Роль белков семейства BAR в регуляции динамики клеточных мембран

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ При движении клетки скоординированные процессы полимеризации актина и взаимодействие актиновых филаментов с клеточной мембраной толкают актив ный край клетки вперед и приводят к образованию филоподий. Эти процессы координируются актинсвязывающими белками. Нарушения в функциони ровании актинсвязывающих белков, приводящие к нарушениям подвижности клетки, являются от личительной особенностью необластических клеток. Белки семейства BAR служат связующим звеном между динамикой актина и мембранными перестрой ками у всех эукариот. Изначально BAR-домены были определены как консервативные участки белков жи вотных BIN и амфифизина, а также дрожжевых бел ков Rvs161 и Rvs167 [1]. Помимо BAR-домена, белки этого семейства содержат другие домены, необхо димые для связывания со специфическими белка ми и липидами, что определяет их функцию и рас положение в клетке [2] (рис. 1). Предпочтительное связывание BAR-доменов с изогнутыми участками мембраны позволяет привлекать нужные белки к ме стам мембранных перестроек. BAR-доменные белки могут воздействовать на по лимеризацию актина разными способами. В некото рых случаях они активируют факторы нуклеации актина WASP (Wiskott-Aldrich Syndrome Protein) и WAVE (Wiskott-Aldrich Verprolin Protein) [3], дру гие BAR-доменные белки взаимодействуют с Rho GTP-азами [4]. Большинство BAR-доменов при влекают к мембране специфичные для конкретно го клеточного процесса белки за счет SH3-доменов, которые сами способны взаимодействовать со мно жеством белков, содержащих богатые пролином последовательности [5, 6]. Это ставит вопрос о фак торах, определяющих специфичность привлечения определенных белков. Существует гипотеза, согласно которой белки-партнеры узнают не отдельные SH3 домены, а специфическое расположение нескольких SH3-доменов [7] (см. ниже). Помимо привлечения белков-партнеров, SH3 домены часто выполняют функцию регуляции ак тивности BAR-доменов [8, 9]. Как правило, связы вание SH3 с BAR-доменом переводит структуру в автоингибированное состояние, для снятия кото рого необходимо взаимодействие с белком-активатором [9]. У F-BAR белка Nervous wreck (Nwk) связывание SH3-домена с F-BAR не блокирует его способность связываться с мембраной, а лишь уве личивает необходимое для связывания количество фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (ФИ(4,5)Ф2) [10]. Интересный пример регуляции активности BAR-домена показывает белок PICK, функции ко торого связаны с интернализацией и экспонирова нием на поверхность клетки AMPA-рецепторов [11]. PICK ингибируется другим BAR-доменным белком - ICA69 [12], причем на сегодняшний день не ясно, обусловлено это образованием гетеродиме ра из BAR-доменов ICA69 и PICK или совместной олигомеризацией их гомодимеров. Второй вариант кажется более вероятным, учитывая стабильность димеров BAR-доменных белков и потенциальное участие C-концевого участка ICA69 во взаимодей ствии. По данным базы Uniprot семейство BAR включа ет в настоящее время более 220 белков [13], только для четверти из них получены кристаллические структуры [14]. Общее свойство всех BAR-доменов - формирование димеров с положительно заряжен ной поверхностью, которая связывается с отрица тельно заряженными липидными мембранами [15, 16]. По структурным и филогенетическим свойствам BAR-домены делятся на несколько групп: классиче ские BAR/N-BAR, F-BAR и I-BAR (рис. 1) [17]. КЛАССИЧЕСКИЕ BAR-ДОМЕНЫ И N-BAR-ДОМЕНЫ Классический BAR-домен представляет собой димер, в котором каждый мономер состоит из трех изогну тых антипараллельно направленных альфа-спира лей [15]. Димеры классических BAR и N-BAR име ют серповидную форму и связываются с мембраной своей вогнутой поверхностью. Большинство белков, содержащих классические BAR-домены, присут ствуют в нервных клетках млекопитающих, где уча ствуют в формировании синаптических контактов, и в процессах, связанных с передачей сигнала [18]. Одними из наиболее изученных BAR-доменных белков являются амфифизины, функции которых связаны с эндоцитозом в нейронах [19]. У млекопи тающих имеется два гена, кодирующих амфифизи ны. Изоформа амфифизина 2, так же как амфифизин дрозофилы, экспрессируется не в нейронах, а в мы шечных клетках, где участвует в формировании и стабилизации Т-трубочек [20, 21]. Мутации в ам фифизине 2/BIN1 человека вызывают наследствен ное нейромышечное заболевание, называемое цен тронуклеарная, или миотубулярная миопатия [22]. Единственный консервативный участок различных амфифизинов - N-концевой BAR-домен. Кристаллическую структуру BAR-домена амфи физина дрозофилы получили в 2004 году и предска зали, что подобные домены могут встречаться у мно гих групп белков [15]. На основании структурного сходства к семейству BAR-доменов была отнесена определенная ранее структура C-концевого домена арфаптина [23] и расшифрованная позднее структу ра эндофилина [24]. На тот момент в ряде работ уже отмечали важную роль эндофилина в эндоцитозе и его взаимодействие с амфифизином и динамином [25, 26]. Согласно результатам рентгеноструктурного ана лиза, на концах BAR-домена, между α-спиралями 2 и 3 и на его вогнутой поверхности присутствуют кластеры положительно заряженных аминокислот ных остатков (а.о.) (рис. 2), мутации которых снижали способность BAR-домена связываться с мембраной и модифицировать липосомы in vitro. Показано так же, что N-концевая последовательность амфифизи на длиной 26 а.о. имеет неупорядоченную структу ру в растворе, но складывается в амфипатическую спираль (АС) при взаимодействии с липидами. Встраивание АС помогает BAR-домену формировать изгиб мембраны [27]. В дальнейшем АС обнаружили у многих (но не у всех) BAR-доменных белков. I-BAR-ДОМЕНЫ I-BAR-домен был впервые определен как гомологич ный N-концевой домен белков IRSp53 и MIM мле копитающих и назван IM-доменом (IRSp53/MIM) [28]. Позднее, из-за структурного сходства с BAR доменами, этот домен получил называние I-BAR (Inverse BAR) [29]. I-BAR-доменные белки представ лены как у высших, так и у низших эукариот, однако не найдены у дрожжей. Подобно классическим BAR-доменам, I-BAR домены состоят из трех α-спиралей и формируют димеры, многие из которых в опытах in vitro связы ваются с липосомами и модифицируют их кривизну [30-32]. Димер I-BAR имеет менее изогнутую фор му, чем классический BAR (рис. 1). Кластеры поло жительно заряженных аминокислот, отвечающих за связывание с отрицательно заряженными липида ми в мембране, располагаются у них не на вогнутой, а на выпуклой поверхности (рис. 2), и они вызывают изгиб мембраны в противоположную по сравнению с BAR сторону [28, 33]. Ген, кодирующий IRSp53, активно экспрессиру ется в различных клетках и тканях млекопитающих, особенно в нейронах. У мышей с нокаутом IRSp53 нарушены способность к обучению и память [34]. IRSp53 содержит CRIB-мотив, который связывается с GTP-азой Cdc42, и SH3-домен, взаимодействующий с WAVE. В комплексе с Cdc42 и белком Eps8 он может вызывать формирование филоподий [35], а в ком плексе с WAVE - ламеллоподий [36]. Регуляция IRSp53 происходит за счет фосфорилирования двух остатков треонина, что приводит к связыванию с ним белка 14-3-3 и последующей инактивации [37]. IRTKS, ближайший гомолог IRSp53, в меньших ко личествах присутствует в мозге, но найден в мочевом пузыре, печени, семенниках, сердце и легких. В от личие от IRSp53 он не связывается с Cdc42, а его экс прессия в клетках вызывает образование кластеров коротких актиновых филаментов, а не филоподии, однако конкретные биологические функции IRTKS неизвестны [38]. MIM (Missing-In-Metastasis) полу чил свое название благодаря тому, что его экспрессия была понижена в некоторых метастазирующих ли ниях клеток [39], однако более поздние исследования показали, что в других метастазирующих линиях его экспрессия может быть, наоборот, повышена [40]. В процессе развития организма MIM активно экс прессируется в сердце, скелетных мышцах и цен тральной нервной системе. Сверхэкспрессия MIM в клеточных линиях млекопитающих приводит к ис чезновению стрессовых фибрилл актина и появле нию множества небольших выступов на поверхности клеток [41]. Активность MIM, как и IRSp53, регули руется фосфорилированием остатка в центральной части белка (вне I-BAR-домена) [42]. Получены дан ные об участии MIM в образовании цилий [43], одна ко точная его роль в развитии и физиологии живот ных не ясна. Белок ABBA, ближайший гомолог MIM, экспрессируется в глиальных клетках центральной нервной системы мышей, но отсутствует в нейронах. В культуре глиальных клеток C6-R АВВА локализу ется в области кортикального актина, а его нокдаун приводит к дефектам в формировании ламеллоподий [44]. В 2011 году была расшифрована атомная струк тура I-BAR-домена белка Pinkbar (Planar Intestinaland Kidney-specific BAR), которая обладает практически нулевой кривизной [45]. Этот белок экс прессируется в эпителиальных клетках кишечни ка и почки и участвует в структуризации мембраны в зоне межклеточных контактов. I-BAR-домен белка Pinkbar, в отличие от других известных, способен формировать уплощенные участки мембраны и со бираться в стабильные плоские олигомеры, причем как на липидной мембране, так и в растворе [29, 45]. Следствием олигомеризации доменов, помимо де формации мембраны, является кластеризация заря женных липидов ФИ(4,5)Ф2 в мембране. По сравне нию с классическими BAR-доменами I-BAR-домены обладают более высоким электростатическим потен циалом и способны формировать кластеры ФИ(4,5)Ф2 на микроскопических масштабах [33]. F-BAR-ДОМЕНЫ Еще одна широкая группа BAR-доменных бел ков имеет домен F-BAR (Fes/CIP4 homology-BAR). F-BAR-белки найдены у всех эукариот, кроме расте ний, они считаются важнейшими регуляторами изги ба клеточных мембран [46]. Большая часть известных F-BAR-доменных белков вовлечена в клатрин-зави симый или кавеолин-зависимый эндоцитоз. Многие также участвуют в образовании филоподий и ламел лоподий, но если филоподии необходимы для фор мирования аксонов [47], то ламеллоподии, напротив, ингибируют этот процесс [48]. Обе эти структуры могут обеспечивать миграцию нормальных клеток и участвовать в распространении метастазирующих [49]. Еще один важный процесс, нарушение которого приводит к развитию опухолей, - клеточное деление, также происходящее с участием F-BAR-доменных белков. К заболеваниям, связанным с изменением уровня экспрессии или мутациями в генах, кодиру ющих белки этой группы, относятся нарушения раз вития, неврологические и аутовоспалительные забо левания, инвазивные опухоли, гипертрофия сердца, нарушения углеводного обмена и дисфункция почек, что делает F-BAR-доменные белки потенциальной терапевтической мишенью [50]. Впервые F-BAR-домен обнаружили в белке CIP4 (CDC42-Interacting Protein 4) [51]. Консервативный N-концевой участок (60 аминокислотных остат ков) белков CIP4 и FES был назван FCH (FES/CIP4 Homology). Он расположен рядом с доменом, похо жим по структуре на BAR-домен, и вместе с ним об разует функциональную единицу - F-BAR. Анализ кристаллических структур F-BAR-доменов белков млекопитающих FBP17 и CIP4 показал, что F-BAR домены имеют менее изогнутую и более удлинен ную форму, чем классические BAR-домены [16] (рис. 1). Они состоят из пяти α-спиралей: короткой N-концевой, трех длинных и короткой C-концевой, за которой следует небольшая последовательность, ответственная за гомодимеризацию. Поверхности, которыми мономеры взаимодействуют друг с дру гом, содержат в основном гидрофобные остатки и не сколько заряженных (рис. 2). Мутации консерватив ных положительно заряженных аминокислотных остатков на вогнутой стороне F-BAR-димеров при водили к снижению способности белков связываться с мембраной и модифицировать липосомы in vitro [16, 52]. Исследования последних лет указывают на из бирательность связывания фосфолипидов некото рыми F-BAR-доменами [53, 54]. Так, у дрожжевого белка Rgd1p, активирующего GTP-азы Rho3 и Rho4 [55], обнаружен сайт связывания фосфоинозитидов, отсутствующий у других F-BAR-доменных белков дрожжей - Bzz1p и Hof1p [56]. Опыты in vitro по казали предпочтительное связывание Rgd1p с ли посомами, содержащими ФИ(4,5)Ф2. Получение кристаллографической структуры Rgd1p в ком плексе с мио-инозитол-1,2,3,4,5,6-гексакисфосфатом (ИнзФ6), выступающим в роли аналога фосфоино зитидной липидной головки, позволило определить аминокислотные остатки, составляющие сайт связы вания фосфоинозитидов. Белки CIP4, FBP17 и FCHo2 также обладают специфичностью к фосфоинозитидам и имеют соот ветствующий сайт связывания [16, 52, 57]. Такой же сайт обнаружен у человеческого белка Gmip [58], который активирует GTP-азу RhoA и играет важ ную роль в перестройке кортикального актина в ран нем митозе [59], а также в миграции нейронов [60]. И в том, и в другом процессе фосфоинозитиды являются важными регуляторами. Таким образом, специфичность связывания некоторых F-BAR-доменов с липидами позволяет привлекать F-BAR-доменные белки к определенным участкам мембраны. Кроме этого, связывание F-BAR-доменов ограничивает диффузию липидов, а следовательно, и трансмем бранных белков, что может иметь важное значение для пространственной организации белков в кон кретном клеточном процессе [54, 61]. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ BAR-ДОМЕННЫХ БЕЛКОВ С МЕМБРАНОЙ Основные функции BAR-доменов заключаются в формировании мембранного изгиба, его распро странении и стабилизации и/или распознавании с последующим привлечением цитозольных белко вых факторов к определенному месту клетки [17]. При этом возникновение изгиба и его распростране ние являются связанными процессами: локальные деформации мембраны, обусловленные одним диме ром, облегчают связывание других димеров. Начальные этапы формирования мембранного из гиба происходят за счет электростатического связы вания BAR-домена с мембраной и в некоторых слу чаях встраивания в мембрану N-концевой АС [62]. В основе связывания лежит взаимодействие поло жительно заряженных аминокислот с отрицательно заряженными липидами, причем некоторые BAR домены предпочтительно связываются с фосфоино зитидами [56]. Встраивание АС в один монослой спо собствует образованию изгиба из-за возникающей асимметрии в структуре бислоя [63]. Показано так же, что АС некоторых BAR-белков играют ключевую роль во фрагментировании небольших липосом [64]. Однако экспериментальные данные о связывании с мембранами BAR-доменов, не имеющих АС [65, 66], не позволяют однозначно ответить на вопрос о роли АС в генерации мембранного изгиба. Для распространения изгиба необходимо взаимо действие многих BAR-доменов. Структуру, которую они образуют на поверхности мембраны, называют скаффолдом. Считается, что формирование скаф фолда присуще всем BAR-доменным белкам, и его структура во многом определяет результат воздей ствия на мембрану. В свою очередь, структура скаф фолда зависит от концентрации белка и натяжения мембраны. Методом крупно-зернистой молекуляр ной динамики показано, что N-BAR-домены при их низкой концентрации собираются на плоских мем бранах и липосомах в нитевидные структуры и сет ки, а при достижении поверхностной плотности 20% начинают формировать мембранный выступ [67]. N-BAR-белок эндофилин, функции которого связа ны с эндоцитозом, способен индуцировать формиро вание трубок на гигантской липосоме при плотности около 5% и малом поверхностном натяжении (ПН). Для формирования трубок при большом ПН требу ется большая плотность белков, а при ПН выше 0.25 мН/м формирование трубок полностью ингибирует ся. Влияние ПН на сборку скаффолда обусловлено тем, что связывание димеров концевыми участками опосредуется локальными мембранными деформа циями, которым препятствует высокое значение ПН. Это говорит о том, что уменьшение ПН может запу скать механизм быстрой активации эндоцитоза [68]. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ BAR-ДОМЕНОВ К ИЗГИБУ МЕМБРАНЫ Изучение интенсивности флуоресценции белков на мембранных трубках, образованных гигантски ми липосомами, показало, что BAR-домены могут работать как детекторы мембранного изгиба: плот ность расположения BAR-доменов, связанных с мем бранными трубками, в десятки или сотни раз выше, чем на плоской мембране. Предпочтительное связы вание с мембранными трубками показано для всех протестированных BAR-доменных белков: амфи физина [69], эндофилина [70], BIN1 [71], синдапина [65] и IRSp53 [66]. Чтобы объяснить, почему похожие по структуре BAR-домены воздействуют на мембра ны по-разному, необходимо рассмотреть способы ор ганизации множества BAR-доменов на мембране. Так как рентгеноструктурный анализ не может дать представления о взаимодействии белков с пол норазмерной мембраной, реконструкции олигомеров BAR-доменов, связанных с мембранными трубками, получены методом криоэлектронной микроскопии [7, 72, 73] (рис. 3). Изучение организации F-BAR-доменов эндофи лина на мембранной трубке показало, что они распо лагаются под углом 10° [7] (рис. 3А). Большие участ ки свободной мембраны между соседними тяжами (около 50 Å) могут быть обусловлены необходимостью обеспечить доступ GTP-азам, с которыми эндофи лин взаимодействует в процессе эндоцитоза [74]. SH3-домены полноразмерного эндофилина при его взаимодействии с мембранной трубкой также рас полагались на поверхности в виде димеров. Это под тверждено опытами с поперечными сшивками ци стеинов, экспериментально введенных в SH3-домены [75]. Предположили, что такая пространственная ор ганизация может узнаваться GTP-азой динамином, имеющей две расположенные рядом богатые проли ном последовательности [75]. Еще одной олигомерной структурой, изученной с помощью криоэлектронной микроскопии и спираль ной реконструкции, стала структура BAR-доменов изоформы амфифизина 2, вовлеченного в организацию Т-трубочек [72] (рис. 3Б). BAR-домены амфифи зина упакованы значительно плотнее, чем в струк туре эндофилина, и таким образом, что один конец BAR-домена направлен в мембрану, а другой от нее. В отличие от эндофилина, они стабильно соедине ны друг с другом АС, которые, как предполагается, участвуют в инициации изгиба. Как следствие, тру бочки, формируемые амфифизином, намного более жесткие. Это согласуется с биологическими функ циями белков: амфифизин формирует стабильные Т-трубочки, а эндофилин динамичные структуры, быстро образующиеся и разбирающиеся в процессе эндоцитоза [76]. С помощью рентгеновской кристаллографии удалось не только получить структуры отдельных F-BAR-доменов, но и предложить схему их вза имодействия с мембранами. В кристаллах F-BAR домены формируют плоские скаффолды, в которых BAR-домены расположены в боковой ориентации. Между собой BAR-домены взаимодействуют конце выми и латеральными участками. При взаимодей ствии с мембраной BAR-домены поворачиваются так, что изогнутая сторона, несущая положительно заряженные аминокислотные остатки, оказывает ся повернутой к мембране, плоский скаффолд пре образуется в кольцевой, а затем в спиральный, за кручивающийся вокруг формирующейся трубки [16] (рис. 3В). Это предположение подтверждено данны ми криоэлектронной микроскопии [73] и молекуляр ного моделирования [77]. Изолированные I-BAR-домены могут активно формировать мембранный изгиб [33], но поскольку у полноразмерных I-BAR-белков эта способность менее выражена [41] ввиду автоингибирования, они могут связываться с уже изогнутой мембраной. Функции восприятия и генерации изгиба мембраны не являются взаимоисключающими, поэтому можно предположить, что поведение белка зависит от его концентрации: при низкой концентрации они распоз нают существующий изгиб мембраны и привлекают к ней другие белки, а при высоких могут собираться в олигомеры (рис. 3Г) и активно участвовать в рас пространении изгиба [78]. С другой стороны, I-BAR домены белка Pinkbar формируют не изгибы, а упло щенные мембранные участки. В соответствии с этим их олигомеры имеют плоскую форму, хотя в них при сутствуют характерные для BAR-доменов концевые взаимодействия (рис. 3Д). СТАБИЛИЗАЦИЯ ИЗГИБА МЕМБРАНЫ Важность N-концевых АС для стабилизации взаи модействия с липидами установлена с помощью раз личных методов [15, 79]. В опытах in vitro отсутствие АС приводило к неспособности эндофилина модифи цировать липосомы и образовывать трубки. Это по казано также методом молекулярной динамики [7]. В более позднем исследовании методом электронного парамагнитного резонанса было показано, что АС эн дофилина проникают в липидный бислой на 8-11 Å ниже уровня фосфатных групп и не находятся в пря мом контакте друг с другом [80]. Предполагали, что важность АС для олигомеризации белка может быть связана с совместной координацией липидов. Встраивание АС в верхний липидный монослой при водит к образованию положительного мембранного изгиба из-за возникающей асимметрии в структуре бислоя. Структура эндофилинов, установленная с по мощью криоэлектронной микроскопии, указыва ла на то, что вставки соседних (параллельно длин ной оси трубки) димеров не взаимодействуют друг с другом и направлены к мембране. Это отличало их от расположения в кристаллической структуре и в связанном с липосомами состоянии. Различие впоследствии объяснили двумя конформационными состояниями: при высоких концентрациях белка, до статочных для формирования олигомера, N-BAR домен оказывается ближе к мембране, что спо собствует более глубокому встраиванию АС [80] и препятствует спонтанному мембранному изгибу и стабилизирует мембранную трубку. Переключение между конформациями эндофилина может быть свя зано с фосфорилированием Ser75: появление нега тивного заряда мешает встраиванию АС в мембра ну и стабилизации трубочек. Известно, что мутации LRRK2-киназы, связанные с болезнью Паркинсона, приводят к повышению фосфорилирования Ser75 и нарушениям эндоцитоза в синапсах [81]. Помимо привлечения белков-партнеров, SH3 домен эндофилина регулирует активность N-BAR домена. Методом молекулярной динамики показано, что в растворе SH3-домен связывается с N-концевой АС за счет гидрофобных взаимодействий и форми рования солевых мостиков между заряженными остатками [8]. Отрицательный электростатический потенциал при этом концентрируется на SH3 домене, а положительный на АС, поэтому когда бе лок подходит к мембране, АС поворачивается к ней, а SH3-домен отворачивается от нее. С одной сторо ны, в такой автоингибированной форме SH3-домен не взаимодействует с другими белками в растворе, а с другой, белок «ищет» в мембране место, подходя щее по электростатическому потенциалу и имеющее дефекты в упаковке липидов, куда может произойти встраивание АС. В последние годы появляются свидетельства того, что активность по формированию мембран ных трубок или инвагинаций мембраны харак терна не для всех без исключения BAR-доменов. Дрожжевой белок Cdc15p, вовлеченный в цитокинез, олигомеризуется в филаменты и не вызывает моди фикацию мембраны [82]. Олигомеризация Cdc15p необходима для формирования контрактильного кольца, однако в этом случае белок не вызывает из менение формы мембраны, а лишь привлекает к ней другие белки. Отсутствие способности формировать трубки также показано для шести F-BAR-доменов млекопитающих. Возможно, общая функция F-BAR доменных белков состоит в привлечении и про странственной организации около мембраны других белков, и лишь в некоторых случаях они непосред ственно изменяют форму мембраны [83]. Один из та ких белков - F-BAR-доменный белок Nervous wreck (Nwk), гомологи которого присутствуют у многих организмов, от насекомых до высших позвоночных. Два гомолога этого белка вовлечены в мембранные перестройки в стереоцилиях и нейронах мозжечка млекопитающих [84, 85]. НЕТРАДИЦИОННАЯ ОРИЕНТАЦИЯ. F-BAR- ДОМЕННЫЙ БЕЛОК NERVOUS WRECK Рост нейронов и образование новых связей - про цессы, лежащие в основе обучения и памяти, - кон тролируются факторами роста. Рецепторы, связав шиеся с факторами роста, убираются внутрь клетки путем эндоцитоза и направляются в специфические клеточные компартменты, где могут подвергаться модификации, деградации или взаимодействовать с другими белками [86]. Определение механизмов, которые контролируют скорость и направление по тока эндосом с рецепторами, имеет большое значение для понимания процессов передачи сигнала. Нервно мышечный синапс Drosophila melanogaster служит удобной моделью для изучения регуляции синапти ческого роста, поскольку за 4 дня площадь мышцы увеличивается более чем в 100 раз, что сопровожда ется значительным увеличением количества контак тов с нейронами. Регуляция процесса роста нейро нов включает как ретроградные сигналы от мышцы, так и антероградные сигналы от нейрона к мышце [87]. Известно, что мутации белков-регуляторов эн доцитоза приводят к избыточному количеству ответ влений аксона, поскольку препятствуют затуханию сигнала от рецепторов фактора роста [88-90]. F-BAR-белок Nervous wreck (Nwk) имеет огра ниченную гомологию с другими F-BAR-белками. Исследования in vitro показали, что, в отличие от дру гих F-BAR-белков, Nwk вызывает образование кле точных выступов, а не инвагинаций (рис. 4А) [91]. Для изучения взаимодействия F-BAR-домена Nwk с мембраной была построена его модель по го мологии с известной кристаллической структурой гомологичного F-BAR-домена FCHO2, имеющая специфическую S-образную форму [92] (рис. 4Б). Мы использовали электронную микроскопию для из учения способов организации F-BAR-доменов белков Cip4 и Nwk на липидах и обнаружили, что F-BAR домены Cip4, как и ожидалось, собирались в линей ные филаменты, а F-BAR-домены Nwk образуют V-образные, N-образные и зигзагообразные струк туры более высокого порядка [92]. Важно, что в от сутствие липидов такие структуры не наблюдались. На основании полученных результатов предло жен механизм взаимодействия Nwk с мембранами. Зигзагообразные структуры формируют на мембра не «гребешок», геометрия которого зависит от угла между димерами и частоты встречаемости димеров, обращенных вогнутой стороной к мембране. В клет ках этот гребешок может образовывать кольцо, маркирующее участок мембраны, который далее преобразуется в клеточный выступ с помощью ми кротрубочек и актиновых филаментов (рис. 4В) [92]. Важную роль при этом играют концевые участки димера, ответственные за олигомеризацию, и элек тростатические взаимодействия между мембраной и вогнутой стороной F-BAR [92]. Формирование вы ступов также требует полимеризации актиновых филаментов, однако уже сформированные выступы не реагируют на обработку ингибитором полимери зации актина латрункулином B. Это указывает на то, что актин необходим только для их формирования [93]. Интересно, что возникшие выступы отлича ются по структуре от филоподий, поскольку кроме актиновых филаментов содержат микротрубочки. Обработка нокодазолом, деполимеризатором микро трубочек, также не приводит к разрушению высту пов. Очевидно, что функционирование Nwk в нейро нах обеспечивается не только его F-BAR-доменом, но и двумя SH3-доменами, каждый из которых свя зывается с определенными белками. В рециркули рующих эндосомах Nwk взаимодействует с белком из группы сортирующих нексинов SNX16, который, в свою очередь, связан с пресинаптическим рецеп тором роста Tkv [94]. Взаимодействие Nwk с SNX16 приводит к понижению сигнала от Tkv и необходи мо для возвращения рецептора на мембрану. Кроме того, Nwk связывает белки-регуляторы эндоцито за Dap160, динамин и Wsp. Опыты с мутантными SH3a- и SH3b-доменами показали, что SH3a связы вает динамин и Wsp, а SH3b отвечает за связывание с Dap160 [95]. Wsp активирует Arp2/3-комплекс, который запускает полимеризацию актина, необхо димую для осуществления эндоцитоза [96]. Однако Nwk активирует Wsp значительно слабее, чем SH3 доменные белки млекопитающих, например, Nck активируют WASP [97]. Усиление эффекта дости гается за счет совместного действия Nwk с другим активатором Wsp, GTP-азой Cdc42. Таким образом, посредством SH3-доменов Nwk взаимодействует с эндоцитарным аппаратом и вместе с Cdc42 активи рует Wsp/Arp2-3-зависимую полимеризацию актина для регуляции синаптического роста. Другая важная функция SH3-доменов Nwk - ре гуляция активности F-BAR. Показано, что SH3b домен связывается с F-BAR, однако это не приводит к потере способности последнего связываться с мем браной, а лишь повышает количество отрицательно заряженных липидов, необходимое для связывания [10]. При этом как сам F-BAR-домен, так и полно размерный белок модифицировали гигантские ли посомы, однако слишком большой негативный за ряд препятствовал деформации мембраны [10]. Одним из возможных объяснений может служить то, что при меньшей концентрации ФИ(4,5)Ф2 боль шая часть F-BAR-доменов оказывается связанной с мембраной вогнутой стороной, что способствует де формации. С другой стороны, не исключено, что при чиной является изменение свойств самой мембраны. Увеличение концентрации ФИ(4,5)Ф2 в мембране приводит к возрастанию упорядоченности липидов, которое характеризуется выпрямлением углеводо родных хвостов, возрастанием толщины бислоя, по нижением коэффициента латеральной диффузии и т.д. [98, 99]. Образование таких липидных микродо менов может препятствовать деформации мембраны или динамичному перемещению белков, необходи мому для формирования олигомеров [100]. Состав мембраны сходным образом способен регулировать и другие BAR-доменные белки: повышенное содер жание ФИ(4,5)Ф2 подавляет деформирующую мем брану активность F-BAR-домена FBP17 в опытах in vivo [101]. Ранее считалось, что связывание SH3 доменов с F-BAR приводит к полному автоингибиро ванию, которое снимается либо связыванием с дру гими белками [102], либо повышением негативного заряда в мембране [103]. Пример Nwk, однако, указывает на более сложный механизм, который требует дальнейших исследований. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Получение кристаллических структур BAR-доменов позволило описать механизмы изменения формы мембран на молекулярном уровне, а с помощью ис следований in vitro и метода электронной микроско пии удалось объяснить, каким образом схемы олиго меризации BAR-доменов приводят к формированию различных мембранных структур. Показано как ак тивность некоторых белков семейства BAR может регулироваться внутри- и межбелковыми взаимо действиями, а также за счет чего может достигать ся специфичность привлечения белков-партнеров. Однако, несмотря на значительное продвижение в понимании роли BAR-доменных белков в жизнеде ятельности клетки, многие проблемы остаются нере шенными. Учитывая, что изменения уровня экспрес сии и мутации в генах, кодирующих BAR-доменные белки, связаны со множеством серьезных заболева ний, исследования в этой области представляют со бой интерес не только для биологии, но и для меди цины.

Об авторах

T. Б. Станишнева-Коновалова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: sokolova184@gmail.com
Россия

Н. И. Деркачева

Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова

Email: sokolova184@gmail.com
Россия

С. В. Полевова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: sokolova184@gmail.com
Россия

O. С. Соколова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: sokolova184@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы