Картирование в энхансере En1A Drosophila melanogaster модулей, обеспечивающих активацию транскрипции и дистанционное взаимодействие с промотором

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Одна из ключевых особенностей энхансеров - способность специфично активировать транскрипцию гена-мишени, иногда удаленного на расстояния, достигающие десятков и даже сотен тысяч пар нуклеотидов [1]. Однако механизмы поддержания специфичных дистанционных взаимодействий между энхансерами и промоторами остаются почти неизученными. Известно, что в ряде случаев в обеспечении коммуникации между энхансером и промотором участвуют цис-регуляторные последовательности, найденные в промоторных областях эукариотических генов [2-4]. Полученные нами ранее данные [5] позволяют предположить, что специфичность некоторых энхансеров обеспечивается присутствием в них сайтов связывания факторов транскрипции (ТФ), отвечающих за активацию транскрипции, и сайтов связывания белков, обеспечивающих стабильное дистанционное взаимодействие между энхансером и промотором. Цель представленной работы состояла в изучении нового энхансера Еn1А, обнаруженного в ин троне неизученного гена CG3777, расположенного на Х-хромосоме. Показано, что энхансер Еn1А имеет модульное строение. В составе Еn1А мы обнаружили активаторный и коммуникаторный элементы. Активаторный элемент способен функционально заменять энхан серы тела и крыльев гена yellow, т.е. стимулировать транскрипцию в соответствующих кутикулярных структурах. Коммуникаторный элемент необходим для взаимодействия Еn1А с промотором гена yellow и способен обеспечивать дистанционную GAL4 зависимую активацию транскрипции. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Все конструкции созданы на основе вектора pCaSpeR3, содержащего ген mini-white. Производный от pCaSpeR3 плазмидный вектор pCΔ, содержащий делецию гена mini-white, описан ранее [6]. В конструкциях EcoRI-PstI-Y, PstI-PvuII-Y, HindIII-y+s-Y использованы соответствующие ре стрикционные фрагменты химерного элемента из аллеля y+s. Эти фрагменты были встроены перед промотором гена yellow в положение -343 п.н. (здесь и далее, в том числе на рисунках, нумерация в локусе yellow исчисляется по отношению к сайту инициации транскрипции гена) по сайту рестрикции KpnI. При создании конструкции (а1-а2)Y использована кДНК гена yellow, не содержащая интрон и энхансер щетинок (pCaSpeR3-Yil). Фрагмент размером 362 п.н. был амплифицирован с геномной ДНК мух линии y+s с помощью прайме ров a1 (5’-CTTTTTGCATACACATCCAC-3’) и a2 (5’-GCTGATGGAAGTTGCAGA-3’) и клонирован в вектор на основе плазмиды pBlueScript между двумя loxР-сайтами по EcoRV-сайту (а1-а2/lox). Затем фрагмент а1-а2/lox клонировали в вектор pCaSpeR3-Yil по KpnI-сайту в положение -343 п.н. Во всех перечисленных конструкциях была делетирована регуляторная последовательность гена yellow до -343 п.н. (фрагмент XbaI-Eco47III). Для получения вектора, не содержащего энхан серы тела и крыльев гена yellow, фрагмент XbaI- Eco47III, включающий энхансеры тела и крыльев, был удален из вектора pCΔ, содержащего полную последовательность гена yellow (CΔ-y (-890)). В конструкциях YG4(Сm1А), eveYG4(Сm1А) и ΔeveYG4(Сm1А) фрагмент ДНК, содержащий 10 сайтов связывания дрожжевого белка-активатора GAL4 (две копии по пять сайтов связывания из плазмидного вектора pUAST), был встроен в вектор CΔ-y (-890) на 3’-конец гена yellow по сайту рестрикции SmaI, а фрагмент а1-а2/lox - по сайту рестрикции SacI. Замена последователь ности -68… +130 п.н в промоторе гена yellow на по следовательность промотора гена eve и получение предпромоторной делеции -69… -100 п.н. описаны ранее [2]. ДНК конструкций и Р-элемента с дефектными ин вертированными повторами P25.7wc, использованно го как источник транспозазы, инъецировали в линию yacw1118 на стадии пребластодермального эмбрио на. Выживших мух скрещивали с линией yacw1118. Трансгенных мух отбирали на основе фенотипиче ского проявления экспрессии генов white и yellow. Для дальнейшей работы выбрали линии с един ственной копией конструкции в геноме, что было подтверждено с помощью Саузерн-блот-анализа. Детали клонирования последовательностей гена yellow в со став векторов, молекулярные методы исследования, трансформация эмбрионов и получение трансгенных линий дрозофил, фенотипический анализ экспрессии гена yellow в трансгенных линиях, индукция сайт специфической рекомбинации между сайтами loxР и индукция GAL4-зависимой активации в трансгенных линиях подробно описаны в предыдущих работах [2, 5, 6]. Для индукции экспрессии дрожжевого белка GAL4 использовали линию yw1118; P[w+, tubGAL4]117/ TM3, Sb (Bloomington Center #5138). Для индукции рекомбинации между сайтами loxР использовали линию y ac w1118;Cyo, P[w+,cre]/Sco. Нуклеотидная последовательность гена CG3777, структура и профиль его экспрессии приведены в базе данных FlyBase (http://flybase.org/reports/FBgn0024989.html). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ У Drosophila melanogaster ген yellow отвечает за пиг ментацию кутикулярных структур - тела, крыльев и щетинок. Энхансеры, контролирующие экспрес сию yellow в кутикуле тела и крыльях, расположены на 5’-конце гена, тогда как энхансер, контролирую щий экспрессию в щетинках, находится в интроне [7]. У мух дикого типа тело, крылья и щетинки имеют темную окраску. В работах по изучению регуляции транскрипции у D. melanogaster в качестве модельной системы часто используется аллель y2. В аллеле y2 между про мотором и энхансерами тела и крыльев гена yellow встроился ретротранспозон МДГ4 (gypsy) [8]. В ре зультате находящийся в составе МДГ4 инсулятор Su(Hw) блокирует активацию гена yellow энхансера ми тела и крыльев. Таким образом, фенотип y2 характеризуется желтой окраской тела и крыльев и одно временно темной окраской щетинок. Супернестабильный аллель y+s ( рис. 1А) получен вследствие индукции Р-М гибридного дисгенеза в линии, содержащей мутацию y2 [9]. Также получены производные аллеля y+s - y2s1 и y2s2, содержащие в предпромоторной области гена yellow дупликации района 1А хромосомы Х [9, 10]. Изучение структуры аллелей y2s1 и y2s2 позволило идентифицировать в составе дуплицированного фрагмента из района 1А регуляторный элемент 1A-RE, который активирует экспрессию yellow на большом расстоянии и является инсулятором, специфичным для гена yellow [10]. В представленной работе мы продолжили детальное изучение структуры аллеля y+s. Мутация y+s возникла в результате внедрения химерного элемента размером 5.4 т.п.н. в положение -69 п.н. и одновременной делеции последова тельности yellow между -146 и -70 п.н. Химерный элемент состоял из Р-элементов размером 1.2 т.п.н., расположенных «хвост к хвосту», и заключенной между ними последовательности длиной 3030 п.н., представляющей собой дупликацию района 1А хромосомы Х, находящегося в геноме дистальнее локуса yellow (рис. 1А) [9]. Эта дупликация включала фрагмент неизученного гена CG3777, который экспрессируется на тех же стадиях развития, что и ген yellow. Тело и крылья мух, несущих аллель y+s, имеют темную окраску, близкую по интенсивности к окраске мух дикого типа. Следовательно, при перемещении к гену yellow участка из района 1А хромосомы Х экспрессия гена в теле и крыльях активирована, несмотря на то, что соответствующие энхансеры заблокированы инсулятором Su(Hw). При помощи трансгенных конструкций (рис. 1Б) в перемещенной последовательности ДНК нам удалось локализовать энхансер размером 1748 п.н., названный энхансер 1А (Еn1А). Сначала мы протестировали два рестрикцион ных фрагмента, которые совместно перекрывают большую часть дупликации из района 1А: EcoRI- PstI длиной 771 п.н. и PstI-PvuII длиной 1748 п.н. (рис. 1А). В трансгенных конструкциях EcoRI-PstI-Y и PstI-PvuII-Y эти фрагменты находились перед промотором гена yellow в позиции -343 п.н. (рис. 1Б). Обе конструкции не содержали энхансеров тела и крыльев. В линиях, несущих конструкцию EcoRI- PstI-Y, в 19 случаях из 20 мухи имели неокрашенные тело и крылья. В трансгенных линиях PstI-PvuII-Y фенотип мух был близок к фенотипу дикого типа в 23 из 31 полученной линии, что доказывает способность фрагмента размером 1748 п.н. функциональ но заменять энхансеры тела и крыльев гена yellow. Следовательно, энхансер Еn1А локализован в преде лах участка PstI-PvuII. Для точного картирования Еn1А созданы две ге нетические конструкции, содержащие отдельные фрагменты PstI-PvuII, встроенные в положение -343 п.н. - HindIII-PvuII-Y и (а1-а2)Y (рис. 1Б). Фрагмент HindIII-PvuII длиной 1511 п.н. (рис. 1А) не обладал свойствами энхансера: во всех 10 трансгенных ли ниях HindIII-PvuII-Y тело и крылья мух имели жел тую окраску (рис. 1Б). При биоинформатическом анализе структуры последовательности PstI-PvuII был выделен фрагмент размером 362 п.н., включающий повторяющиеся мотивы, которые, возможно, являются сайтами связывания регуляторных белков. Этот фрагмент ДНК был амплифицирован при помо щи ПЦР с использованием праймеров а1 и а2, а за тем в составе конструкции (а1-а2)Y помещен перед промотором гена yellow (рис. 1Б) Фрагмент а1-а2 окружен сайтами узнавания рекомбиназой Cre (loxР сайты), позволяющими вырезать исследуемый эле мент in vivo [11]. Нужно отметить, что в конструкции (а1-а2)Y кДНК гена yellow не содержала энхансер щетинок (рис. 1Б). Мы получили 17 трансгенных линий, несущих данную конструкцию. Несмотря на отсутствие энхансера щетинок, мухи всех линий имели фенотип y2. Вырезание последовательности а1-а2 приводило к исчезновению пигментации щети нок в 12 линиях из 15. Таким образом, в конструкции (а1-а2)Y изучаемый фрагмент 362 п.н. взаимодействовал с промотором и стимулировал экспрессию yellow в щетинках, но не был способен функционально заменить энхансеры тела и крыльев. Полученные результаты позволили предполо жить, что энхансер Еn1А имеет неоднородную структуру. Одна его часть размером 362 п.н. (а1-а2), полу чившая название «коммуникаторной» (далее Cm1A), самостоятельно стимулирует экспрессию гена yellow только в щетинках, однако она необходима для стимуляции полноразмерным Еn1А экспрессии yellow в теле и крыльях. Другая часть последовательно стиPstI-PvuII размером 1386 п.н. способна инду цировать высокий уровень экспрессии yellow в теле и крыльях лишь в комбинации с коммуникаторной частью (рис. 1А,Б). Полноразмерный Еn1А размером 1748 п.н. активирует транскрипцию гена yellow во всех кутикулярных структурах. Возможно, фрагмент 1386 п.н. содержит сайты связывания актива торов транскрипции yellow в теле и крыльях, но их взаимодействие с промотором обеспечивают белки, связывающие последовательность Cm1A. Для дальнейшего изучения коммуникаторных свойств элемента Cm1A мы использовали модель ную систему, основанную на свойствах дрожжевого активатора GAL4. Известно, что в геноме дрозофилы этот активатор способен стимулировать промоторы различных генов [2]. Однако GAL4, расположенный на 3’-конце изучаемого гена, не способен активировать транскрипцию [12]. В конструкции YG4(Сm1А) сайты связывания белка GAL4 и окруженный loxР сайтами потенциальный коммуникатор Сm1А были встроены на 3’-конец гена yellow. При этом 5’-после довательность yellow, содержащая энхансеры тела и крыльев (до -890 п.н.), была делетирована (рис. 2). В семи трансгенных линиях, несущих конструкцию YG4(Сm1А), мухи имели фенотип y2. Таким образом, в отсутствие GAL4-активации фрагмент Сm1А не способен самостоятельно активировать транскрипцию гена yellow в теле и крыльях. Затем мы скрестили трансгенные линии YG4(Сm1А) с ли нией, экспрессирующей белок GAL4. В результате GAL4-активации тело и крылья мух во всех линиях приобрели более темную окраску (рис. 2). Делеция Сm1А приводила к снижению экспрессии yellow до исходного уровня. Следовательно, элемент Сm1А действительно обладает свойствами коммуникатора. В составе конструкции YG4(Сm1А) он обеспечивает стабильное дистанционное взаимодействие между GAL4-активатором и промотором гена yellow. Ранее в промоторной области гена yellow в положении -69… -100 п.н. нами был локализован TE, обе спечивающий дистанционные взаимодействия энхансеров тела и крыльев с промотором гена yellow, а также с гетерологичным промотором гена eve [2]. Мы предположили, что коммуникатор Сm1А функ ционально взаимодействует именно с TE гена yellow. Для проверки этого предположения были созданы конструкции eveYG4(Сm1А) и ΔeveYG4(Сm1А) (рис. 2). В обеих конструкциях промотор гена yellow был заменен на гетерологичный промотор гена eve (-68… +130 п.н.) (рис. 3). Кроме того, в конструкции ΔeveYG4(Сm1А) последовательность ТЕ гена yellow была делетирована (рис. 2, 3). Результаты, полученные при фенотипическом анализе пяти трансгенных линий eveYG4(Сm1А), были аналогичны результатам анализа линий YG4(Сm1А). Как и в преды дущем случае, коммуникатор обеспечивал GAL4 зависимую активацию транскрипции гена yellow. Поскольку структура промоторов yellow и eve раз лична (рис. 3), можно утверждать, что коровые элементы промотора не участвуют в функциональном взаимодействии с Сm1А. В шести трансгенных ли ниях, несущих конструкцию ΔeveYG4(Сm1А), акти вация GAL4 не приводила к изменению исходного фенотипа y2 (рис. 2). Следовательно, в отсутствие TE гена yellow коммуникатор Сm1А не способен поддерживать дистанционное взаимодействие между активатором транскрипции и промотором гена. Вероятно, белки, связывающие коммуникаторный элемент Сm1А, способны взаимодействовать с белками, ко торые привлекаются на TE гена yellow. В описан ной модельной системе такое взаимодействие про странственно сближает GAL4-активатор и промотор, что делает возможным контакт между активационным комплексом, собирающимся на последовательностях GAL4, и транскрипционным комплексом про мотора. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Представленные данные позволяют заключить, что новый энхансер Еn1А имеет модульное строение. В предыдущей работе мы доказали, что регуляторная система гена white также включает элементы, не влияющие на транскрипцию, но обеспечивающие дистанционное энхансер-промоторное взаимодействие. В предпромоторной области и в составе энхансера глаз гена white присутствуют сайты связывания белка Zeste. Белок Zeste не участвует в активации транскрипции, но, связываясь со своими сайтами, позволяет энхансеру глаз активировать находящийся на значительном расстоянии промотор [5]. Результаты данной работы свидетельствуют в пользу предположения, что регуляторные области раз личных генов имеют модульное строение и включают в свой состав активаторные элементы, с которыми связываются транскрипционные факторы, иници ирующие и поддерживающие эффективную транскрипцию, и элементы-коммуникаторы, с которыми связываются белки, обеспечивающие пространственное сближение энхансера и промотора. Описанные модельные системы могут использоваться для из учения структуры энхансеров и выявления последовательностей, участвующих в дистанционных взаимодействиях между регуляторными элементами генома.

Об авторах

Л. С. Мельникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: lsm73@mail.ru
Россия

Е. A. Померанцева

Email: lsm73@mail.ru
Россия

В. В. Молодина

Email: lsm73@mail.ru
Россия

П. Г. Георгиев

Email: lsm73@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы