Антиретровирусная активность нового производного пиримидил-ди(диазодиспироалкана)

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Считается, что наиболее перспективным направ лением в области поиска как противовирусных, так и противомикробных лекарственных препаратов, является поиск соединений, блокирующих взаимо действие между патогеном и клеткой хозяина. Этот подход имеет ряд преимуществ, особенно в случае противовирусных средств, поскольку активному соединению нет необходимости проникать внутрь клетки, что позволяет резко снизить как цитоток сичность, так и общую токсичность используемого вещества. Действительно, на первом этапе развития вирус ной инфекции происходит адгезия вируса к клетке, что реализуется через связывание специфических вирусных белков с определенными молекулами кле точной поверхности. Наиболее часто адгезия осу ществляется за счет специфического присоединения к гепарансульфатпротеогликанам (HSPG), находя щимся на поверхности клетки. Известно, что этот механизм используют такие вирусы, относящиеся к разным семействам, как герпесвирусы типа 1 и 2 (HSV-1, -2) [1], папилломавирусы (HPV) [2], цитоме галовирус человека (HCMV) [3], некоторые штаммы вируса иммунодефицита человека (HIV) [4], респи раторно-синцитиальный вирус человека (HRSV) [5], вирусы гепатита В и С (HBV и HCV) [6] и др. Наиболее известным и подробно изученным ин гибитором процесса адгезии является N,N-бис(1 оксидо[1, 2, 5]оксадиазоло[3, 4d]пиримидин-7-ил)-3,12-диаза-6,9-диазония(5,2,5,2)диспирогексадекана дихлорид 1 (рисунок), ранее синтезированный нами. Показано, что данное соединение 1 и его аналоги, включающие диспиротрипиперазиновый фрагмент, эффективно обратимо связываются с HSPG клетки и таким образом препятствуют прикреплению ви русов [7]. Диспиросоединение 1 ингибирует реплика цию у представителей семейства вирусов герпеса [8], а также вирусов других семейств, использующих HS в качестве рецептора либо корецептора [3]. Однако метаболическая нестабильность соединения 1, обу словленная разложением с выделением оксида азота, не позволила изучить его биологические свойства [9]. Поэтому нами была предпринята попытка полу чения нового производного диспиротрипиперазиния: проведен дизайн оптимального соединения, способ ного связываться с известными HSPG с учетом по тенциальной метаболической стабильности целевого соединения, и осуществлен синтез 3,3’-(2-метил-5 нитропиримидин-4,6-диил)бис-3,12-диаза-6,9 диазониадиспиро[5.2.5.2]гексадекан тетрахлорид дигидрохлорида 2. Предполагалось, что диспиропи перазин 2, представляя собой химически более ста бильную структуру, будет так же эффективно блокировать HSPG клетки и тем самым препятствовать адгезии вируса к клетке, что должно привести к на рушению жизненного цикла вируса и снижению его титра. В настоящей работе мы сообщаем о высокой анти ретровирусной активности нового производного диспиротрипиперазиния 2, что полностью подтверж дает выдвинутую нами гипотезу. В данный момент диспиросоединение 2 проходит углубленные докли нические исследования. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Исследования проводили в Национальном институте рака (National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, США). Противовирусную активность определяли с использованием ХТТ-теста [10] при различных концентрациях соединения и инкубировании клеток (линии CEM-SS, MT-2, MT-4) в присутствии серий ных разведений диспиропиперазина 2 (растворя ли в диметилсульфоксиде, DMSO) в течение 6 дней при температуре 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2 с последующим добавлением реагентов ХТТ. Метод основан на спектрометрическом определении уровня формазана, трансформированного живыми клетками из водорастворимой тетразолиевой соли ХТТ. Использовали следующие штаммы ВИЧ: эталон ный HIV-1 IIIB; чувствительные к азидотимиди ну HIV-1 6S, HIV-1 RF; лекарственно-устойчивые штаммы HIV-1 N119 (устойчив к невирапину, му тация Y181C), HIV-1 DPS (устойчив к дифенил сульфону, мутация Y181C) и HIV-1 A-17 (устойчив к невирапину, мутации К103N, Y181C). Также использовали штамм HIV-2 ROD и вирус иммуноде фицита обезьян SIV MAC 251. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Результаты, представленные в таблице, показыва ют, что синтезированный нами диспиротрипипера зин 2 эффективно ингибирует репликацию HIV-1 и -2 и SIV. При этом, в отличие от полученных ранее данных об активности соединения 1 против вирусов герпеса, наблюдали достаточно широкий диапазон чувствительности HIVи SIV. Среди проверенных штаммов наиболее чув ствительными к ингибирующему действию диспи росоединения 2 оказались HIV-1 6S и HIV-1 DPS - IC50 = 1.37 и 1.17 мкM соответственно. В отличие от этих штаммов, HIV-1 RF оказался в 100 раз менее чувствительным к исследуемому соединению (IC50 = 150 мкM). В отличие от вирусов HSV, где значения IC50 уста навливались в одном диапазоне, как и значения, за даваемые для всех испытываемых штаммов (от 8.2 до 20.4 мкM), ингибирование репликации HIV сильно зависело от используемых штаммов, где значения IC50 варьировались от 150 мкM (HIV-1 RF на клеточ ной линии CEM-SS) до 1.4 мкM (HIV-1 6S на клет ках MT-2). В случае штамма HIV-1 A-17 значения IC50 определяли на разных клеточных линиях, и они варьировали от 33.7 мкМ в линии МТ-4 до 4.7 мкM в линии МТ-2. Столь существенные различия в значениях IC50 (как для одной клеточной линии, но разных штам мов HIV, так и для одного штамма, но на разных кле точных культурах) могут быть обусловлены двумя причинами. Во-первых, различные клеточные линии могут иметь разную концентрацию поверхностных гепарансульфатпротеогликанов. Во-вторых, досто верно показано, что штаммы ВИЧ значительно от личаются друг от друга по эффективности исполь зования корецепторов (CCR5 и CXCR4) на этапе прикрепления к клетке-мишени [11]. В отличие от вирусов герпеса, структура присое динения HIV при поддержке гепарансульфата до сих пор не получила подтверждения методом рентгено структурного анализа, и возможность взаимодей ствия с клеткой хозяина с использованием гепаран сульфатпротеогликанов для HIV известна только по литературным данным. Предполагается, что новый класс производных пиримидил-ди(диазодиспироалканов) можно будет использовать в качестве противовирусных средств. На это указывают такие факторы, как специфичность ингибирующего действия, показанная на примере диспиротрипиперазиния 2 в отношении штаммов вирусов; способность диспиросоединений формировать очень стабильные связи с некоторыми вирусными рецепторами или корецепторами; состав с химически определяемой низкой молекулярной массой [7]. Необходимо отметить, что такой механизм дей ствия очень перспективен в плане преодоления резистентности вирусов к официнальным лекарствен ным средствам, так как он воздействует не на сам вирус, а на клетку. Благодаря указанным свойствам соединения данного класса могут служить ценным инструментом для изучения взаимодействий между вирусом и клеткой.

Об авторах

E. A. Новоселова

ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС»

Автор, ответственный за переписку.
Email: helen.novoselova@gmail.com
Россия

O. Б. Рябова

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: helen.novoselova@gmail.com
Россия

И. A. Ленева

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: helen.novoselova@gmail.com
Россия

В. Г. Нестеренко

ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС»

Email: helen.novoselova@gmail.com
Россия

Р. Н. Болгарин

ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС»

Email: helen.novoselova@gmail.com
Россия

В. A. Макаров

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: helen.novoselova@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы