Экспансия гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток пуповинной крови ex vivo

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В конце прошлого века пуповинная кровь (ПК) при- влекла большой интерес ученых и врачей-транс- фузиологов в связи с успешным использованием в качестве альтернативы гемопоэтическим клеткам костного мозга. В настоящее время ПК применяет- ся не только для гематологических трансплантаций. Перечень заболеваний и патологий, при которых воз- можно использование ПК, с каждым годом увеличи- вается. Следует отметить, что ПК содержит клетки крови различной степени зрелости, включая диффе- ренцированные форменные элементы и гемопоэти- ческие стволовые и прогениторные клетки (ГСПК), а также другие типы клеток, в том числе недиффе- ренцированные соматические стволовые клетки [1- 5], мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) [6-9] и эндотелиальные прогениторные клетки [10]. Если рассматривать пуповинную кровь в качестве трансплантата кроветворной ткани, то бесспорным ее преимуществом является неинвазивный способ получения, доступность, безопасность для донора и меньшая по сравнению с костным мозгом или мо- билизованной периферической кровью частота и тя- жесть развития реакции «трансплантат против хо- зяина» [11-13]. Однако из-за небольшого содержания ГСПК ПК имеет и недостатки, связанные с медлен- ным восстановлением кроветворения и иммуните- та. ПК существенно отличается от костного мозга или мобилизованной периферической крови количеством, составом и свойствами гемопоэтических кле- ток. ГСПК пуповинной крови, в отличие от костно- мозговых, находятся вне клеточного цикла, однако достаточно быстро дают сильный пролиферативный ответ на стимуляцию ростовыми факторами [14-17]. Способность ГСПК ПК к экспансии ex vivo в ответ на стимуляцию легла в основу разработки различных подходов к увеличению содержания кроветворных клеток в трансплантатах ПК. Существуют две основные стратегии увеличения количества гемопоэтических клеток после выделе- ния мононуклеарной фракции из ПК: одна из них основана на экспансии коммитированных гемопоэти- ческих предшественников, а другая - на увеличении количества клеток с большим пролиферативным по- тенциалом - ГСПК [18]. В первом случае использова- ние коммитированных клеток позволяет сократить период восстановления кроветворения после транс- плантации, а во втором - пропадает необходимость введения дополнительной единицы ПК. Так, если использовать для трансплантации мононуклеарные клетки пуповинной крови после ex vivo наращивания коммитированных предшественников, то для долго- срочного восстановления кроветворения после апла- зии костного мозга пациентам необходимо вводить дополнительную единицу ПК, не подвергшуюся каким-либо манипуляциям и содержащую ГСПК. Если в ходе ex vivo экспансии получены клетки, об- ладающие большим пролиферативным потенциалом и способные длительно поддерживать кроветворение (long-term repopulating cells), то дальнейшие мани- пуляции позволят получить как малодифференциро- ванные клетки, так и коммитированные, что сможет гарантировать краткосрочное и длительное вос- становление кроветворения после трансплантации. Такой подход позволит избежать введения дополни- тельной единицы ПК. Стоит отметить, что, помимо описанных, существуют другие стратегии повыше- ния эффективности ПК, направленные не на экспан- сию, а на обеспечение действенного хоминга и при- живления трансплантируемых клеток [19-25]. ОСНОВНЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ЭКСПАНСИИ ГСПК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ex vivo При создании эффективных и контролируемых ме- тодических подходов, обеспечивающих получение большого количества ГСПК, основное внимание на- правлено на подбор компонентов ростовых сред и ме- тодов выделения малодифференцированных клеток. Между тем в большинстве существующих моделей культивирования ГСПК из ПК недооцененной оста- ется роль локального микроокружения: взаимодей- ствий со стромальными элементами, паракринной регуляции и концентрации кислорода (рис. 1). Использование обогащенной фракции ПК Выбор между использованием нефракционирован- ного образца кроветворной ткани или проведени- ем селекции - первая задача при подборе подхода к экспансии клеток пуповинной крови. Селекция проводится с помощью моноклональных антител к специфическим маркерам с магнитными или флу- оресцентными метками. Возможна положительная селекция, когда из исходно гетерогенного материа- ла выделяют определенные типы клеток, либо от- рицательная, при которой происходит удаление не- желательных клеток непосредственно из суспензии. Показано, что с использованием обогащенной гемо- поэтическими клетками фракции удается добиться лучшего результата при экспансии in vitro [26]. Наиболее распространенные маркеры для пози- тивной селекции гемопоэтических стволовых кле- ток - CD34 и CD133, однако при их использовании из экспансии исключаются клетки, негативные по данным антигенам, но обладающие свойствами стволовых [27]. Присутствие тех или иных поверх- ностных маркеров не свидетельствует о физиоло- гических особенностях клетки, будь то способность к самообновлению, пролиферации или дифференцировке. Кроме того, экспрессия фенотипа не всегда может быть устойчивой. Так, Summers и соавт. по- казано, что популяция CD34-Lin--клеток пуповинной крови генерирует CD34+-ГСПК при культивирова- нии с использованием стромальных клеток костно- го мозга мышей [28]. В данном подходе есть и другие недостатки: требуется большое количество исходных клеток, в процессе выделения часть гемопоэтиче- ских клеток теряется [29]. Отказ от предварительной процедуры иммуносепарации позволяет избежать возможного повреждения клеток при проведении большого количества лабораторных манипуляций (центрифугирование, ресуспендирование и др.), а также изменения функционального состояния кле- ток, опосредованного связыванием антител с поверх- ностными молекулами [30]. В настоящее время опубликованы работы, в кото- рых для экспансии ГСПК используют нефракцио- нированную ПК [31-33]. В то же время разработаны подходы, в которых часть одной единицы пуповинной крови вводят реципиенту без какой-либо обработки, а другую часть используют для экспансии с предвари- тельным обогащением (CD34+ или CD133+ селекция). Таким образом, трансплантат сохраняет свой иммуно- логический потенциал, что увеличивает его прижив- ление и иммунологическое восстановление [34, 35]. Растворимые компоненты систем культивирования Традиционным компонентом для культивирования большинства типов клеток человека, включая ГСПК, является фетальная телячья сыворотка (ФТС), со- держащая природный коктейль факторов роста, медиаторов адгезии, минеральных веществ, липи- дов и гормонов. Однозначного мнения о возможности клинического применения клеток после их экспансии с использованием ФТС не существует. К недостаткам сыворотки можно отнести трудность стандартиза- ции состава, возможность вирусной контаминации, а также высокий риск иммунизации реципиента чу- жеродными белками [36, 37]. В этой связи некоторые исследователи отказываются от ФТС в пользу ци- токиновых коктейлей [26, 38]. Тем не менее следует учитывать, что в сыворотке присутствуют минорные компоненты, действие которых до сих пор не иденти- фицировано и не может быть полностью скомпенси- ровано бессывороточными средами. В настоящее время известно большое количе- ство растворимых факторов, влияющих на проли- ферацию и дифференцировку ГСПК. Различные их комбинации могут определять сроки и степень экс- пансии культивируемых клеток. Клетки ПК так же, как клетки периферической крови, синтезируют цитокины. В частности, Т-клетки, ЕК-клетки и ма- крофаги ПК продуцируют гранулоцитарный коло- ниестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоци- тарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониести- мулирующий фактор, интерлейкины 2, 3 и 4 (IL-2, -3, -4), трансформирующий фактор роста (TGF-β), интерферон-γ [39-41]. Однако количество синтезиру- емого медиатора, его биологическая активность и ко- личество продуцирующих клеток в ПК значительно меньше, чем в периферической крови. Несмотря на обилие рекомбинантных цитокинов, применяемых для экспансии малодифференциро- ванных гемопоэтических предшественников, опти- мальной комбинации, утвержденной для использо- вания в клинической практике, пока не существует. Наиболее часто используются фактор стволовых клеток (SCF), IL-3 и -6, G-CSF, тромбопоэтин (TPO) и лиганд Flt-3 [42, 43]. Следует отметить, что важен не только выбор факторов, но также их концентрация и последова- тельность применения. Так, использование (в тече- ние первых 3 дней) цитокинов SCF, IL-3, Flt-3, TPO и среды, содержащей 4% фетальной телячьей сы- воротки для культивирования ГСПК, с последую- щим переводом клеток на среду, содержащую 20% фетальной телячьей сыворотки и макрофагальный колониестимулирующий фактор, Flt-3, IL-3, SCF, способствует экспансии CD34+ клеток [43]. Факторы роста SCF, Flt-3, IL-11, IL-3, IL-6, GM-CSF отвечают за пролиферацию клеток, в то время как макрофа- гальный колониестимулирующий фактор, G-CSF, эритропоэтин (EPO) и TPO отвечают за дифферен- цировку и созревание клеток. Цитокины SCF, IL-3 и IL-6 действуют в фазе G0/G1 клеточного цикла и, работая вместе, индуцируют митоз [44]. Тем не менее для экспансии гемопоэтических клеток применяют и другие комбинации цитокинов. Haylock и соавт. показали, что при использовании со- четания IL-lβ, IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF и SCF сте- пень экспансии выше, чем при использовании ком- бинаций, в которых не хватает какого-либо из этих шести цитокинов [45]. Стоит отметить, что существуют факторы, при- сутствие которых в среде культивирования умень- шает степень экспансии гемопоэтических клеток. Показано, что IL-8, тромбоцитарный фактор-4, ин- дуцируемый IFN-γ белок и моноцитарный хемотак- сический фактор-1 in vitro снижают пролиферацию колониеобразующих единиц гранулоцитов, эритро- цитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ), гранулоцитов и моноцитов (КОЕ-ГМ) и бурстобразу- ющих единиц эритроцитов (БОЕ-Э), стимулирован- ных ростовыми факторами [46, 47], а макрофагаль- ный белок воспаления α подавляет пролиферацию стволовых клеток мышей, соответствующих КОЕ-С 12 (колониеобразующие единицы селезенки, дающие начало гранулоцитарным, моноцитарным, эритро- идным, мегакариоцитарным и лимфоидным колони- ям на 12-е сутки после трансплантации облученным животным), и более ранних клеток КОЕ-Бл (клетки, образующие в культуре колонии бластных клеток) у мышей в системе ex vivo [48]. При культивировании с использованием только растворимых факторов гемопоэтические клетки ли- шаются поддерживающего влияния микроокруже- ния: межклеточных взаимодействий с негемопоэти- ческими клетками, компонентов тканевого матрикса и паракринных медиаторов. С другой стороны, добав- ление в среду экзогенных цитокинов при использова- нии фидерных клеток, продуцирующих SCF и IL-6, а также многие другие паракринные факторы, спо- собствует поддержанию гемопоэтических предше- ственников, но не является строго обязательным. МОДЕЛИРОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ ДЛЯ ЭКСПАНСИИ ГСПК ПК eх vivo Справедливости ради стоит сказать, что первые этапы изучения гемопоэтических стволовых клеток взрослого организма были связаны с созданием есте- ственного микроокружения [49, 50]. Так, начальные попытки культивирования суспензионных гемопо- этических культур показывали быстрое угасание гемопоэза и замещение гемопоэтических клеток ма- крофагами. Использование системы культивирова- ния, содержащей подложку из клеток костного мозга, позволило получить культуру, содержащую кровет- ворные предшественники, обладающие свойства- ми гемопоэтических стволовых клеток интактного костного мозга [49]. Дальнейшие исследования были направлены на создание различных модификаций и усовершенствований данной системы культивиро- вания. Сокультивирование со стромальными клетками Сокультивирование со стромальными фидерными клетками представляет собой более физиологичную альтернативу использованию рекомбинантных ци- токинов, которое применялось с самого начала из- учения костномозговых гемопоэтических клеток [49]. В настоящее время активно проводится поиск новых линий клеток, поддерживающих экспансию in vitro ГСПК при сокультивировании [51]. Совместное культивирование гемопоэтических предшествен- ников с различными типами клеток, проявляющих фидерные свойства по отношению к ним, не только применимо для экспансии малодифференцирован- ных предшественников в целях их клинического ис- пользования, но также позволяет исследовать взаи- моотношения клеток в пределах кроветворной ниши. Традиционным и наиболее практичным подходом является использование мезенхимальных стромаль- ных клеток в качестве фидерного подслоя для экс- пансии ГСПК in vitro [52-59]. Помимо того, что МСК проявляют фидерные свойства по отношению к ге- мопоэтическим клеткам, они обладают высокой про- лиферативной активностью, а также более доступны, чем иные типы фидерных клеток человека (напри- мер, дуктальные эпителиоциты или спленоциты) [60]. Показано, что стромальные клетки костного мозга в Dexter-культурах могут поддерживать кроветво- рение in vitro более 6 месяцев [49]. Некоторые ис- следователи используют МСК после направленной дифференцировки в остеобласты, создавая таким об- разом подобие эндостальной ниши [61]. МСК и более дифференцированные стромальные клетки секретируют различные цитокины [62-64]. Практически все данные о продукции цитокинов МСК человека получены на культуре клеток, по- этому о том, как каждый цитокин вовлечен в пара- кринную регуляцию in vivo, с уверенностью сказать нельзя. Тем не менее показано, что МСК продуциру- ют большое количество цитокинов, поддерживающих ГСПК в состоянии покоя или способствующих их са- мообновлению, в частности SCF, фактор, ингибирую- щий лейкозные клетки, фактор стромальных клеток 1 (SDF-1), онкостатин М, морфогенетический белок кости-4, лиганд Flt-3, TGF-β, IL-1, -6, -7, -8, -11, -12, -14, -15 [62, 63]. Кроме того, при добавлении в среду культивирования IL-1α МСК могут продуцировать такие факторы роста, как GM-CSF и G-CSF, влияю- щие на более зрелые гемопоэтические предшествен- ники, что свидетельствует о взаимной регуляции МСК и гемопоэтических клеток [65-67]. Исследователи, моделируя in vitro условия кост- номозговой ниши, используют МСК из различных источников [52, 54, 68]. Наиболее часто используемы- ми и поэтому хорошо охарактеризованными явля- ются МСК из костного мозга. МСК получены также из стенки сосудов, синовиальной мембраны, плацен- ты, пуповинной крови, субэндотелиального слоя пу- почной вены. Между МСК из различных источников существуют некоторые отличия, касающиеся экс- прессии ряда маркеров, способности к пролиферации и дифференцировке, но в целом их характеристики сходны [69-72]. Известно, что МСК из стромально-ва- скулярной фракции жировой ткани человека способ- ны поддерживать гемопоэз in vitro [53, 73]. Поэтому они представляют хорошую альтернативу МСК из костного мозга и легкодоступный источник фидер- ных клеток для экспансии ГСПК ПК с целью широко- масштабного клинического использования [74]. McNiece и соавт. разработали протокол культиви- рования ГСПК, согласно которому 14-дневная экс- пансия клеток ПК обеспечивается совместным их культивированием с МСК из костного мозга в при- сутствии гемопоэтических цитокинов в течение 7 дней, а также культивированием в течение 7 дней в присутствии только цитокинов [52]. С помощью дан- ной методики удалось существенно сократить время восстановления нейтрофилов и тромбоцитов после трансплантации двух единиц ПК, одна из которых была обогащена ГСПК с использованием описанного протокола. Таким образом, применение фидерных слоев для экспансии ГСПК ПК позволяет ограничить использование экзогенных факторов роста без сни- жения эффективности амплификации клеток. Тканевое содержание кислорода Содержание кислорода - один из основных некле- точных факторов кроветворного микроокружения, участвующих в регуляции развития гемопоэтиче- ских клеток. В костном мозге содержание кислорода варьирует от 1 до 6%, при этом в области гипоксии находятся покоящиеся ГСПК, тогда как в местах с более высоким содержанием кислорода - проли- ферирующие ГСПК [75]. Низкое парциальное давле- ние кислорода играет важную роль в поддержании тех или иных физиологических свойств гемопоэти- ческих клеток, что существенно при изучении взаи- модействия гемопоэтических и стромальных клеток in vitro, а также должно обязательно учитываться при разработке протоколов амплификации клеток ПК [76, 77]. Известно, что пониженное содержание кислоро- да оказывает значительное влияние на гемопоэти- ческие клетки in vitro, их способность к колониеобразованию, устойчивость к облучению и потенциал к восстановлению гемопоэза у летально облученных животных [75, 78]. Кроме того, низкое парциальное давление кислорода способствует преимущественно- му поддержанию жизнеспособности и пролиферации малодифференцированных гемопоэтических клеток по сравнению с коммитированными предшественни- ками [78, 79]. Интересно, что варьирование содержания кис- лорода в сочетании с различными комбинациями цитокинов позволяет амплифицировать клетки ПК с различными свойствами. Так, группой исследо- вателей под руководством Ivanovic было показано, что при 3% кислорода в присутствии SCF, G-CSF, TPO и IL-3 обеспечивается одновременно поддержа- ние примитивных гемопоэтических клеток, способ- ных восстанавливать кроветворение у облученных животных при трансплантации, и экспансию комми- тированных предшественников (КОЕ) [80]. Показано также, что культивирование обогащенной CD133+ клетками фракции ПК с добавлением рекомбинант- ных цитокинов SCF, Flt-3, TPO, IL-6, IL-3 в присут- ствии 5% кислорода позволяет увеличить количе- ство CD34+CD38- клеток почти в 27 раз (независимо от присутствия сыворотки в среде), что значительно (P < 0.01) выше, чем при стандартном содержании кислорода [81]. Среди клеток, амплифицирован- ных в условиях пониженного содержания кислоро- да, было больше КОЕ с миелоидным потенциалом, а также выше способность к восстановлению гемо- поэза при трансплантации облученным животным. Показано, что пониженное содержание кислорода индуцирует в гемопоэтических клетках экспрессию генов HIF-1α, VEGF и ABCG2, а также активирует экспрессию CXC рецептора хемокинов 4 (CXCR4) [82]. В работе Tursky и соавт. культивирование кле- ток ПК при 10% кислорода с добавлением цитокинов (TPO, SCF, Flt-3 лиганда и IL-6) приводило к боль- шей экспансии ГСПК, чем при использовании наибо- лее распространенного протокола культивирования клеток ПК (20% кислорода, TPO, SCF и G-CSF) [42]. C зависимостью от содержания кислорода связа- на одна важная особенность гемопоэтических кле- ток - занимать определенные «ниши» при совмест- ном культивировании со стромальными клетками. Еще в 1977 году в работах Dexter и соавт. было опи- сано распределение гемопоэтических клеток в таких сокультурах: часть гемопоэтических предшествен- ников находится в суспензии над подслоем, часть ад- гезирует к поверхности подслоя, а некоторые клетки мигрируют в субстромальное пространство (рис. 2А) [49]. При длительном сокультивировании образуются участки активной пролиферации гемопоэтических клеток (так называемых областей «булыжной мосто- вой»), которые обнаруживаются с помощью фазо- во-контрастной микроскопии и визуально представ- ляют плотные скопления клеток, располагающиеся под слоем МСК (рис. 2Б) [82]. Пространственная организация гемопоэтических клеток в совместной культуре сопоставима с их рас- пределением в костном мозге: клетки в зависимости от состояния покоя/активной пролиферации рас- полагаются в областях с различным содержанием кислорода и доступностью питательных веществ. Так, фракция клеток, адгезирующих на поверх- ность МСК, содержала наибольшую долю активно пролиферирующих клеток. По сравнению с други- ми фракциями гемопоэтических предшественников в сокультуре клетки, мигрировавшие под стромаль- ный монослой, делятся редко и сохраняют незрелый фенотип CD34+CD38- [83]. Учитывая особенность ге- мопоэтических клеток занимать определенное положение в сокультуре в зависимости от пролифера- тивного потенциала, можно фракционировать клетки по их способности к адгезии и выделять популяции клеток с определенными свойствами (рис. 3) [73]. Согласно Jing и соавт., при культивировании в ус- ловиях атмосферного содержания кислорода наибо- лее «гипоксические» гемопоэтические клетки рас- полагались под монослоем стромальных клеток [83]. При пониженном содержании кислорода уменьша- лась адгезия гемопоэтических клеток к стромаль- ным клеткам, однако такие условия способствовали миграции клеток под монослой. В условиях гипоксии усиливалась продукция фактора роста эндотелия сосудов А, который, по-видимому, опосредовал уве- личение проницаемости монослоя МСК. Стоит от- метить, что пониженное содержание кислорода вли- яет как на гемопоэтические и стромальные клетки, так и на их взаимодействие [83]. Воссоздавая микроокружение костного мозга ex vivo, используют кислород, содержание которого соответствует тканевому, а в качестве клеточного компонента микроокружения - различные фидер- ные слои, в частности МСК [76, 77]. Однако стоит учитывать, что пониженное содержание кислорода в среде культивирования влияет не только на ге- мопоэтические клетки, но и на МСК. Определение дифференцировочного потенциала этих клеток in vitro в условиях гипоксии выявило снижение осте- огенного и адипогенного потенциала [84, 85]. Кроме того, пониженное содержание кислорода при куль- тивировании усиливает дифференцировку в хон- дрогенном направлении, а также увеличивает пролиферативную активность и число колониеобразующих единиц фибробластов [84, 86, 87]. Эти данные подчеркивают роль кислорода как важного фактора, определяющего судьбу клеток, относя- щихся к стромальному и гемопоэтическому гисто- генетическому ряду. Используя МСК в качестве фидерного подслоя для культивирования гемопо- этических клеток, важно учитывать влияние со- держания кислорода на продукцию биологически активных медиаторов МСК. Установлено, что в при- сутствии 4-5% кислорода возрастает продукция МСК таких медиаторов, как IL-1β, IL-10, фактор роста гепатоцитов, фактор роста эндотелия сосу- дов, основной фактор роста фибробластов, TGF-β, GM-CSF, однако снижается образование фактора некроза опухолей α [64, 88]. Koller и соавт. для экспансии гемопоэтических клеток пуповинной крови in vitro использовали ме- тодический подход, учитывающий влияние совокуп- ности факторов кроветворного микроокружения [89]. Клетки ПК культивировали с добавлением или от- сутствием рекомбинантных цитокинов и подслоя МСК, при 5 или 20% кислорода. Установлено, что ис- пользование IL-3/IL-6 обеспечивает более эффек- тивную экспансию гемопоэтических предшествен- ников, поддерживаемую в культуре более 8 недель, чем IL-1/IL-3. Этот эффект усиливался при культи- вировании в условиях пониженного содержания кис- лорода. Присутствие слоя облученных стромальных клеток не оказывало значительного эффекта на экс- пансию гемопоэтических клеток при добавлении ци- токинов, особенно при низком содержании кислорода. В зависимости от содержания кислорода в сре- де культивирования эффект, оказываемый на ге- мопоэтические клетки, может быть различным. Совместное культивирование мононуклеаров пупо- винной крови и МСК из костного мозга в условиях 2% O2 способствует значительно более низкой про- дукции CD34+ клеток (25-кратное увеличение против 60-, 64- и 92-кратного на 10 день при 5, 21, 10% O2 со- ответственно). Определение динамики роста выяви- ло более высокий пролиферативный статус клеток ПК, культивируемых при 5, 10, 21% кислорода, чем при 2% О2 [90]. Таким образом, для создания эффективных и контролируемых методических подходов, обе- спечивающих получение большого количества ге- мопоэтических стволовых и прогениторных клеток для трансплантации, необходимо учитывать особен- ности микроокружения кроветворной ниши, в том числе содержание кислорода. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ЭКСПАНСИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ И ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ex vivo Наиболее распространенные подходы к экспансии клеток ПК основаны на данных, полученных в ходе изучения влияния клеточных и неклеточных факто- ров кроветворного микроокружения на ГСПК, вклю- чая тканевое содержание кислорода, взаимодействие со стромальными клетками и паракринные медиато- ры. Однако, благодаря развитию молекулярно-генети- ческих методов, представления о механизмах, опосре- дующих работу гемопоэтической ниши, значительно расширились, что позволило создать новые техноло- гические подходы к амплификации ГСПК ПК. Экспансия, опосредованная Notch Известно, что семейство рецепторов и лигандов Notch участвует в многочисленных процессах [91- 93]. Рецептор Notch 1 обнаружен на CD34+ гемопоэ- тических предшественниках [94]. Кроме того, акти- вация сигнализации Notch способствует сохранению фенотипа самых примитивных гемопоэтических стволовых клеток in vitro. Это привело к созданию бессывороточной системы культивирования CD34+ гемопоэтических клеток, состоящей из иммобилизо- ванного Delta1 Notch-лиганда и ранних цитокинов гемопоэтических стволовых клеток (SCF, TPO, Flt-3 лиганд, IL-3 и IL-6) [95]. Неоднозначные результа- ты получены при трансплантации двух единиц ПК, одна из которых была обогащена ГСПК с применени- ем Notch-системы, проведенной в ходе клинических испытаний. Использование Notch-трансплантата по- зволяло сократить время восстановления нейтрофи- лов, однако по истечении 3 месяцев кроветворение у реципиентов обеспечивалось другим трансплан- татом ПК. Наблюдаемый эффект можно объяснить двумя обстоятельствами: потерей за время культи- вирования клеток, обеспечивающих долгосрочное восстановление гемопоэза (long-term repopulating cells); иммунным ответом Т-клеток неманипулиро- ванного трансплантата ПК [34, 35]. Экспансия в присутствии StemEx (хелатора меди) У пациентов с дефицитом меди значительно снижен гранулоцитопоэз и эритропоэз, при этом в биопта- тах костного мозга у них выявлено снижение числа зрелых гранулоцитов и увеличение числа промиело- цитов и миелоцитов по сравнению с людьми без это- го дефицита [96, 97]. Данное наблюдение позволило предположить, что дефицит меди влияет на диффе- ренцировку миелоидных предшественников. Позднее был разработан компонент культуральной системы StemEx, действие которого основано на влиянии низких концентраций меди на дифференцировку ге- мопоэтических стволовых клеток в системе in vitro. В StemEx медный хелатор тетраэтиленпентамин со- четается с ранними и поздними гемопоэтическими цитокинами [98, 99]. Применение технологии StemEx предполагает проведение экспансии в присутствии StemEx части клеток из одной единицы ПК в течение 21 дня. Другую часть ПК вводят в исходном виде со- вместно с клетками, амплифицированными в присут- ствии StemEx [100]. Использование такого подхода приводит к улучшению ряда важных клинических показателей по сравнению с применением ПК в ис- ходном виде, что свидетельствует об эффективности данной системы культивирования для амплифика- ции ГСПК ПК eх vivo [101]. Экспансия NiCord Технология NiCord основана на действии эпигенети- ческого фактора - никотинамида, который позволяет замедлить дифференцировку и увеличить функци- ональность гемопоэтических стволовых и прогени- торных клеток, полученных в ходе ex vivo экспансии. Добавление никотинамида вместе с гемопоэтически- ми цитокинами в культуру способствует увеличению доли CD34+CD38- примитивных клеток и усилива- ет миграцию в направлении к SDF-1 in vitro. Кроме того, показана высокая эффективность приживле- ния амплифицированных клеток в моделях in vivo [102]. NiCord не только позволяет увеличить коли- чество ГСПК в сравнении с представленными выше технологиями, но и обеспечивает эффективное при- живление клеток. Уникальной особенностью NiCord- трансплантата является то, что вместе с фракцией ГСПК, полученной после 21-дневной экспансии, он содержит фракцию некультивированных Т-клеток, которую собирают и повторно замораживают после разморозки. Таким образом, NiCord-трансплантат сохраняет иммунологический потенциал, что улуч- шает приживление трансплантата и иммунологиче- ское восстановление. Результаты клинического при- менения ГСПК, амплифицированных в соответствии с протоколом NiCord и трансплантированных вместе с дополнительной единицей ПК, свидетельствуют о более раннем восстановлении нейтрофилов (меди- ана 11 дней против 25 дней, Р = 0.001) и тромбоцитов (30 дней против 41, Р = 0.012) по сравнению с кон- тролем [103]. Это исследование подтверждает при- сутствие долгосрочных (long-term repopulating cells) и краткосрочных репопулирующих клеток в транс- плантате пуповинной крови после NiCord-экспансии. Экспансия в присутствии Stem-Regenin 1 Stem-Regenin 1 - пуриновое производное, способ- ствующее экспансии ex vivo ГСПК [104]. В техноло- гии Stem-Regenin 1 для инициирования клеточной культуры используется фракционированная популя- ция CD34+ клеток ПК. Показано, что во время 3-не- дельного культивирования в среде без сыворотки, содержащей Stem-Regenin 1 и дополнительно TPO, SCF, лиганд Flt-3 и IL-6, происходит 1118-кратная экспансия CD34+ клеток относительно исходной по- пуляции. Удаление из системы культивирования Stem-Regenin 1 приводит к быстрой дифференци- ровке, что указывает на важную роль этого компо- нента в поддержании малодифференцированного состояния гемопоэтических предшественников ПК. Клетки, полученные с применением Stem-Regenin 1, способны к высокоэффективному приживлению после трансплантации мышам с иммунодефицитом, что свидетельствует о присутствии среди них гемо- поэтических предшественников, обеспечивающих раннее и устойчивое восстановление гемопоэза. Эта технология хорошо проявила себя в клинических ис- пытаниях и в настоящее время продолжает активно изучаться [105]. СТРАТЕГИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА ПОВЫШЕНИЕ ХОМИНГА ГСПК Разработаны также методические подходы, направ- ленные на увеличение хоминга и приживление по- тенциальных стволовых клеток ПК без экспансии. Они представляют недорогую и безопасную альтер- нативу экспансии ГСПК ex vivo. Сокультивирование с простагландином Е2 Изучение гемопоэза рыб Danio rerio выявило участие dmPGE2 (16,16-диметилпростагландин Е2) в гоме- остазе гемопоэтических стволовых клеток [22]. Это позволило предположить, что короткая экспозиция ex vivo клеток ПК с dmPGE2 позволит увеличить «эффективную дозу» гемопоэтических стволовых клеток без значительной токсичности для пациен- та. Показано, что краткосрочная инкубация ГСПК с dmPGE2 способствует увеличению их количества после трансплантации и обеспечивает преимущество этих клеток при серийной трансплантации с полным мультилинейным восстановлением костного мозга у мышей [106]. Обнадеживающие результаты по- лучены при клиническом использовании dmPGE2, и методика применения dmPGE2 в настоящий мо- мент продолжает активно разрабатываться [24]. Фукозилирование Данный подход направлен на увеличение хомин- га стволовых клеток ПК к строме костного мозга. Методика основана на том, что гемопоэтические стволовые клетки ПК не мигрируют в костный мозг столь же активно, как клетки взрослого костного моз- га или мобилизованные клетки периферической кро- ви. Снижение эффективности хоминга в костном моз- ге может частично возникать из-за отсутствия связи с молекулами адгезии (Р- и Е-селектинами), которые экспрессируются на эндотелиальных клетках в со- судах костного мозга [19]. Фукозилирование лигандов селектина, экспрессирующихся на стволовых клет- ках ПК, увеличивает сродство к Р- и Е-селектинам гемопоэтического микроциркуляторного русла и критично для обеспечения «роллинга» ГСПК [107]. Достаточно простая процедура фукозилирования представляет собой инкубацию клеток ПК с фуко- зилтрансферазой IV и ее субстратом GDP-фукозой в течение 30 мин при комнатной температуре. На мо- делях in vivo показано повышение эффективности приживления стволовых клеток ПК с использовани- ем предтрансплантационного ex vivo фукозилирова- ния у мышей с иммунодефицитом [25, 108]. Взаимодействие CXCR4-SDF-1 SDF-1 и его рецептор CXCR4 также обеспечивают хоминг ГСПК и удерживание их в костном мозге. CXCR4 экспрессируется на ряде клеток, включая МСК, эндотелиальные клетки и различные суб- популяции гемопоэтических клеток, в том числе ГСПК. SDF-1 является мощным хемоаттрактан- том для CD34+ ГСПК, которые после транспланта- ции мигрируют в костный мозг по градиенту SDF-1 [109-113]. Оптимальная экспрессия CXCR4 в ГСПК и эффективный уровень SDF-1 в костном мозге реци- пиента обеспечивают приживление трансплантата. Негативным регулятором данного взаимодействия является дипептидилпептидаза-4 (DPP4), способная удалить N-концевой дипептид из SDF-1, снижая, тем самым, его активность и способность к взаимо- действию с рецептором. Ингибирование этого фер- мента привело к 2-3-кратному увеличению хоминга CD34+ и Lin--клеток человека при трансплантации мышам NOD/SCID/B2mnull [114]. Кроме того, извест- но, что дипептидилпептидаза-4 регулирует работу гемопоэтических факторов роста. Таким образом, ингибирование этого фермента благоприятно сказы- вается не только на хоминге, но и на росте клеток, опосредованном действием ростовых факторов [115]. Использование препаратов, ингибирующих дипеп- тидилпептидазу-4, дало обнадеживающие резуль- таты по приживлению ПК трансплантатов [116]. Дальнейшие исследования направлены на определе- ние оптимальной дозировки и сроков использования этих препаратов. Компонент C3a-комплемента Компонент системы комплемента 3а (C3a) - продукт протеолитического расщепления белка комплемента С3. Наряду с многочисленными иммунорегулятор- ными свойствами, C3a сенсибилизирует гемопоэти- ческие стволовые и прогениторные клетки человека к хомингу в направлении к SDF-1 через связывание C3a с рецептором CXCR4. C3a наряду с DPP4, а так- же c гиалуроновой кислотой, фибронектином и фи- бриногеном регулирует экспрессию SDF-1 на ГСПК [117, 118]. Доклинические исследования показали, что инкубация гемопоэтических стволовых кле- ток с C3a до трансплантации летально облученным мышам ускоряет динамику приживления [20, 21]. Однако результаты клинического применения были не такими успешными, так как C3a не давал преиму- щества в приживлении трансплантата [23]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Несмотря на многочисленные исследования, на- правленные на оптимизацию методических под- ходов к обогащению стволовыми клетками кро- ветворных трансплантатов, единой оптимальной технологии получения амплифицированных стволо- вых клеток до сих пор не существует. Основные за- дачи, стоящие перед исследователями на сегодняш- ний день, - сформировать представление о составе и биологических свойствах гемопоэтических клеток кроветворного трансплантата, обеспечивающих вос- становление гемопоэза реципиента, и разработать методические подходы, обеспечивающие амплифи- кацию этих клеток. Сравнительный анализ материалов, накопленных в этой области, обнаруживает две тенденции: исполь- зование в системах для амплификации клеток пупо- винной крови стромальных фидерных слоев или при- менение различных комбинаций гемопоэтических цитокинов. Между тем, в суспензионных культурах, в которых поддержание гемопоэтических предше- ственников происходит только за счет гемопоэтинов, не учитывается роль локального микроокружения (взаимодействие с клетками стромы и регуляция кислородом), тогда как показано, что эти факто- ры могут играть ключевую роль в развитии клеток крови. Экспансия ГСПК ПК более эффективна в со- культуре, чем в суспензионной культуре. Кроме того, сокультивирование улучшает приживление амплифицированных клеток после трансплантации. Добавление к системе сокультивирования экзоген- ных цитокинов дополнительно поддерживает экспан- сию ГСПК. Таким образом, представляется целесообразным использовать для амплификации системы ex vivo, включающие как стромальный подслой и фи- зиологический уровень кислорода, так и необходи- мый коктейль из цитокинов и факторов роста. В настоящий момент достаточно успешно пока- зали себя молекулярно-генетические подходы, на- правленные как на амплификацию гемопоэтических клеток, так и на улучшение хоминга транспланти- руемых клеток в костном мозге реципиента (рис. 4). Таким образом, системы ex vivo для амплификации ГСПК уже разработаны и успешно применяют- ся, однако продолжается поиск новых эффектив- ных методических подходов к экспансии клеток ПК с привлечением современных клеточных и молеку- лярно-биологических технологий.

Об авторах

E. В. Сотнезова

Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем РАН

Email: buravkova@imbp.ru
Россия

E. Р. Андреева

Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем РАН

Email: buravkova@imbp.ru
Россия

A. И. Григорьев

Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем РАН

Email: buravkova@imbp.ru
Россия

Л. Б. Буравкова

Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: buravkova@imbp.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы