Клеточные подходы к лечению инсулинзависимого диабета

Полный текст

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ Для изучения возможностей дифференцировки клеток in vitro в панкреатическом направлении не обходимо понимать процесс панкреатического орга ногенеза. Многочисленные исследования в этой об ласти, проводимые в основном на мышиных моделях, помогли гораздо лучше понять процессы развития и выявить стадии формирования различных органов (таблица). Поджелудочная железа (ПЖ), в которой про исходит синтез и секреция ряда гормонов и фер ментов, играет критически важную роль в обмене веществ. В поджелудочной железе выделяют экзо кринную и эндокринную части. Экзокринная часть состоит из ацинарных клеток, секретирующих пи щеварительные ферменты: амилазы, липазы, про теазы и нуклеазы, которые выводятся в протоки ПЖ, формирующие ветвящуюся структуру, состоящую из эпителиальных клеток [1]. Эндокринные клетки сгруппированы в мельчайшие островки, называемые островками Лангерганса (оЛ), состоящие из клеток пяти подтипов: α, β, δ, ε и РР, которые продуцируют гормоны глюкагон, инсулин, соматостатин, грелин и панкреатический полипептид соответственно. Поджелудочная железа - это производное энто дермы. После закладки энтодерма формирует эм бриональную кишку, которая затем под действием факторов роста, секретируемых соседними тканями, разделяется на отделы. ПЖ формируется из двух листков эпителия дорсально и вентрально от голов ной кишки, располагаясь между желудком и двенад цатиперстной кишкой [2, 3]. Дорсальный отросток получает сигналы от хорды и спинной аорты [4], вен тральный отросток находится под влиянием сигналов прилегающей сердечной мезенхимы и мезодермы бо ковой пластины [5]. Однако при инъекции факторов роста фибробла стов (FGF) и морфогенетического белка кости (BMP) в эмбриональные экспланты энтодермы направле ние дифференцировки можно изменить с панкре атического на гепатоцитарное. С другой стороны, уменьшение зависимого от белка р300 ацетилирова ния гистона, ассоциированного с активацией генов, обеспечивает обратный переход к панкреатической дифференцировке [8]. Далее, на 11.5 день ЭР мыши вентральная и дорсальная части увеличиваются в размерах и сливаются в единый орган [9]. В это вре мя пролиферация панкреатического эпителия сти мулируется преимущественно мезенхимными клет ками, секретирующими факторы роста (12.5 день ЭР мыши) [10]. Дальнейшее развитие ведет к развет влению эпителиальных протоков. Параллельно этим процессам предшественники эндокринных клеток отслаиваются от эпителия и собираются в оЛ. На ста дии 16.5 ЭР появляются моногормональные инсулин секретирующие клетки, формируются ацинусы [11]. ПЖ взрослого человека содержит примерно 1 млн оЛ [12]. В процессе дифференцировки эндокринной ткани прогениторные клетки оЛ коэкспрессируют различные гормоны. В ходе дальнейшего созревания клетки превращаются в моногормональные [13, 14]. На моделях грызунов показано, что первыми эндо кринными клетками являются глюкагонсекретиру ющие, которые можно обнаружить примерно на 9.5 день эмбрионального развития [15, 16]. С течением времени появляются клетки, коэкспрессирующие инсулин и глюкагон, а отдельные инсулинсекретиру ющие β- и глюкагонсекретирующие α-клетки наблю даются с 14-го дня. Вскоре развиваются соматоста тинсекретирующие δ-клетки, а PP-секретирующие клетки можно наблюдать на 18-й день эмбриональ ного развития [14, 15]. Все эндокринные клетки происходят из прогени торных клеток ПЖ, экспрессирующих Pdx1. В ходе развития ПЖ Pdx1 экспрессируется и эндокрин ными, и экзокринными прогениторными клетками, но по окончанию развития его можно наблюдать только в β- и δ-клетках [16]. Развитие эндокринных клеток регулируется фактором транскрипции Ngn3, ингибирование которого на 11.5 день эмбрионального развития ПЖ приводит к значительному снижению уровня эндокринной дифференцировки [17]. Генетические манипуляции позволили лучше по нять функции факторов транскрипции, влияющих на генерацию различных типов эндокринных клеток ПЖ. В число этих факторов входят Sox9, Pdx1, Ngn3, Ia-1, Pax4, Arx, Nkx2.2, Nkx6.1, Nkx6.2, Pax6 и Mafa. Sox9 экспрессируется в Pdx1+-клетках эпите лия ПЖ, начиная с 9-го дня ЭР. На 14.5 день ЭР его экспрессия ограничена недифференцированными клетками с низким уровнем Pdx1 и полностью отсут ствует в гормонсекретирующих клетках. В постна тальный период Sox9 локализован в центральноаци нарных клетках и некоторых эпителиальных клетках протоков [19]. Некоторые наблюдения подтверждают, что Sox9 является маркером прогениторных клеток ПЖ: его экспрессия не меняется у мышей с нокаутом Ngn3 и Nkx6.1. У трансгенных мышей с искусственно поддерживаемыми в прогениторном состоянии клет ками-предшественниками экспрессия Sox9 остает ся аномально стабильной. Sox9 коэкспрессируется с проэндокринным транскрипционным фактором Ngn3 на 15.5 день ЭР, но отсутствует в клетках, экс прессирующих маркеры Nkx2.2 и Isl-1, характерные для зрелых оЛ. Точечная делеция Sox9 в прогенитор ных клетках Pdx1+ приводит к снижению количества эндокринных клеток одновременно с преждевремен ной дифференцировкой в клетки, экспрессирующие глюкагон и Isl-1. Таким образом, активность Sox9 не обходима для поддержания прогениторных клеток в пролиферативном состоянии и предотвращения их преждевременной дифференцировки [20, 21]. Как и Sox9, Pdx1 экспрессируется на 8.5 сутки ЭР в дорсальной и вентральной энтодерме, за эпителием желудка и двенадцатиперстной кишки. Позднее экс прессия Pdx1 ограничивается β-клетками, в которых он контролирует глюкозозависимую секрецию инсу лина [22-24]. Показано, что зрелые панкреатические клетки происходят из прогениторов Pdx1+ [25]. Это подтверждается панкреатическим агенезом у мышей с дефицитом Pdx1 [26]. Инактивация Pdx1 на различ ных стадиях развития, а также в зрелых β-клетках показала его необходимость для определения и под держания фенотипа β-клеток [27, 28]. Более того, установлено [29], что инактивация Pdx1 в β-клетках на поздних стадиях ЭР приводит к уменьшению пролиферации инсулинпродуцирующих клеток с одновременным увеличением ее у глюкагонпроду цирующих клеток. Эти результаты позволяют пред положить, что Pdx1 необходим для возникновения и поддержания β-клеток, а также для регулирования числа эндокринных клеток на поздних стадиях ЭР [29]. В отличие от Pdx1, Ngn3 воздействует только на дифференцировку эндокринной ткани. Он детек тируется с 8.5 дня ЭР, достигает максимума на 15.5 день и поддерживается на низком уровне в зрелых эндокринных клетках. Ngn3 необходим для спецификации всех энтероэндокринных и эндокринных линий [25, 30, 31]. Инактивация Ngn3 в зрелых Pdx1+ клетках приводит к ухудшению функций оЛ [32], а усиление его экспрессии активирует дифферен цировку эндокринных клеток [33, 34]. Эктопическая экспрессия Ngn3 в Pdx1+-клетках ведет к преждев ременному старту эндокринной дифференцировки, в результате которой образуются только глюкагон продуцирующие клетки [35, 36]. Показано, что экс прессия Ngn3 проходит две отдельные временные волны, коррелирующие с первым и вторым пере ходом, описанными Pictet и соавт., генерируя ран не- и позднеформирующиеся эндокринные клетки с различным потенциалом развития [37, 38]. Ранние Ngn3+-клетки, согласно [39], дают начало α-клеткам. Активация Ngn3 на более поздних стадиях разви тия индуцирует возникновение β- и РР-клеток после 11.5 дня ЭР и δ-клеток после 14.5 дня ЭР, в то время как индукция формирования α-клеток прогрессивно снижается [39]. Фактор транскрипции Ia-1 является мишенью для Ngn3 и принимает участие в дифференциров ке эндокринных клеток. При мутациях по Ia-1 эндо кринные клетки наблюдаются, но большая их часть не секретирует гормоны [40]. В отличие от Ngn3, эк топическая экспрессия Ia-1 в протоковых клетках недостаточна для индукции эндокринной диффе ренцировки. В то же время коэкспрессия Ngn3 и Ia-1 значительно усиливает эффективность индукции эндокринной дифференцировки по сравнению с эк топической экспрессией только Ngn3 [41]. Arx и Pax4 играют ключевые роли в специали зации подтипов эндокринных клеток. Arx выступа ет промотором дифференцировки α- и РР-клеток, в то время как Pax4 индуцирует β- и δ-линии (рис. 1). При дефиците Pax4 β- и δ-клетки ПЖ не развивают ся, при этом увеличивается количество α-клеток [42]. С другой стороны, потеря Arx ведет к увеличению числа β- и δ-клеток с исчезновением α-популяции [43]. Более тщательный анализ показал антагонизм факторов Arx и Pax4. Одновременный нокаут Pax4 и Arx приводит к исчезновению β- и α-клеток, уве личению популяции δ-клеток, в то время как коли чество РР-клеток остается неизменным [44]. Из этого был сделан вывод, что Pax4 не входит в число факто ров, необходимых для спецификации β-/δ-клеток, а, подавляя экспрессию Arx, действует как ингибитор появления α-клеток. На ранних стадиях развития Nkx2.2 играет суще ственную роль в спецификации β-клеток. В то же время в зрелых оЛ Nkx2.2 служит маркером α-, β и РР-клеток. У мышей с нокаутом гена Nkx2.2 на блюдается потеря α-клеток, а также снижение чис ла β- и РР-клеток, при том, что количество δ-клеток остается неизменным [45, 46]. Nkx6.1, еще один маркер панкреатического эпителия, впервые детектируется на 9.5 день ЭР. Изначально он экспрессируется в Ngn3+ эндокрин ных клетках-предшественниках, а в дальнейшем только в зрелых β-клетках, в которых регулирует процесс секреции инсулина [47, 48]. У мышей с но каутом гена Nkx6.1 значительно снижено число зрелых β-клеток, в то время как другие подтипы островковых клеток развиваются нормально [47]. Nkx6.2, паралог Nkx6.1, имеет сходные паттер ны экспрессии, но не экспрессируется в зрелых β-клетках [49, 50]. Мыши, мутантные по Nkx6.2, имеют нормальный фенотип. В то же время у жи вотных с недостатком Nkx6.1 и Nkx6.2 возника ют изменения, сходные с проявлениями мутации Nkx6.1, но при этом значительно снижено число глюкагонпродуцирующих клеток. Это позволяет говорить о более широком влиянии Nkx-факторов на формирование α-клеток [49]. Еще один член семейства Pax, Pax6, играет важ ную роль в дифференцировке островковых клеток. Рах6 экспрессируется во всех эндокринных гормон продуцирующих клетках. Рах6 необходим для раз вития всех четырех подтипов эндокринных клеток и формирования правильно структурированных оЛ, как показано с помощью нокаута гена Pax6 у мышей [51, 52]. Представители семейства генов Mafa (Mafa, Mafb и cMaf) влияют на конечную дифференцировку β и α-клеток. Так, Mafa прямо действует на промо тор гена инсулина и трансактивирует его [53-55]. Экспрессия Mafa инициируется на 13.5 день ЭР и ограничена инсулин+-клетками в течение эмбри огенеза и последующей жизни [56]. У мышей с недо статком Mafa развивается сахарный диабет первого типа с сильным снижением уровня инсулина и ано мальной архитектурой оЛ. Изолированные инсулин+ клетки с дефицитом Mafa не способны к глюко зозависимой секреции инсулина [57]. Кроме того, эктопическая экспрессия Mafa в энтодерме куриных эмбрионов, а также в культурах непанкреатических клеток достаточна для инициации секреции инсули на [58]. Таким образом, в результате изучения роли основ ных генов, вовлеченных в спецификацию различных эндокринных клеток, установлена сложность меха низмов их регуляции. Для оптимизации программ дифференцировки клеток in vitro необходимо изу чать in vitro и in vivo генез инсулинпродуцирующих β-клеток. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ДОНОРСКИХ ОСТРОВКОВ ЛАНГЕРГАНСА Трансплантация поджелудочной железы позволя ет добиться восстановления нормального уровня глюкозы [59]. Однако подобная операция подвергает пациента определенным рискам и вызывает необхо димость иммуносупрессии на протяжении последу ющей жизни. Трансплантация аллогенных изолированных островковых клеток позволяет избежать полостной операции. В 1983 году человеческие оЛ пересадили крысам с экспериментальным диабетом [60]. Первая трансплантация аллогенных оЛ человеку была про ведена в 1990 году [61]. Эффективность этого мето да оставалась крайне низкой до 2000 года. Вероятно, это было связано с технологиями выделения остров ков, недостаточным их количеством в трансплантате и жесткой иммуносупрессией. Использование разра ботанного Shapiro и соавт. [62] протокола Эдмонтона позволило снизить аллоиммунную реакцию и повы сить выживаемость пересаженных островков [62-64]. Удалось добиться независимости от введения экзо генного инсулина. Кроме того, использование этого метода позволило нормализовать уровень глики рованного гемоглобина HbA1c [65]. При выделении островков из ПЖ по протоколу Эдмонтона использу ют специфические ферменты. Выделенные клетки вводят в воротную вену печени через катетер, в ре зультате чего клетки задерживаются в венозных си нусах печени реципиента, где снабжаются кровью и осуществляют глюкозозависимую секрецию ин сулина. Важнейший компонент этого протокола - комбинация иммуносупрессоров. В течение корот кого времени сразу после трансплантации пациенту вводят даклизумаб, чтобы предупредить начальное отторжение. Использование второго компонента, си ролимуса, позволяет избежать использования ток сичных для островковых клеток стероидных препа ратов. Третий компонент, такролимус, применяется в малых дозах, что снижает его негативное воздей ствие на оЛ. Современные методики иммуномодуля ции позволяют продлить время жизни транспланта та и сохранить донорские оЛ до 5 лет [66-68]. Однако риски, вызываемые длительной иммуносупресси ей, а также острый дефицит донорского материала не позволяют широко использовать этот метод. Сходство инсулина человека и свиньи [69, 70], а также применение инсулина в терапии диабета до появления рекомбинантного человеческого инсу лина [71], позволило рассматривать свиные островко вые клетки в качестве материала для трансплантата. Для защиты от отторжения используют различные методики инкапсуляции. В компании Living Cell Technologies изучается безопасность и эффектив ность трансплантации инкапсулированных свиных оЛ больным (СД1Т) без применения иммуносупрес сии (http://www.lctglobal.com). Показано отсутствие признаков воспаления или фиброза, а также сниже ние уровня гликированного гемоглобина у пациентов при уменьшении дневной дозы инсулина [72-74]. Активно изучается применение инкапсулирован ных человеческих островковых клеток [73, 75-78], однако, при снижении или полном отсутствии необ ходимости в иммуномодуляции остается проблема нехватки доноров. В качестве материалов для изготовления капсул применяют как водорастворимые полимеры (альги нат), так и водонерастворимые [79]. Несмотря на во дорастворимость, альгинатные капсулы остаются стабильными в течение нескольких лет [78, 80-84]. Создание двухслойных капсул позволяет снизить пористость мембраны капсулы, что продлит вре мя ее жизни и улучшит иммунозащитные свойства. Возможна также модификация мембраны поли-L лизином и полиорнитином, но это снижает механи ческую стабильность, что, в свою очередь, уменьшает время жизни капсулы [79, 85, 86]. Немаловажен выбор места для трансплантации. Для адекватного функционирования трансплан тата необходим достаточно высокий уровень ва скуляризации. К сожалению, найти подходящую область для инкапсулированных трансплантатов достаточно сложно из-за их относительно круп ных размеров. Места, пригодные для пересадки не инкапсулированных образцов, такие, как печень и селезенка, не подходят, так как не могут принять капсулы достаточно большого размера (диаметром от 600 мкм). С помощью относительно простой ла пароскопии можно поместить капсулу в брюшную полость. Однако это не оптимальное расположение, поскольку вызывает существенный иммунный ответ. В ответ на трансплантат клетки мезотелия брюш ной полости продуцируют, в том числе и опосредо ванно, - через сигналы от макрофагов, фактор не кроза опухоли-α, интерлейкины-1β и -10, а также другие цитокины [87]. Лучшие результаты получены при введении как инкапсулированных, так и неин капсулированных трансплантатов под капсулу почки или подкожно [88]. Подобная локализация вызывала лишь незначительную клеточную иммунную реак цию при высокой жизнеспособности транспланти рованных островков и достаточном уровне секреции инсулина [89]. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК Плюрипотентные стволовые клетки способны диф ференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков, что дает возможность получить из них и ин сулинпродуцирующие клетки для терапии сахарного диабета. Известны два типа ПСК: ЭСК, получаемые из внутренней клеточной массы бластоцисты, и ин дуцированные плюрипотентные стволовые клетки, получаемые перепрограммированием соматических клеток в плюрипотентные. Первыми ЭСК культиви ровали Thomson и соавт. [90], что положило начало перепрограммированию соматических клеток [91]. Дифференцировочный потенциал, пролиферативные свойства, морфология и профиль экспрессии генов у ЭСК и ИПСК схожи, что позволяет использовать ИПСК без этических ограничений, связанных с раз рушением эмбрионов [92, 93]. Аутологичные ИПСК человека не элиминируются иммунной системой при пересадке, но остается опасность, что получен ные инсулинпродуцирующие клетки будут оттор гнуты тем же аутоиммунным механизмом, который привел к появлению сахарного диабета. И ЭСК, и ИПСК способны к дифференцировке in vitro в инсулинпродуцирующие клетки [94-98]. Дифференцировка ПСК в инсулинпродуцирующие клетки проходит, как и при нормальном развитии ПЖ, в несколько стадий, первая из которых - ин дукция энтодермы. В ЭСК экспрессируется большое количество маркеров энтодермы, например Sox17, Foxa2, Cxcr4, при этом отсутствует экспрессия Sox7 [95, 96, 99-102]. Дифференцировка ЭСК и ИПСК в энтодерму инициируется сигналами Nodal и Wnt [95, 99, 103, 104]. В свою очередь, Nodal активируется белком из семейства TGF-β - активином А, в кон центрации 50-100 нг/мл, наиболее эффективном для дифференцировки [105, 106]. Долю дифферен цированных клеток можно увеличить при одновре менном воздействии активина А и некоторых ин гибиторов (вортманнин, CHIR99021 [107], бутират натрия [96]) и активаторов Wnt-сигналов, таких, как CHIR9902 [108]. Кроме того, эффективность диф ференцировки можно повысить при использовании малых молекул, таких, как IDE1 и IDE2 [109]. Как из вестно, из энтодермы происходят как панкреати ческие клетки, так и гепатоциты. Для дальнейшей панкреатической дифференцировки in vitro клетки обрабатывают антагонистами TGF-β и BMP4, таки ми, как SU5402 и Noggin, которые подавляют диф ференцировку в гепатоцитарном направлении [101]. Вторая стадия панкреатической дифференциров ки ПСК - культивирование в присутствии дорсо морфина или его гомолога 1, которые способствуют развитию Pdx1+-клеток-предшественников [96, 99, 109]. Последующие стадии, позволяющие превра тить клетки-предшественники в полноценные инсу линпродуцирующие клетки, пока ясны не до конца. При попытке провести дифференцировку in vitro использовали такие факторы, как никотинамид, ин сулиноподобный фактор роста 1 и гепатоцитарный фактор роста [96, 101, 103]. Дальнейшую дифферен цировку Pdx1+-клеток индуцировали индолактамом V и усиливали ретиноевой кислотой [108]. Показано также, что способность ПСК дифференцироваться в эндокринные клетки сильно зависит от плотности посева в культуре [110, 111]. Однако в клетках, диф ференцированных in vitro, часто синтезируются не сколько гормонов, такие клетки имеют незрелый фе нотип, не реагирующий на уровень глюкозы [103, 112, 113]. В связи с этим часто трансплантируют клетки предшественники, чтобы дальнейшая дифферен цировка прошла in vivo [99, 105, 114-117]. В опытах как на здоровых мышах [99, 105], так и на мышах с диабетом, индуцированным стрептозотоцином [114], из ЭСК развивались функциональные инсулинпро дуцирующие клетки. Более того, показано, что даже инкапсулированные клетки-предшественники могут дифференцироваться в зрелые инсулинпродуциру ющие клетки, способные к эффективной секреции инсулина у мышей с диабетом [118]. В революционной работе Pagliuca и соавт. [119] разработан протокол дифференцировки, позволя ющий получать функциональные инсулинпродуци рующие клетки. Дифференцировка ПСК человека осуществляется в течение 28-33 дней с применением большого набора факторов роста и малых молекул. В результате получены инсулинпродуцирующие клетки, способные к глюкозозависимой секреции инсулина на уровне, сопоставимом с уровнем в зре лых β-клетках. Эти клетки содержали инсулиновые гранулы, обладающие ультраструктурой, присущей β-клеткам, и были способны нормализовать уровень глюкозы при трансплантации мышам с эксперимен тальным диабетом [119]. Обнаружено, что фактор освобождения кортико тропина, белок Ucn3, экспрессируется в β-клетках на высоком уровне и регулирует глюкозозависимую секрецию инсулина [120]. При дифференцировке in vitro, однако, Ucn3 не экспрессируется [121]. В то же время в зрелых и незрелых β-клетках уровень экс прессии Ucn3 различается более чем в 7 раз. Таким образом, созревание клеток in vivo важно для их функциональности. Это предполагает существование в местах трансплантации некоторых специфических сигналов, которые запускают дифференцировку и созревание β-клеток. МЕТОД ПРЯМОГО ПЕРЕПРОГРАММИРОВАНИЯ Технологии репрограммирования, разработанные для получения ИПСК, могут использоваться и в дру гих целях. Методика прямого перепрограммирования основана на применении генетических конструкций для репрограммирования клеток различного типа в целевые, минуя их возвращение в плюрипотентное состояние. Как и при получении ИПСК, в методе пря мого перепрограммирования используются техноло гии интеграции ДНК (в большинстве случаев с по мощью вирусных векторов). В частности, экспрессия гена Pdx1, искусственно вызванная в печени мышей с диабетом, привела к появлению инсулин+-клеток вблизи кровеносных сосудов. Конверсия, однако, была неполной. Это заставило искать другие гены, действующие синергично и между собой, и с Pdx1. Кроме того, начались поиски клеток, подходящих для репрограммирования. Многообещающими ока зались протоковые клетки. Еще в 1980-е годы было показано, что β-клетки могут возникать из прото ковых клеток ПЖ. Экспрессия Pdx1 в протоках ПЖ человека индуцирует экспрессию инсулина [122]. Внутрибрюшинное введение рекомбинантного Pdx1 снижало уровень гипергликемии у мышей со стреп тозотоциновым диабетом [123]. Протоковые клетки взрослых мышей, трансдуцированные аденовирусом, несущим Pdx1, Pax4, Ngn3 и NeuroD, начинали ак тивно вырабатывать инсулин [124]. Согласно последним исследованиям, ацинарную ткань ПЖ мыши также можно перепрограммиро вать с помощью искусственной экспрессии генов: возможна индукция дифференцировки ацинарных клеток в протоковые с последующим превращением в островковые [125]. Большое количество ацинарных клеток в ПЖ делает их удобным источником для по лучения β-клеток. Ацинарные клетки могут диффе ренцироваться in vitro в инсулинпродуцирующие клетки при культивировании в среде с низким содер жанием сыворотки с добавлением эпидермального фактора роста и никотинамида. При этом возрастает также экспрессия других гормонов, включая глю кагон, соматостатин и панкреатический полипептид [126]. Ацинарные клетки человека при определенных условиях культивирования могут трансформиро ваться в структуры, подобные протокам. Добавление дексаметазона индуцирует ацинарно-протоковый переход клеток, но, к сожалению, не дифферен цировку в инсулинпродуцирующие клетки [127]. Показано, что при гипергликемии увеличивается инфильтрация ацинарной ткани Т-клетками и ин дуцируется дифференцировка ацинарных клеток либо в β-клетки, либо в структуры, подобные прото кам, из которых могут в дальнейшем формироваться β-клетки [128]. Ацинарно-островковую дифферен цировку у крыс можно вызвать обработкой дексаме тазоном [129]. Согласно последним исследованиям, ацинарную ткань ПЖ мыши также можно перепро граммировать с помощью искусственной экспрес сии генов Pdx1, Ngn3 и Mafa. У опытных животных снизился уровень гипергликемии, хотя полного вы здоровления не произошло. Возможно, это связано с отсутствием агрегации полученных клеток и с от сутствием у них синхронной глюкозозависимой се креции инсулина [130-132]. Эти результаты под тверждены и в опытах in vitro, проведенных на линии ацинарных клеток AR42J, а затем на экзокринных клетках ПЖ человека [133, 134]. Дополнительно сто ит отметить, что в опытах in vivo перепрограммиро вание проходит лучше при более сильном иммунном ответе на введение вирусного вектора, используемого для доставки генов [135]. Основная физиологическая роль α-клеток заклю чается в секреции глюкагона - антагониста инсули на, играющего важную роль в поддержании уровня глюкозы. Переход α-клеток в β-клетки наблюда ли при эктопическом повышении экспрессии Pax4. Этому процессу также способствовал Ngn3 [136]. Усиленная экспрессия Pdx1, контролируемая про мотором Ngn3, на ранних стадиях эмбрионального развития приводит к смещению соотношения между α- и β-клетками в сторону β-клеток [137]. Подобный переход не индуцируется активацией Pdx1 на более поздних стадиях. При лигировании выводного про тока большое число новообразованных β-клеток про исходило из α-клеток в течение 2 недель [138]. Судя по всему, превращение α-клеток в β-клетки возмож но только в моделях с практически полным уничто жением изначальной популяции β-клеток [138, 139]. В эксперименте с частичным разрушением β-клеток подобный переход не обнаружен [140]. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОММИТИРОВАННЫХ КЛЕТОК Использование ЭСК не только этически неоднознач но, но имеет и другие негативные стороны. Например, трансплантаты как из ЭСК, так и из ИПСК могут обладать туморогенной активностью, обусловлен ной присутствием недифференцированных плюри потентных клеток. Кроме того, необходимым оста ется применение иммуномодулирующей терапии для регулирования аллогенных реакций [141, 142]. Использование постнатальных стволовых клеток по зволит обойти все эти проблемы [143-146]. Доступным источником стволовых клеток явля ется кожа. Клетки-предшественники кожи впервые были описаны Toma и соавт. [147]. Они обладают ши роким диапазоном дифференцировки, позволяющим получать функционально различные типы клеток in vitro (клетки глии, гладкой мускулатуры, ади поциты). Описан эффективный метод криоконсер вации клеток-предшественников кожи, дающий возможность создания клеточного банка. Таким об разом, кожа рассматривается в качестве перспек тивного источника аутологичных клеток, способных к дифференцировке и длительному хранению [148]. Из клеток-предшественников кожи in vitro получе ны клетки, способные к глюкозозависимой секреции инсулина и С-пептида. Дифференцированные клет ки экспрессировали характерные для β-клеток мар керы, такие, как Pdx1, Nkx2.2, Pax4, NeuroD и Isl-1 [149]. Наиболее часто упоминаемые в контексте регене ративной медицины ПСК - это мезенхимные стволо вые клетки (МСК), в большом количестве представ ленные в большинстве тканей организма [150]. Их успешно культивируют in vitro, они достаточно эф фективно дифференцируются в костную, хрящевую и жировую ткани [151]. Предполагается, что для диф ференцировки в инсулинпродуцирующие клетки наиболее подходят МСК жировой ткани, получен ные при операции на веке, поскольку они происходят из клеток нервного гребня. Подобное происхождение имеют и МСК из периодонтальной связки [152-154]. Однако их не удается достаточно эффективно при близить к фенотипу β-клеток in vitro. Несколько обособленно стоят МСК из пуповинной крови. Исследование, проведенное Prabakar и соавт., вы явило у них сходные с ЭСК характеристики, а также сходство их дифференцировки в панкреатическом направлении [155]. Другой вариант терапии - прямое введение недифференцированных МСК, при котором наблюдали различную степень регенерации [153, 154, 156, 157]. Подобная реакция организма обусловлена иммуномодуляторными, противовоспалительными, проангиогенными и трофическими свойствами МСК. Более выраженной способностью к регуляции имму нитета обладают гемопоэтические стволовые клетки, которые успешно использовали для «перезагрузки» иммунитета при диабете [158, 159]. Мультипотентные стволовые клетки, полученные из пуповинной кро ви, по неподтвержденным результатам могут зани маться так называемым «обучением» иммунитета. Лимфоциты больных сахарным диабетом первого типа циркулируют в устройстве с высеянными муль типотентными стволовыми клетками пуповинной крови здоровых доноров. После реинфузии «обучен ных» лимфоцитов наблюдали снижение симптомов сахарного диабета первого типа [160, 161]. Существует гипотеза, что повреждение ПЖ вы зывает активацию факультативных клеток-предше ственников, которая ведет к увеличению количества β-клеток. Показано, что в ПЖ мыши β-клетки реге нерируют из протоковых клеток-предшественников [161]. Кроме того, в большой выборке больных хро ническим панкреатитом и бессимптомным фиброзом ПЖ выявлен неогенез из комплексных островково протоковых структур, которые представляют со бой ассоциацию эндокринной части ПЖ с протока ми [162]. У мышей со стрептозотоциновым диабетом обнаружено два типа предшественников β-клеток, экспрессирующих Glut2 и Pdx1/соматостатин. Этим клеткам приписывают протоковое происхождение [163, 164]. Изучение зародышевых ПЖ in vitro по казало, что новые инсулинпродуцирующие клетки могут происходить из эпителия протоков. Протоки ПЖ, взятые у свиньи в неонатальный период, в осо бых условиях культивирования экспрессируют ин сулин и маркеры предшественников эндокринных клеток [165]. В протоковой ткани ПЖ человека, культивируемой в течение 3-4 недель, наблюдали эндокринные клетки, прорастающие в трехмерных протоковых кистах. Эти клетки экспрессировали как инсулин, так и другие гормоны оЛ. Это говорит о том, что они находятся в состоянии дифферен цировки. Кроме того, в полученных таким образом клетках секреция инсулина была глюкозозависимой [161]. Показано также, что Pdx1 может значительно ускорять дифференцировку протоковых эпители альных клеток в инсулинпродуцирующие клетки in vitro [166]. В результате исследований in vivo на мы шах с индуцированным стрептозотоциновым диабе том установлено, что протоковые клетки экспресси руют инсулин на ранних стадиях воспаления, а затем экспрессия прекращается [167]. Это может говорить о том, что начальное воспаление при сахарном диа бете первого типа индуцирует регенерацию β-клеток. Возможно, новообразованные β-клетки более уяз вимы для апоптоза. Экспрессия фактора некроза опухоли-α в β-клетках мыши вызывала хрониче ский инсулит, а не диабет. Это происходило с одно временным развитием внутриостровковых протоков с встроенными в их стенки β-клетками, что может говорить о способности к регенерации [168]. Сходным образом трансгенные мыши, экспрессирующие интерферон-γ, были защищены от стрептозотоци нового диабета, который сопровождался увеличен ной регенерацией протоковых клеток и неогенезом оЛ [169]. Экспрессия Pdx1 и Msx2 в протоках ПЖ та ких трансгенных мышей предполагает ассоциацию этих факторов с дифференцировкой протоковых клеток в этой модели [170]. У людей с аутоиммунным хроническим панкреатитом разрушение β-клеток Т-клетками вызывает дифференцировку β-клеток из протоковых клеток ПЖ [171]. У больных сахарным диабетом первого типа после одновременной пере садки ПЖ и почки обнаружены инсулинпродуциру ющие Pdx1+-протоковые клетки. На мышах с индуцированным аллоксаном диа бетом показано, что при in vivo воздействии EGF и CNTF новые инсулинпродуцирующие клетки об разуются преимущественно из ацинарных клеток [172]. С помощью технологии Cre/LoxP проследили судьбу ацинарных и протоковых клеток и выясни ли, что около 40% новообразованных инсулинпроду цирующих клеток происходят из ацинарных клеток и только 4% - из других типов клеток. Это доказы вает существование трансдифференцировки в ПЖ млекопитающих. Ряд работ посвящен поиску непанкреатического источника клеток, способных синтезировать инсу лин. Один из таких источников - большие слюнные железы. Показано, что в поднижнечелюстной слюн ной железе крысы экспрессируется мРНК препро инсулинов I и II [173]. Иммуногистохимическими ме тодами инсулин обнаружен в околоушной слюнной железе крысы [174]. Установлено, что при диабете поднижнечелюстные слюнные железы выполняют компенсаторную функцию [175]. У мышей со стреп тозотоциновым диабетом после трансплантации поднижнечелюстной слюнной железы под капсулу почки наблюдалась нормализация уровня глюко зы в крови [176]. Клетки, полученные из поднижне челюстной слюнной железы человека и животных (мышь, крыса, свинья), легко культивируются [177- 179]. В трехмерных условиях культивирования они приобретают способность синтезировать глюкагон, альбумин или инсулин [177, 178]. При сферическом культивировании в присутствии никотинамида клет ки слюнной железы человека приобретали способ ность к глюкозозависимой секреции С-пептида [179]. Клетки поднижнечелюстной слюнной железы кры сы, экспрессирующие α6β1/c-Kit, сохраняли мор фологию, пролиферативную активность и мульти потентность, присущую стволовым клеткам, более 92 пассажей. В присутствии активина А, эксендина 4 и ретиноевой кислоты эти клетки экспрессировали панкреатические маркеры, такие, как Pdx1, инсулин, панкреатический полипептид и Ngn3 [180]. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОМАТЕРИАЛОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ МАТРИКСОВ ДЛЯ 3D-СТРУКТУР Широко известно, что использование трехмерных структур для культивирования клеток имеет некото рые преимущества перед традиционным двумерным культивированием. Клетки содержатся в услови ях, более близких к нативным, сохраняют контак ты с матриксом и между собой, ускоряется процесс дифференцировки [181]. Такие системы приближают условия культивирования клеток к условиям in vivo. Эти утверждения справедливы и для культивирова ния панкреатических клеток in vitro и их доставки in vivo. Высевание клеток на пористый матрикс увеличи вает их жизнеспособность и функции изолированных оЛ in vitro, улучшает результаты трансплантаций. Например, островковые клетки ПЖ крысы были почти вдвое более жизнеспособны и секретирова ли в 4 раза больше инсулина при культивировании на пористом матриксе из полигликолевой кислоты, чем при 2D-культивировании [182]. При культи вировании инсулинпродуцирующих клеток линии RIN-m5F на созданном методом электроспиннинга матриксе из сополимера молочной и гликолевой кис лот PLGA с порами, заполненными коллагеном типа I, секреция инсулина повышалась вдвое [183]. Еще одно преимущество пористых матриксов - возможность кокультивирования нескольких типов клеток для создания условий, повторяющих на тивные структуры ткани. Так, кокультивирование островковых клеток мыши, клеток эндотелия пупо вины человека и фибробластов крайней плоти че ловека на матриксе из PLLA\PGLA увеличило вы живаемость островковых клеток на 75%. Кроме того, включение фибробластов и эндотелиальных клеток увеличило экспрессию таких маркеров, как Gcg, Pdx1, Nkx6.1 и Glut2. В полтора раза увеличилась секреция инсулина [184]. Очевидно, что биоматериалы создают трехмерную структуру для культивирования клеток, однако все больше говорят о фундаментальном влиянии натив ного межклеточного матрикса (МКМ) на состояние клеток. Его роль заключается не только в механи ческой поддержке: МКМ влияет на адгезию клеток, молекулярный состав, клеточные взаимодействия и связывание факторов роста. Кроме того, его меха ническая жесткость и деформируемость вносят су щественный вклад в процессы дифференцировки, пролиферации, выживания, полярности и миграции клеток [185]. Наиболее полно охарактеризованы такие компо ненты МКМ, как ламинины - семейство из 15-20 гликопротеинов [186], каждый из которых незави симо усиливает секрецию инсулина [187]. Ламинины влияют на клетки, связываясь с интегринами - бел ками клеточной мембраны, отвечающими за ад гезию и передачу внешних сигналов цитоскелету [188]. 3D-структура нативного МКМ определяет то пографию эндокринных клеток, что, как показано, влияет на секреторную активность [189]. Более того, составляющие элементы, такие, как коллагены, гли копротеины, гликозаминогликаны независимо пре дотвращают апоптоз β-клеток, вызванный потерей клеточной адгезии [189-195]. Обнаружено, что ком поненты МКМ усиливают секрецию инсулина, даже в отсутствие глюкозы [196]. МКМ способен связы вать, запасать и регулировать активность факторов роста, включая TGF-β1, который влияет на развитие, функционирование и регенерацию оЛ [197, 198]. При разработке материалов для создания искус ственных 3D-матриксов их поверхность модифици руют прикреплением молекул, составляющих часть нативного МКМ. Однако на данный момент более перспективным считают использование децеллюля ризации МКМ (рис. 2) [200-204]. Современные под ходы позволяют удалить клеточный материал, ДНК и поверхностные антигены при сохранении струк турной целостности МКМ [205]. Получена децеллю ляризованная свиная ПЖ с сохранением всех важ ных структурных компонентов, включая различные типы коллагена, эластин, фибронектин и ламинин [206]. Децеллюляризованная ткань служит матрик сом для посадки клеток с целью восстановления клеточной части органа. На данный момент удалось успешно рецеллюляризовать МКМ таких органов, как печень [207], дыхательные пути [208], мочевой пузырь [209], молочная железа [210]. Это позволяет надеяться на положительный результат и в случае ПЖ. ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ Современные методы лечения при СД1Т ограниче ны и не элиминируют долговременные осложнения. Заметен прогресс в исследованиях, связанных с по пытками восстановления инсулинпродуцирующей функции ПЖ. Классические методы транспланта ции сталкиваются с нехваткой доноров и рисками, связанными с необходимостью иммуносупрессии. Последние могут быть преодолены с помощью тех нологий инкапсуляции, однако нерешенными оста ются такие проблемы, как недостаточная продолжи тельность жизни клеток и совмещение достаточного числа клеток для обеспечения нормогликемии с раз мерами трансплантата, не вызывающими затруд нений в движении или какого-либо дискомфорта. Способность некоторых типов клеток, например МСК и гемопоэтических клеток, к регулировке иммуни тета может оказаться весьма полезной для предот вращения повторного аутоиммунного уничтожения β-клеток. Тщательного анализа требует выбор типа клеток. ЭСК и ИПСК могут дифференцироваться в панкреа тические клетки-предшественники и/или инсулин продуцирующие клетки. Использование аллоген ных ЭСК, однако, также требует иммуносупрессии либо инкапсулирования. Применение аутологичных ИПСК ограничивается экономической целесообраз ностью получения своей линии для каждого отдель ного пациента и сложностью дифференцировочных протоколов. Кроме того, велика вероятность последу ющего рецидива, связанного с отторжением, вызванного аутоиммунным механизмом, который и привел к появлению СД1Т. Остается нерешенным и вопрос туморогенной активности оставшихся в трансплан тате недифференцированных ПСК. На данный момент перспективным кажется со вмещение различных подходов: полученные от бу дущего реципиента ИПСК дифференцируют до пан креатических клеток-предшественников, которые затем культивируют в 3D-условиях с элементами МКМ и аутологичными МСК. Или для «переза грузки» иммунной системы пациента используют гемопоэтические стволовые клетки, а новые инсу линпродуцирующие клетки получают с помощью прямого перепрограммирования. Однако применение этих подходов требует тщательного анализа и оцен ки возможных рисков, связанных с биологической безопасностью методик и туморогенной активностью используемых клеток. Многообещающим современным методом явля ется прямое перепрограммирование клеток. Однако недостаточное изучение безопасности этого спосо ба получения инсулинпродуцирующих клеток пока не позволяет говорить о переносе прямого перепро граммирования в практическую плоскость. Положительный эффект культивирования в трех мерных условиях описан в многочисленных работах. Кроме того, возможность кокультивирования клеток позволяет получить трансплантаты, наиболее близ кие к нативному органу. Перспективным выглядит использование децеллюляризованного МКМ, одна ко для понимания эффектов использования данных структур в организме необходимы опыты in vivo. Коммитированные клетки пока не удается с до статочной эффективностью приблизить к фенотипу β-клеток in vitro. Таким образом, основной задачей клеточной биологии остается поиск доступного ис точника клеток, способных к эффективной диффе ренцировке в инсулинпродуцирующие клетки и глю козозависимой секреции инсулина.

Об авторах

M. A. Борисов

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России; Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

O. С. Петракова

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

И. Г. Гвазава

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России; Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

E. Н. Калистратова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

A. В. Васильев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: PetrakovaOl@yandex.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы