНЕЙ ДНК При исследовании дифференциально метилиро ванных участков Д. Джохман и соавт. обнаружили, что промоторы и последовательности генов HOXD9 и HOXD10, одних из ключевых регуляторов развития конечностей, метилированы в костном мозге древних образцов (человек неандертальский и денисовский) и неметилированы в ДНК современного человека [4]. На мышиных модельных системах показано, что из менения в экспрессии генов кластера HOXD, особен но генов HOXD9 и HOXD10, приводят к морфологиче ским изменениям [9], которые напоминают различия в строении конечностей неандертальца и современ ного человека. Этот факт позволяет предположить, что эпигенетические изменения в кластере генов HOXD играют ключевую роль в эволюции конечно стей современного человека. Более того, внутри гена MEIS1, кодирующего белок, который регулирует ак тивность генов кластера HOXD, найден дифферен циально метилированный участок [4]. Информация о метилировании древней ДНК больших геномных районов в виде количества С-Т-замен может исполь зоваться для поиска протяженных участков с из мененным уровнем метилирования в костном мозге и волосяных фолликулах наших предков. Такой ана лиз позволит обнаружить не только гиперметилиро ванные CpG-островки, но и: 1) длинные (от нескольких сотен тысяч до несколь ких миллионов пар нуклеотидов) частично метили рованные домены (PMD), которые не содержат гены и колокализуются с ламинсвязанными структурами [10, 11]; 2) «долины» метилированной ДНК (DMV) (не сколько тысяч пар нуклеотидов), гипометилирован ные в большинстве тканей, содержащие большое количество генов развития и участков связывания факторов транскрипции [12, 13], но гиперметилиро ваны в клетках рака кишечника [12]; 3) недометилированные «каньоны» (десятки тысяч пар нуклеотидов), недавно открытые в гемопоэтиче ских стволовых клетках [14]; 4) эпигенетические механизмы воспаления кишеч ника, которые характеризуются гиперметилирова нием DMV, низкой плотностью CpG, активными мар ками хроматина [15]. Все перечисленные исследования основаны на анализе уровня метилирования геномных обла стей, длина которых варьирует от нескольких ты сяч до нескольких миллионов пар нуклеотидов. Эпигенетический анализ древней ДНК, базирующий ся на поиске регионов, обогащенных заменами С-Т, открывает перед нами новые возможности опреде ления адаптационных сигналов и/или маркеров за болеваний. Однако для этого необходимы хорошо со хранившиеся ткани (мозг, кишечник, мышцы, кровь), что характерно для останков, найденных в вечной мерзлоте, например, останков мамонтов, живших в эпоху плейстоцена (см. далее). В 2014 году была опубликована уникальная работа по составлению эпигенетической карты, полученной на ДНК одного волосяного фолликула палеоэскимосcкого человека, позволившая определить возраст индивида в момент смерти [5]. Это сделано на основе судебного исследо вания, показавшего возможность вычисления воз раста по уровню метилирования определенных CpG динуклеотидов [16]. Если предположить, что 6000 лет назад внешняя среда воздействовала на метилиро вание так же, как в наши дни, то, основываясь на со временных базах данных, можно определить возраст древнего человека. Группа Л. Орландо показала, что саккакский человек (палеоэскимосская эпоха в Гренландии) был сравнительно немолод, к моменту смерти ему, вероятно, было около 35-40 лет [5]. ПРОБЛЕМА КОНТАМИНАЦИИ ДРЕВНЕЙ ДНК Значительную трудность при работе с древней ДНК представляет контаминация материала бактериаль ной ДНК. Недавно показали, что эпигенетические особенности позвоночных (метилирование CpG) мож но применить для разделения бактериальной и древ ней геномной ДНК человека [17]. Метилированные CpG-динуклеотиды найдены только в соматиче ских клетках позвоночных. В бактериальном гено ме также есть метилированные цитозины и адени ны, но не в СpG. В состав белков семейства MBD входит метил-ДНК-связывающий домен (MBD), который взаимодействует с метилированной ДНК, содержащей одиночные метилированные CpG [18]. Аффинная хроматография на основе домена MBD является рутинным методом построения карт мети лирования геномов различных организмов. Этот ме тод позволяет не только охарактеризовать древние метиломы, но и разделить ДНК древних позвоноч ных и микроорганизмов. На примере палеоэскимос ского саккакского человека, шерстистых мамонтов (Юка и Хрома), полярных медведей и двух видов, принадлежащих к семейству лошадиных, показано, что метилирование сохраняется в различных тканях, при внешних воздействиях и при разном времени появления останков (от 4000 до 45000 лет до нашего времени). Обогащение с помощью аффинной хрома тографии с MBD-доменом позволяет проводить ана лиз микробиоты древних образцов, а также потенци ально патогенных геномов [17]. ТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ДРЕВНИХ ГЕНОВ НА ОСНОВЕ НУКЛЕОСОМНЫХ КАРТ Метилирование ДНК может служить маркером по давления транскрипции генов, однако этой инфор мации недостаточно для того, чтобы утверждать, экспрессировался ген или нет. Для предсказания транскрипционной активности гена необходима до полнительная информация, например, о модифика циях гистонов, структуре хроматина, связывании факторов транскрипции с регуляторными участка ми. Предприняты первые попытки работы с белками из древних организмов [19]. Секвенирование древ ней ДНК выявило неожиданный источник эпигене тической информации. Исследователи из группы Л. Орландо обнаружили периодичность в плотно сти прочтения нуклеотидов [5]. Они предположили, что наблюдаемая периодичность не является ошиб кой выравнивания последовательностей или арте фактом секвенирования. В основе периодичности плотности прочтения нуклеотидов лежит защита ДНК путем связывания ее с нуклеосомами, при этом расщепление ДНКазой, которая попала в ядра во время клеточной смерти, либо посмертная дегра дация ДНК происходят в линкерных участках. В этом случае наблюдаемая глубина секвенирования отра жает положение нуклеосом на ДНК. Спектральные методы анализа ДНК применяются для поиска скры тых периодичностей. Так, в случае сравнительно коротких последовательностей использование пре образования Фурье позволяет получать статистиче ские критерии, обладающие свойством самоусред няемости [20]. Применение преобразования Фурье к функции, которая связывает плотность покрытия «чтениями» с координатой в геноме, имеет сильный пик на 180-190 нуклеотидов, указывая на то, что пе риодичность покрытия при секвенировании совпа дает с периодичностью организованного в нуклеосо мы хроматина (рис. 2). При анализе распределения плотности расположения 5’-конца чтений выясни лось, что на расстояниях с характерной длиной 100 нуклеотидов проявляется также периодичность в 10 нуклеотидов, которую связывают с одним оборотом спирали ДНК: нуклеотиды, обращенные к нуклеосо мам, не будут стартом чтений, поскольку они менее доступны для нуклеаз. В древней ДНК с высокой точ ностью удалось картировать положение нуклеосом на расстоянии 4 т.п.н. от сайтов связывания CTCF, расположение которых отрицательно коррелировало с метилированием ДНК. Активно транскрибируемые участки можно находить с помощью анализа гипер чувствительных к ДНКазе I участков, расположен ных в стартах транскрипции [21]. Предполагается, что участки с открытой структурой хроматина бу дут более чувствительны к расщеплению ДНКазой I при апоптозе или после смерти организма. Поэтому при полногеномном секвенировании плотность чте ний в районах старта транскрипции активных генов будет снижена по сравнению с молчащими генами. Если одновременно учитывать плотность чтений в области определенного старта транскрипции и информацию о гиперчувствительных к ДНКазе I участках из базы данных ENCODE, то появляется потенциальная возможность определения транс крипционной активности соответствующих генов. ПЕРСПЕКТИВЫ Комбинирование информации о метилировании ДНК и сайтах гиперчувствительности к ДНКазе I в стар тах транскрипции позволит в ближайшее время восстановить количественную картину экспрессии генов в древних образцах. Если удастся найти хоро шо сохранившийся мозг древнего человека, то это будет прорывом в области изучения древней ДНК и эволюции человека. Подобную возможность под тверждает недавняя находка шерстистого мамонта, структуры мозга которого хорошо сохранились [22]. Предполагается, что основные отличия в высшей нервной деятельности древних и современных людей будут найдены на эпигенетическом уровне [23, 24].

Об авторах

С. В. Женило

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: prokhortchouk@gmail.com
Россия

A. С. Соколов

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: prokhortchouk@gmail.com
Россия

E. Б. Прохорчук

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: prokhortchouk@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы