Тканевая инженерия опухолей с использованием биореакторных технологий

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Метод культуры клеток и тканей in vitro является традиционным инструментом исследований в обла сти биологии рака и создания новых методов про филактики, диагностики и лечения этого класса за болеваний. Первичные и линейные клетки опухолей человека и животных представляют собой чрезвы чайно удобный объект для изучения молекулярных и клеточных механизмов злокачественного роста и оценки эффектов лекарств. Однако около 95% пре паратов, проявивших хороший противоопухолевый эффект в экспериментах на клеточных культурах и лабораторных животных, во время клинических испытаний обнаруживают недостаточную эф фективность или неприемлемую токсичность [1]. Возможным и правдоподобным объяснением явля ется недостаточная релевантность существующих in vitro и in vivo моделей рака по отношению к сложным по структуре, гетерогенным по клеточному составу и постоянно изменяющимся во времени реальным опухолям человека [1-3]. К числу важнейших факторов, сопровождающих эксперименты на традиционных культурах клеток в монослое (2D), относятся селекция специфиче ского, адаптированного к росту на культуральном пластике фенотипа клеток из первоначально край не гетерогенной опухолевой клеточной популяции, аномальная поляризация клеток, связанная с огра ниченной экспозицией поверхности клеток к куль туральной среде, резкое сокращение клеточно-кле точных контактов, отсутствие клеточно-матриксных взаимодействий и метаболических градиентов [4-6]. В совокупности это приводит к невозможности вос произведения в 2D-культуре таких критически зна чимых в биологии рака явлений [7], как гетероген ность клеточных популяций, формирующих опухоль, взаимодействие опухоли с ее микроокружением и организмом в целом (рис. 1). Модели рака на лабораторных животных также не лишены недостатков. Так, при использовании одного из наиболее популярных подходов - моде лировании человеческих опухолей на мышах путем имплантации клеточных аллографтов - гистологи ческие особенности неоплазий человека воспроизво дятся не вполне точно или не могут быть воспроиз ведены вообще (рис. 2А-Г). Кроме того, срок жизни лабораторных животных, как правило, меньше пери ода возникновения метастазов [8]. Относительно при ближенной к реальности моделью опухолей человека являются ксенографты, полученные из опухолевой ткани пациентов и трансплантируемые мышам с по давленной иммунной системой (nude, SCID) [10, 11]. Такие модели относительно адекватно отражают структуру и функционирование опухоли человека на тканевом уровне (рис. 2Д,Е), а организм-носитель выполняет такую же роль, которая отводится пита тельной среде в культурах in vitro. В то же время фи зиология бестимусных или SCID мышей значительно отличается от человеческой, а значительная стои мость и низкая воспроизводимость моделей ограни чивают возможности их применения. Стремление более точно воссоздать гистоло гическое строение и поведение опухолей привело к разработке технологий сокультивирования кле ток различных типов и созданию трехмерных (3D) моделей опухолей. К числу последних относятся многоклеточные сфероиды, а также культуры рако вых клеток на матрицах различного состава и стро ения (гелевых, волокнистых и др.). Один из наибо лее перспективных подходов - тканевая инженерия опухолей (ТИО) - новый метод 3D-моделирования злокачественных новообразований, основанный на создании комплексных конструкций, включа ющих в себя малигнизированные клетки, плотные пористые или волокнистые клеточные носители скаффолды, играющие роль внеклеточного матрик са, а также другие компоненты опухолевого микро окружения. Тканеинженерные модели опухолей (ТМО) предназначены для изучения биологии рака и разработки методов диагностики и терапии злока чественных новообразований. Основные принципы ТИО, ее преимущества, ограничения и реализован ные модели подробно обсуждаются в нескольких об зорах [8, 13-19]. Как следует из приведенного выше определения, ТИО базируется на принципах тканевой инженерии (ТИ) нормальных тканей в части комбинирования определенных клеток и скаффолдов с последующим управлением ходом развития полученных тканеин женерных конструкций (ТИК) [20], но служит для ре шения не лечебных, а исследовательских задач. В общем случае тканеинженерная модель здоровой ткани представляет собой 3D-культуру нормаль ных клеток на скаффолде - ТИК, которая «собира ется» и «созревает» in vitro и затем имплантируется в организм пациента для замещения поврежденных или утраченных тканей или органов. После этого должно произойти приживление реконструирован ной структуры, обеспечивающее ее жизнеспособное состояние и выполнение поставленной функциональ ной задачи. Очень часто ТИК, применяемые в регене ративной медицине, представляют собой временные функциональные тканевые или органные протезы, которые впоследствии должны подвергаться биоре зорбции и полному замещению собственными тка нями организма. Раковые ТИК, напротив, должны включать, в первую очередь, малигнизированные клетки, длительно существовать и обладать струк турным и функциональным сходством с моделируе мыми опухолями уже в условиях in vitro, поскольку именно на этом этапе они могут быть использованы в качестве объектов исследований. Опухолевые ТИК также могут быть имплантированы в организм ла бораторных животных, например, с целью изуче ния ангиогенного, инвазивного и метастатического потенциала, однако, использование подобных био искусственных тканей in vitro представляется наи более привлекательным с точки зрения возможности улучшения воспроизводимости результатов, созда ния высокопроизводительных тест-систем для фар макологических тестов, а также сокращения объема экспериментов на животных. Различия в скорости роста, дифференцировке и обмене веществ между нормальными и раковыми клетками позволяют обойти типичную для регене ративной медицины проблему наращивания кле точной популяции в составе ТИК (например, в ходе управляемой дифференцировки стволовых клеток). С другой стороны, эти обстоятельства обусловлива ют необходимость создания новых методов и систем 3D-культивирования, позволяющих формировать и поддерживать объемные, метаболически активные тканевые структуры вне организма, а значит, в от сутствие нормальных систем гомеостаза. Подобная по сложности задача в определенной мере решается в современных системах временного хранения и жиз необеспечения донорских органов. В тканевой инженерии для выращивания ТИК и их поддержания в жизнеспособном состоянии до имплантации используются биореакторы (БР) [21] - инженерные системы, предназначенные для автоматизации процессов культивирования кле ток и тканей in vitro и обеспечивающие оптималь ные для развития ТИК физико-химические условия. Задачей настоящего обзора является анализ совре менного состояния тканеинженерного моделирова ния злокачественных опухолей с использованием биореакторных технологий. КОМПОНЕНТЫ ОПУХОЛЕВЫХ ТИК Главными компонентами ТИК являются клетки и скаффолды (рис. 3). Клетки могут быть представ лены одним или несколькими типами одновременно (например, гепатоцитами и фибробластами при мо делировании печени), однако, тканевую специфич ность ТИК определяет наиболее многочисленная клеточная популяция. В частности, основу клеточ ного компонента опухолевых ТИК могут составлять как первичные клетки, выделенные из биопсийных фрагментов опухоли (из исходного или метастати ческого очага), так и линейные раковые клетки, по лученные путем специальных процедур селекции и культивирования. Могут подбираться клетки раз личной степени дифференцировки, а также с раз личным метастатическим потенциалом. Помимо опу холевых клеточных популяций, в состав ТМО также могут включаться стромальные элементы (фибро бласты, перициты, эндотелиальные и гладкомышеч ные клетки), основные клетки резидентного органа (например, гепатоциты при моделировании опухо левого поражения печени или остеобласты и клетки костного мозга при исследовании неопластических процессов в костях), клетки воспалительного ин фильтрата (макрофаги, лимфоциты, нейтрофилы, плазматические клетки, эозинофилы) [22]. Скаффолды, представляющие собой биоактивные матрицы, выполняющие роль внеклеточного матрик са, не только служат механической опорой для кле ток, но также влияют на их адгезию и подвижность (что включает серию сигнальных путей, чувстви тельных к организации цитоскелета), обеспечивают механическую и биохимическую интеграцию кон струкции, стимулируют необходимую дифференци ровку (в ТИК нормальных тканей) или поддержива ют заданный фенотип и функциональную активность клеток. Архитектура скаффолдов обеспечивает фор мирование градиентов сигнальных молекул и кис лорода в ТИК, дает возможность изучения роли клеточно-матриксных взаимодействий в регуляции канцерогенеза с учетом взаимного влияния механи ческих факторов, нанорельефа, геометрии матрикса и адгезии клеток [24]. Для создания скаффолдов используются волокни стые и пористые материалы, изготовленные из син тетических полимеров (например, полилактата, поликапролактона, полилактогликолида) или ма териалов натурального происхождения (коллагена, хитозана, гиалуроновой кислоты) [17], а также специ альным образом обработанные натуральные ткани и органы [25, 26]. Важнейшим преимуществом син тетических скаффолдов, создаваемых с помощью инженерных методов, таких, как электроспинниг, 3D-печать и т.п., является высокая степень опреде ленности химического состава и возможность тонкого контроля пространственной организации и механи ческих свойств, что позволяет изучать влияние еди ничных сигнальных факторов на морфогенез ткани. Однако зачастую подобные скаффолды без допол нительной модификации не поддерживают в необ ходимой степени адгезию и продолжительную про лиферацию клеток. Кроме того, они обладают лишь отдаленным сходством с оригинальной моделируе мой тканью и, в сущности, являются, пусть и суще ственно улучшенным, 3D-аналогом культуральных емкостей. Скаффолды, изготавливаемые из полиме ров натурального происхождения, характеризуются высокой биосовместимостью, но при этом возмож ности точного контроля их состава, управления их геометрией и биомеханическими свойствами лими тированы [17]. Альтернативный подход предполагает обработку натуральных тканей или органов с удалением всех клеточных элементов и максимальным сохранением состава и структуры внеклеточного матрикса. Этот процесс называется децеллюляризацией (ДЦЛ), а получаемые скаффолды - децеллюляризирован ными тканями, или бесклеточными матриксами, тканями или органами (ДЦЛ-матрикс, ДЦЛ-ткань, ДЦЛ-орган) [26, 27]. Таким образом, ДЦЛ обеспечи вает получение скаффолдов, весьма близко к реаль ности воспроизводящих естественное микроокруже ние клеток в составе ткани или органа. Современные методы ДЦЛ позволяют создавать скаффолды, содержащие не только компоненты внеклеточно го матрикса, такие, как, например, коллагеновые и эластические волокна, но также и поддерживать целостность базальных мембран кровеносных со судов, что обеспечивает формирование единой сети «протососудов» (децеллюляризированных стенок кровеносных сосудов различного калибра), которые позднее могут быть использованы для питания соз даваемой биоинженерной ткани. Эта возможность принципиально важна, поскольку проблема питания внутренних областей ТИК является одной из наибо лее сложных в тканевой инженерии в целом и крити чески значимой для ТИО. ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ «СБОРКИ» И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЕЙ, ТРЕБУЮЩИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОРЕАКТОРОВ Биореакторы - это замкнутые системы, в которых биологические процессы протекают при строго кон тролируемых условиях [28]. Эта концепция не явля ется чем-то принципиально новым и не ограничи вается тканевой инженерией. Биотехнологи давно используют БР (хемостаты, ферментеры) для выра щивания культур микроорганизмов и получения раз личных клеточных продуктов. Типичная биореактор ная система включает в себя емкость, изолированную от влияния внешней среды (колбу, сосуд, камеру), исполнительные устройства (насосы, двигатели и т.д.), датчики, а также, очень часто, специальные контроллеры и программное обеспечение для управ ления биотехнологическим процессом или слежения за его ходом. В БР, предназначенных для ТИ, выра щивают клетки и ТИК, а также исследуют влияние биохимических и биомеханических факторов на раз витие клеток и тканей. В процессе «сборки» опухоле вых ТИК и их дальнейшего культивирования in vitro можно выделить несколько ключевых проблем, оп тимальное решение которых требует использования биореакторных технологий. Наращивание клеточных популяций Размеры ТМО могут варьировать от нескольких куби ческих миллиметров до масштаба целого органа чело века или животного, но в любом случае число необхо димых клеток всегда многократно превышает объем типовых клеточных культур в монослое. Поэтому первым шагом при создании опухолевой ТИК явля ется наращивание необходимого количества клеток заданных типов, что требует значительной площади поверхности, на которой они могут расти. Для сокуль тивирования нескольких типов клеток часто необхо дима их одновременная экспансия в разных условиях. В ряде случаев клеточные популяции для создания ТИК выращиваются в форме многоклеточных сферо идов, что также требует специальных условий куль тивирования. Роль БР при решении этих задач состо ит в автоматизации и улучшенном контроле процесса культивирования клеток. Рецеллюляризация скаффолдов Второй шаг в создании ТИК состоит в заселе нии 3D-скаффолдов клетками - рецеллюляриза ции (РЦЛ) [29, 30]. Базовая методика статического культивирования предполагает нанесение клеток на скаффолд с помощью пипеток («раскапывание»), после чего клеточная популяция распределяется в матрице под действием силы тяжести, а также в результате самостоятельного движения клеток. Однако для создания сложных тканей и конструк ций большого объема этот метод малоэффективен: он не позволяет добиться равномерного распределения клеток по объемной структуре, а значит, однородного и контролируемого развития ткани. Обеспечение питания и метаболизма ТИК Третий шаг - доставка веществ, необходимых для роста и функционирования клеток, и удаление продуктов метаболизма. Именно обеспечение контро лируемого и оптимального по характеру воздействия на ткань массопереноса является самой важной целью биореакторных технологий [28]. В статиче ской культуре in vitro это достигается периодиче ской заменой питательной среды, но данный способ подходит лишь для экспериментов с небольшими по объему объектами культивирования (клетками в монослое или суспензии, тонкими срезами тканей). Известно, что диффузионный предел для кислорода в тканях организма человека составляет примерно 100-200 мкм [31]. При формировании ТИК без посто янного перемешивания или «прокачивания» среда достигает клеток лишь путем диффузии, а потому центральная часть конструкции получает недоста точно кислорода и питательных веществ, а удаление продуктов метаболизма происходит слишком мед ленно, что приводит к гипоксии, ацидозу и гибели клеток. Улучшают массоперенос конвекционные по токи жидкости, поэтому предпочтение должно быть отдано динамическим системам. Однако слишком активная динамика питательной среды может вы звать повреждение клеток и скаффолда вследствие сдвигового напряжения [32] из-за неравномерной динамики разных слоев жидкости. Соответственно важно соблюдать баланс между диффузионным и конвекционным транспортом, с одной стороны, и биомеханическими свойствами и метаболическими потребностями выращиваемых структур, с другой. Перспективным подходом к решению задачи транс порта кислорода в ТИК представляется использо вание БР со встроенными системами перфузии. Учитывая сложность работы с ТМО, процесс посто янной подачи свежей культуральной среды к ТИК и удаления продуктов метаболизма желательно ав томатизировать и, в идеальном случае, контролиро вать в масштабе реального времени с помощью кон туров обратной связи по биохимическим параметрам культуральной среды. Контроль параметров состояния содержимого культуральной камеры БР Длительное поддержание стерильности критически важно для ТИО. Поскольку созревание модельной ткани может продолжаться в течение нескольких месяцев, контаминация ТИК практически однознач но означает потерю результатов длительной работы. Кроме того, материалы культуральной камеры БР должны быть биосовместимыми и биоинертными, т.е. не воздействовать на культивируемую ткань. В то же время эти материалы должны быть рассчитаны на применение во влажной среде при температуре 37°C, а при необходимости повторного использова ния выдерживать стерилизацию путем автоклави рования, радиационной или химической обработки. Изготовление камеры БР из прозрачного материа ла обеспечивает возможность визуального контроля и использования оптического имиджинга ТИК [21, 33, 34]. Контроль над физико-химическими параметра ми среды, формирующейся в культуральной ка мере, и управление ими важны, с одной стороны, для поддержания жизнеспособности ТИК, а, с дру гой, для моделирования условий, характерных для внутренней среды опухолей, таких, как ацидоз, гипоксия и повышенное тканевое давление [35, 36]. Для исследовательских целей может возникнуть не обходимость в регуляции температуры, рН и газового состава среды в культуральной камере, могут потре боваться внесение/удаление тех или иных сигналь ных молекул, дозируемое механическое воздействие на формирующиеся ткани (давление, растяжение, изгиб и др.), создание особой электромагнитной сре ды или электрической стимуляции ТИК и др. [37]. ТИПЫ БИОРЕАКТОРОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ТИО Большинство БР влияют на ТИК через воздействие на культуральную среду. Выделяют шесть типов БР (табл. 1): 1) БР со статическими системами культи вирования, 2) перемешивающие, 3) роторные, 4) по ристо-волоконные, 5) перфузионные или 6) микро флюидные БР. Кроме того, имеется особый класс БР, воздействующих на компоненты ТИК непосред ственно - механически, с помощью электромагнит ных и иных стимулов (они рассмотрены ниже в соот ветствующем разделе). Ниже рассмотрены примеры использования раз личных типов БР в ТИО. Мы сочли необходимым в качестве дополнительных ключевых слов приве сти англоязычные названия типов биореакторов и их конструктивных элементов из-за отсутствия соот ветствующих общепринятых терминов в русском языке. СТАТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В ТИО Первыми в тканевой инженерии начали использо вать статические БР - обычные чашки Петри, фла коны и планшеты, в которых объекты культивирова ния и культуральная среда находятся в неподвижном состоянии. Культуральные емкости могут быть до полнены пористыми и волокнистыми скаффолдами, а также специальными сетчатыми вставками с опре деленным размером пор, что позволяет изучать эф фекты сигнальных факторов с заданным размером молекул/носителей, миграционную и инвазионную активность клеток. В планшетах со специальными низкоадгезивными покрытиями или «гравитацион ными ловушками» можно получать многоклеточные сфероиды. Однако общей чертой статических систем культивирования является то, что массообмен в них происходит исключительно под действием силы тя жести и диффузии. Существенное преимущество статических БР - их коммерческая доступность и простота использования. Такие комплексы особен но востребованы при проведении высокопроизводи тельного скрининга фармакологических композиций. С помощью статических БР созданы тканеинже нерные модели рака молочной железы, легких и ки шечника, саркомы Юинга, метастатического рака предстательной железы и ряда других неоплазий (табл. 2). Однако в отсутствие активного движения культуральной среды обычно удается поддержи вать ТИК только на мембраноподобных скаффолдах толщиной до 1 мм. В более толстых матрицах рост клеток происходит преимущественно на поверхности скаффолда. Например, мы наблюдали такой эффект при статическом культивировании опухолевых кле ток и нормального эпителия на срезах ДЦЛ-органа (почки) кролика [39] толщиной 3-4 мм, а также при РЦЛ трубчатой бесклеточной сосудистой матри цы [40] и гибридных скаффолдов [41] клетками бук кального эпителия. Преодолеть многие ограничения, характерные для статических схем культивирования, позволяют БР, в которых культуральная среда находится в дви жении (динамические культуральные методики). ПЕРЕМЕШИВАЮЩИЕ БИОРЕАКТОРЫ Перемешивающие БР (spinner-flask bioreactor, spinner vessel, stirred tank) обеспечили качествен ный скачок в улучшении массообмена между клет ками и культуральной средой. БР такого типа чаще всего представляет собой емкость со встроенным вращающимся элементом - спиннером (длинной ло паточкой), создающим вихревые потоки жидкости, обеспечивая динамическое перемешивание среды и массообмен между ней и тканью или скаффолдом. К перемешивающим БР можно отнести и системы, в которых перемещение среды вокруг скаффолда, ткани или ТИК создается движением самих куль туральных емкостей. Примером могут служить роллерные флаконы (roller bottles) и классические культуральные сосуды, помещенные на качающи еся, встряхиваемые или вращающиеся автомати ческие платформы (шейкеры). В перемешивающих БР клеточные слои, фрагменты тканей, скаффолды или ТИК размещаются либо на специальных иглах, либо непосредственно на внутренних поверхностях культуральных сосудов. При этом ткани/скаффолды могут быть полностью погружены в жидкость, на ходиться на границе раздела жидкой и газовой фаз или попеременно погружаться в культуральную сре ду и газовую фазу. Сейчас перемешивающие БР используются преи мущественно для наращивания клеточной массы (го раздо более эффективного, чем в монослое [51]), в том числе в форме культур на микроносителях и в виде многоклеточных сфероидов. За счет лучшего пита ния клеток можно получить крупные сфероиды [52]. Интересны также работы по получению гетеросфе роидов - сокультур опухолевых и нормальных кле ток. Так, с помощью перемешивающего БР получены гетеросфероиды, состоящие из клеток плоскокле точного рака головы и шеи и мононуклеарных клеток периферической крови [53]. Исследование фарма кологических эффектов Катумаксомаба на моделях в форме сфероидов адекватно отражает свойства микрометастазов этих опухолей. Cфероиды, полу ченные из клеток опухолей мозга человека, глиомы и астроцитомы, высеивали на пористо-волокнистые скаффолды из полимолочной кислоты и культиви ровали в планшетах на орбитальном шейкере в ус ловиях гипоксии [54]. Оказалось, что в 3D-среде клетки приобретают повышенную устойчивость к проапоптотическим факторам. Гипоксия спо собствовала усилению резистентности к действию цитостатиков и в монослойных культурах, но мо лекулярные противоапоптотические механизмы в 2D- и 3D-культурах были различными. С помощью гибридной системы «планшет-на-шейкере» удалось обнаружить активацию сигнальных путей регуляции ангиогенеза и уменьшение чувствительности клеток к химиотерапевтическим противоопухолевым пре паратам в 3D-культурах, помещенных в комплекс ный скаффолд из полилактогликолевой кислоты и матригеля [55]. Использование перемешивающего БР в эксперименте с клетками остеосаркомы позво лило получить убедительные доказательства пре имуществ сложных ТМО на плотных скаффолдах (fibrous-bed) перед культурами опухолевых клеток на микроносителях, по-видимому, из-за уменьшения эффектов сдвигового напряжения [56]. ТИК из кле ток остеосаркомы и пористо-волокнистого носителя были стабильными в культуре более 1 месяца. На 4-е сутки деление клеток останавливалось, но доля апоп тотических клеток не превышала 15%. Перемешивающие БР также применяются для ДЦЛ и РЦЛ. Как правило, в БР данного типа осуществляется ДЦЛ небольших тканевых фраг ментов. В нашей недавней работе [39] мы показали, что системы типа «флакон-на-шейкере» также могут применяться и для ДЦЛ целых органов лаборатор ных животных. Эффективность перемешивающих БР в отношении заселения и питания клеток выше, чем у статических, но по-прежнему недостаточна для ТИК значительного объема. Кроме того, куль туральная среда все же не очень хорошо проникает внутрь конструкции, поэтому, вследствие диффу зионных ограничений, клетки в основном распре деляются по периферии скаффолда. Возможность увеличения вклада конвекции за счет скорости вра щения спиннера или самого культурального сосуда ограничена, поскольку это приводит к повреждениям тканей при росте сдвиговых напряжений (> 15 дин/ см2) [51, 57]. Потенциал применения перемешивающих БР в тканевой инженерии опухолей пока не реализован в полной мере, хотя эти системы имеют ряд важных преимуществ. Среди них - вариабельность объема культуры, работа с разными типами моделей, на личие гидродинамических расчетных моделей [34], возможность взятия проб культуральной среды и на блюдения за состоянием ТИК. РОТОРНЫЕ БИОРЕАКТОРЫ Роторные БР (rotating-wall bioreactors, NASA bioreactors; RWV; RCCSTM; HARV; STLV; RWPV), первоначально разработанные NASA для экспери ментов в космосе, представляют собой полностью за полненные культуральной средой цилиндрические емкости с вращающимися стенками. Горизонтальный (RWV) [58] и вертикальный (HARV) [59] роторные БР вращаются вокруг горизонтальной или вертикаль ной центральной оси, тогда как кислород подается через неподвижную осевую мембрану или аналогич ную мембрану в основании цилиндра соответствен но. В этих реакторах питательная среда заменяется вручную через технологические отверстия. В ротор ном БР с перфузией (RWPV или STLV) культураль ная среда циркулирует в замкнутом контуре и за меняется непрерывно, что позволяет на протяжении многих месяцев автоматически поддерживать необ ходимый уровень кислорода, кислотности и темпе ратуры. RWPV состоит из двух цилиндров, причем внутренний, одновременно представляющий собой газообменную мембрану, также может вращаться. Питательная среда и ТИК находятся в кольцевом пространстве между цилиндрами [60]. В роторных БР скаффолды или ТИК свободно пе ремещаются в культуральной камере, полностью за полненной питательной средой. Скорость вращения цилиндров (примерно 15-40 об/мин) подобрана так, чтобы обеспечить баланс между гравитацией и силой гидродинамического сопротивления, действующи ми на скаффолды/ТИК, благодаря чему последние постоянно находятся в состоянии свободного паде ния. Динамическое ламинарное (а не турбулентное, как в перемешивающих БР) течение культуральной среды позволяет эффективно обходить диффузион ные ограничения на доставку питательных веществ и удаление отходов. Роторные системы обеспечивают более однородное распределение клеток, чем стати ческая культура, и лучший обмен веществ, чем пере мешивающий БР. Для компенсации массы растущей ткани скорость вращения постепенно увеличивают, чтобы уравновесить силу гравитации и гарантиро вать пребывание ТИК в «подвешенном» состоянии. С помощью роторного БР обнаружили глобальные различия в воздействии 2D- и 3D-микроокружения на экспрессию генов гепатоцеллюлярной карциномы. В многоклеточных сфероидах, достигавших за 72 ч диаметра 100 мкм, а при длительном культивирова нии выраставших до 1 мм, клетки линии HepG2 де монстрировали усиление экспрессии метаболических и синтетических генов, тогда как в 2D наблюдалась активация генов, кодирующих белки внеклеточного матрикса, цитоскелета и молекул клеточной адгезии. Кроме того, в сфероидах клетки рака печени долго сохраняли высокую активность цитохрома Р450 и продуцировали альбумин, а в монослойной культу ре эти признаки быстро деградировали [61]. Интересные результаты получены при работе с сокультурами опухолевых и нормальных клеток с использованием роторного БР. Так, клетки адено карциномы кишечника (линии HT29 и HT29KM) в мо нокультуре формировали сфероиды, а в присутствии нормальных фибробластов конкурировали с ними за субстрат прикрепления, и их рост сначала ограни чивался. Затем клетки опухоли начинали усиленно делиться и формировали объемные тканевые массы размером до 1.5 см, по строению напоминающие крип ты здорового кишечника. Слой клеток, непосредствен но контактирующих с поверхностью микроносителя, был образован юными мезенхимальными клетками. Некротические изменения в таких 3D-культурах практически не отсутствовали [62]. При сокульти вировании в роторном БР клеток рака молочной железы (линии UACC-893, BT-20 и MDA-MB-453) с фибробластами наблюдалось формирование гисто идов - многоклеточных сфероидов из фибробластов с инвазивным врастанием раковых клеток [63]. Особо крупные гетеросфероиды (диаметром до 1 см) удалось получить в роторном БР HARV из иммортализиро ванных нормальных кератиноцитов кожи человека HaCaT и клеток разных линий меланомы (B16-F10 мыши и SKMEL-5 человека) [64]. На этой биомиме тической 3D-модели меланомы продемонстрирована техника трансфекции клеток плазмидами, кодирую щими GFP и IL-15, обеспечивающая высокую воспро изводимость результатов доставки генов. С помощью ротационного БР изучали также взаимодействие кле ток рака предстательной железы, остеоцитов и стро мы костной ткани в 3D-модели [65]. Эксперимент по получению с использованием ро торного БР сфероидов из клеток рака предстатель ной железы разной степени зрелости позволил вы явить значительные различия в их пространственной организации и пролиферативной активности в за висимости от количественного соотношения дан ных клеточных типов [66]. Это, как полагают авто ры, указывает на влияние дифференцировки клеток на плотность упаковки в сфероидах и, как следствие, на эффективность массопереноса между клеточным агрегатом и культуральной средой. Потенциальные ограничения использования ро торных БР связаны с генерацией потокового сдви гового напряжения (диапазон 0.5-2 дин/см2) [67]. Эффективность и безопасность роторных БР можно повысить, комбинируя их с реакторами, работающи ми на других принципах [68]. ПЕРФУЗИОННЫЕ (ПРОТОЧНЫЕ) БИОРЕАКТОРЫ Перфузионные БР (perfusion bioreactors) позво ляют наиболее точно воссоздавать процессы мас сопереноса в живом организме. Типичный перфу зионный БР состоит из насоса и инкубационной камеры, соединенных гибкими трубками в систему с открытым или закрытым контуром. Насос созда ет небольшое избыточное давление, обеспечивая постоянный ток жидкой среды через ткани и скаф фолды. Перфузионные БР могут использоваться как для ДЦЛ, так и для РЦЛ. При перфузионной ДЦЛ растворы детергентов или других веществ, спо собствующих отделению, разрушению и удалению собственных клеток ткани, поступают через есте ственные кровеносные сосуды, которые подключа ются к проточному контуру. В ходе РЦЛ клеточная суспензия подается через децеллюляризованные сосудистые сети обрабаты ваемой ткани/ТИК или через иные пустоты скаф фолда. При этом достигаются более гомогенное рас пределение клеток в матрице и лучший транспорт жидкостей, чем с использованием перемешивающих и роторных устройств [69-72], что позволяет соз давать и длительно поддерживать более крупные ТИК [72, 73]. Выживаемость клеток на скаффолдах, перфузируемых с помощью БР данного типа, суще ственно выше, чем в статической культуре или пе ремешивающем БР [74]. Изменение скорости тока среды в БР позволяет контролировать как сдвиго вые напряжения, связанные с движением жидкости, так и локальное распределение кислорода в ТИК [75]. В то же время, хотя перфузионные БР контролируют массообмен лучше прочих, проблема неоднородной доставки необходимых веществ до конца не решена. Это особенно характерно для скаффолдов с порами, размер которых варьирует в широком диапазоне, а также для тканей с неравномерной скоростью ро ста, в результате чего некоторые участки получают недостаточное питание, а другие избыточное [70]. Перфузионные БР критически важны для цело органной тканевой инженерии - создания ТИК в масштабе целых органов [30, 76] путем последова тельных процессов ДЦЛ и РЦЛ. К таким реакторам предъявляются особенно строгие требования по обе спечению контроля над параметрами тока культу ральной среды/клеточной суспензии, стерильности, температурного режима и возможности мониторин га обработки органа и формирования органной ТИК [76-80]. Перфузионные БР активно используются для ре конструкции нормальных тканей и органов, но соз дание с их помощью ТМО только начинается. Так, предложена модель колоректального рака, полу ченная с помощью коммерчески доступного пер фузионного БР [81]. Клетки линии HT-29 культи вировали традиционным способом в монослое либо высеивали на коллагеновые губки и поддерживали в статической 3D-культуре или перфузионном БР. Дополнительный контроль обеспечивали опухолевые ксенографты, полученные на бестимусных мышах с использованием той же линии клеток. В перфузи онной культуре клетки характеризовались гораз до более высокой скоростью пролиферации и зна чительно более однородным распределением, чем в статической объемной культуре. Морфологически и фенотипически получаемые ТИК были подоб ны опухолям, развившимся из имплантированных клеток. Сильная корреляция между перфузионны ми 3D-культурами и опухолевыми ксенографтами наблюдалась и в профилях экспрессии генов, регу лирующих апоптоз и ответ на гипоксию. Сравнение эффектов 5-фторурацила и ABT-199, ингибитора ан тиапоптотического гена BCL-2, показало принципи альное различие клеточных ответов в 2D и 3D ТИК. В той же статье описано получение ТИК на колла геновых скаффолдах с использованием клеток рака прямой кишки (SW480 и DLD-1), предстательной же лезы (PC-3), немелкоклеточного рака легкого A549 и рака молочной железы (BT-474). Сложная ТИ-модель шванномы (нейрофибро саркомы) была создана немецкими учеными с при менением специально сконструированного БР [82]. Выделенный фрагмент кишечника свиньи подвер гали чередующейся перфузионной ДЦЛ через бры жеечную артерию и просвет кишки и иммерсионной ДЦЛ на качающейся платформе, а затем получен ный матрикс стерилизовали гамма-излучением. Потом ДЦЛ-матрикс фрагмента кишечника разре зали вдоль длинной оси, а полученную мембрану на тягивали между двумя металлическими кольцами и помещали в камеру перфузионного БР. На скаф фолд высеивали первичные кожные фибробласты и линейные опухолевые клетки шванномы S462 (на апикальную поверхность) и эндотелиальные клет ки микрососудов (на базолатеральную поверхность кишечного сегмента). ТИК в перфузионной куль туре поддерживали около 2 недель при постоянном или пульсирующем токе культуральной среды. Недавно с помощью технологий перфузионной ДЦЛ-РЦЛ органов была получена ТИ-модель рака легких [83]. Разные виды линейных клеток рака лег ких (А549, H460, H1299) высевали путем перфузии клеточной суспензии на децеллюляризированный целоорганный скаффолд, полученный из легких мыши. Целоорганные ТИК перфузировали оксиге нированной культуральной средой и поддерживали ex vivo до 2 недель. Показано формирование макро скопических опухолевых узлов, имеющих собствен ную кровеносную сеть, развитие типичных клеточно клеточных и клеточно-матриксных взаимодействий, формирование типичной структуры и динамику ро ста опухоли, сходные с реальными фрагментами тка ни рака легкого человека. БИОРЕАКТОРЫ НА ПОРИСТЫХ ВОЛОКНАХ БР на пористых волокнах (hollow-fiber bioreactor) - это замкнутый сосуд, заполненный клеточной суспензией в культуральной среде, проницаемыми для среды скаффолдом или комплексной ТИК, в ко торых располагается пучок взаимно параллельных полупроницаемых полых волокон, имитирующих кровеносные сосуды и обеспечивающих доставку к клеткам питательных веществ и удаление отходов. Основное преимущество таких БР - возможность доставки питательных веществ в толщу растущих тканей. Сейчас они успешно применяются в экспери ментах по культивированию очень чувствительных типов клеток с высоким уровнем метаболизма, таких, как гепатоциты [84], но попытки использовать по добную систему для создания 3D-конструкций пока не увенчались успехом. Выяснилось, что при боль ших плотностях клеток или твердых матриц массо обмен и диффузия кислорода в ней весьма затруд нены. Это приводит к гибели клеток, находящихся на большом расстоянии от волокон, и к утрате струк турной однородности ткани [85]. Для решения задачи была предложена коаксиальная схема БР на полых вставленных друг в друга волокнах, образующих не зависимые компартменты для выращивания клеток [84, 86]. Коаксиальная схема значительно улучшала массообмен, но еще одним серьезным недостатком данных систем является невозможность извлече ния ТИК из БР для последующего использования без разрушения сформированной ткани. В экспериментальной онкологии БР на пористых волокнах применяли для наращивания массы кле ток, получения специфических клеточных продук тов и мониторинга метаболизма опухолевых тканей. Например, культивировали Т-лимфоциты, выделен ные из воспалительного инфильтрата операционных биопсий рака яичников [87]. В коммерчески доступ ном БР получали сфероиды из клеток рака молочной железы (MCF-7) и изучали эффекты разных кон центраций δ-токоферола [88]. Предложена методика мониторинга клеточной плотности и концентрации кислорода в сфероидах с использованием контраст но-усиленной МРТ [88]. Также с помощью МРТ и БР на пористых волокнах выявлен механизм изменения кажущегося коэффициента диффузии воды (важно го диагностического признака) в ишемизированной ткани мозга, моделью которой служила 3D-культура клеток глиомы крыс [89, 90]. МИКРОФЛЮИДНЫЕ БИОРЕАКТОРЫ Микрофлюидные платформы (microfluidic chips, microfluidic bioreactors) можно считать особой раз новидностью перфузионной схемы конструирова ния и изучения биологических объектов с количе ством клеток порядка 102-103. На стеклянную основу по многостадийной технологии наносится слой био совместимого кремнийорганического вещества (по лидиметилсилоксана), организованный в форме ми кроканалов и микроемкостей. Преимущество этого полимера перед традиционным для культуральных работ полистиролом - сочетание высокой проница емости для кислорода и других газов с практически полной непроницаемостью воды [91]. В микрофлюид ных БР массообмен с клетками, растущими в микро емкостях, заполненными гидрогелем или непосред ственно в элементах чипа, осуществляется за счет перфузии культуральной среды через микроканалы. Вариативность и адаптируемость микрофлюидных систем к решению самых разных задач обуславлива ют активное развитие технологий «орган-на-чипе», «система органов-на-чипе» и «лаборатория-на-чипе» (“organ-on-a-chip”, “lab-on-a-chip”). Важное пре имущество таких БР - точный контроль над пара метрами потоков питательных сред и возможность оптического имиджинга in situ в реальном времени [92]. Микрофлюидные системы применяют для из учения реакций клеток на действие сигнальных мо лекул, метаболических и физических градиентов, роли интерстициальных потоков жидкости в жизне деятельности ткани, в том числе опухолевой, а также для прецизионной количественной оценки проница емости ТИК для лекарственных препаратов и нано частиц [28, 93-96]. Кроме того, можно моделировать кинетику клеточных популяций, прогрессию, анги огенез, инвазию и разные этапы метастазирования [97-103]. БИОРЕАКТОРЫ С НЕПОСРЕДСТВЕННЫМ ВОЗДЕЙСТВИЕМ НА СКАФФОЛД/ТИК Конструкция БР может предусматривать до зированное воздействие физических факторов на скаффолд или ТИК. Например, объект ТИ может подвергаться действию механических сил, элек трических импульсов или разным видам облучения. Наибольшее развитие получили биореакторные технологии, связанные с биомеханическими иссле дованиями. КОМПРЕССИОННЫЕ БИОРЕАКТОРЫ Компрессионные БР (compression bioreactors) ши роко используются в тканевой инженерии, особен но при изготовлении хрящевых структур. Такие БР состоят из двигателя, системы, обеспечиваю щей линейное смещение, и механизма управления. Нагрузка обычно передается на засеянный клетками скаффолд посредством плоских валиков [104] и обе спечивает специфическую механическую нагруз ку на клетки и усиление тока жидкости через ТИК. В ТИО компрессионные БР могут быть востребова ны для моделирования механизмов формирования костной метастатической ниши. В настоящее время практически не известно, как отвечает метастатиче ская раковая ткань на механическую нагрузку [105]. При исследовании на 3D-культурах клеток рака мо лочной железы (MDA-MB-231) и глиобластомы (U87, HGL21) в компрессионном БР показано усиление экс прессии генов, ответственных за ферментативный лизис белков внеклеточного матрикса, адгезию и ми грацию в ответ на повышенную статическую ком прессию, что соответствует росту метастатического потенциала [106]. БИОРЕАКТОРЫ С МЕХАНИЧЕСКИМ НАТЯЖЕНИЕМ БР с контролируемым механическим натяжением (strain bioreactors) конструктивно похожи на ком прессионные и отличаются от них лишь способом передачи силы на образец. Скаффолды/ТИК закре пляют так, чтобы к ним можно было применить силу натяжения, например, размещают их на резиновой мембране с последующей ее деформацией [107]. В ТИО недавно предложена модель изучения роли механического напряжения внеклеточного матрик са в индукции инвазии 3D-органоидов, полученных путем культивирования трансформированных эпи телиальных клеток в коллагеновом геле разных кон центраций. Гель с включенными в него клеточными агрегатами, ковалентно связанный с полидиметил силоксановой основой, помещали в микрофлюид ный чип с устройством для натяжения этого участка культуральной камеры. Выявлена положительная корреляция между инвазивностью клеток и жестко стью геля, установлено влияние концентрации путем изменения среднего размера пор [108]. БИОРЕАКТОРЫ С ГИДРОСТАТИЧЕСКИМ ДАВЛЕНИЕМ В БР с гидростатическим давлением (hydrostatic pressure bioreactors) механическое сжатие скаф фолдов или ТИК опосредовано периодическим со кращением объема культуральной камеры при по стоянстве объема культуральной среды [109]. Использование БР данного типа пока не получило развития в ТИО, однако, это направление видится нам чрезвычайно перспективным для модерирова ния важнейшей особенности физиологии солидных опухолей - повышенного интерстициального дав ления [36]. БИОРЕАКТОРЫ ДЛЯ ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИИ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ БР для электрической стимуляции (electrical stimulation bioreactors), как правило, используются для моделирования возбудимых тканей. По нашим данным, массового использования таких БР для соз дания 3D-моделей рака пока не было, но появились единичные сообщения о культивировании опухоле вых клеток в гидрогеле в условиях воздействия сла быми электрическими полями (при интенсивности 1.1 В/см и переменной частоте 150 и 200 кГц) в ги бридном устройстве, созданном на основе микро флюидного чипа [110]. Наблюдали изменение мор фологических характеристик клеток рака легкого (линия A549) и рака молочной железы (линия MDAMB- 231), уменьшение скорости пролиферации обе их линий опухолевых клеток и признаки снижения метастатического потенциала клеток A549, тогда как активность нормальных эндотелиальных клеток человека (HUVEC) под действием электрических стимулов не изменялась. КОМБИНИРОВАННЫЕ БИОРЕАКТОРЫ Созданы многочисленные комбинации БР, позволя ющие выращивать ткани в лабораторных условиях, как можно более точно соответствующих природным. В большинстве случаев эти комбинации заключают ся в добавлении разных методов механического воз действия на ткани в стандартный БР перфузионного цикла или роторный БР. Так, объединение БР с кон тролируемым механическим натяжением, БР с ги дростатическим давлением или компрессионного БР с перфузионным или роторным позволяет сочетать преимущества улучшенного обмена при перфузии или ротации и механическую стимуляцию ТИК. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Анализ применения биореакторных технологий при создании биомиметических моделей злокаче ственных опухолей показывает, что в настоящее время в ТИО по-прежнему чаще всего использу ются статические системы и перемешивающие БР на основе традиционных культуральных сосудов, помещенных на шейкеры. Однако эта область актив но развивается. Все большее внимание привлекают микрофлюидные системы. По-видимому, для мак симально правдоподобной реконструкции раковых опухолей потребуется применение не одного типа БР, а последовательной комбинации устройств, дей ствующих на основе различных механизмов, или же создание универсальных комбайнов, обеспечиваю щих автоматизацию операций, контроль и стандар тизацию условий культивирования. Мы полагаем, что создание новых видов БР для ТИО, а также разработка общих принципов их кон струирования имеют ключевое значение для углу бленного понимания биологии рака. Одновременно с этим эксперименты с использованием БР открыва ют концептуальные возможности для тестирования перспективных поколений противоопухолевых соеди нений на основе рекомбинантных молекул [111-118], многофункциональных наноконструкций [119-126], а также для оценки потенциала новых клеточных и тканеинженерных технологий [25, 39-41, 127, 128] и репрограммирования раковых клеток [129, 130].

Об авторах

A. E. Гуллер

Macquarie University; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова; Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Автор, ответственный за переписку.
Email: anna.guller@mq.edu.au
Австралия

П. Н. Гребенюк

Inetex LTD

Email: anna.guller@mq.edu.au
Израиль

A. Б. Шехтер

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова

Email: anna.guller@mq.edu.au
Россия

A. В. Звягин

Macquarie University; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова; Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Email: anna.guller@mq.edu.au
Австралия

С. M. Деев

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Национальный исследовательский Томский политехнический университет

Email: anna.guller@mq.edu.au
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы