Поиск поврежденных участков ДНК метил-СpG-связывающим ферментом MBD4

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Процессы метилирования и деметилирования ДНК лежат в основе эпигенетической регуляции экспрес сии генов, которая играет большую роль в клеточной дифференцировке, геномном импринтинге, канце рогенезе, а также во многих возрастных изменениях организмов. Известно, что в процессе деметилиро вания ДНК участвуют различные ферментативные системы: ДНК-метилтрансферазы, диоксигеназы и ДНК-гликозилазы [1, 2]. ДНК-гликозилазы ини циируют процесс деметилирования путем удаления метилированного основания ДНК, поэтому для вос становления исходного нуклеотида необходимы и другие ферменты, такие, как АР-эндонуклеазы (APE1), ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы [3-5]. ДНК-гликозилаза MBD4 [КФ 3.2.2.-] содержит два домена - метилцитозинсвязывающий и ДНК гликозилазный. Каталитический N-гликозилазный домен MBD4cat состоит из 138 аминокислотных остатков (остатки 437-574), образующих девять α-спиралей, которые формируют глобулярную структуру и карман активного центра [6]. Структура MBD4cat позволяет отнести его к семейству «спираль шпилька-спираль» (HhH), названному так из-за мо тива α7-петля-α8, характерному для различных бел ков этого семейства. Основным субстратом MBD4 является ДНК, содер жащая некомплементарные пары G•T либо G•U [2]. MBD4 также активен в отношении 5-гидроксимети лурацила (5-hmU) [7]. Считается, что 5-hmU образу ется в качестве интермедиата в многостадийном пути активного деметилирования, в котором 5-meC ги дроксилируется TET-диоксигеназами с образовани ем 5-гидроксиметилцитозина (5-hmC). Затем 5-hmC дезаминируется дезаминазой AID с образованием 5-hmU и удаляется при участии MBD4 в процессе эксцизионной репарации [8]. MBD4 активен и в от ношении некоторых галогенированных субстратов: 5-ClU и 5-BrU, образующихся при воспалительных процессах, и 5-FU, который может возникать при хи миотерапии [9]. Более того, фермент активен по отно шению к 3,N4-этеноцитозину (εC), который образует ся при перекисном окислении липидов и метаболизме винилхлорида [10]. В настоящее время определены структуры MBD4cat в свободном состоянии и в комплексах с ДНК-дуплексами, содержащими пары 5-hmU/G, T/G и AP/G [11, 12]. Как показано на рис. 1А, в ком плексе с продуктом реакции фермент взаимодей ствует преимущественно с пятью нуклеотидами поврежденной цепи ДНК. Образование фермент субстратного комплекса не приводит к значитель ным конформационным перестройкам по сравне нию со свободным белком (рис. 1Б). В то же время ДНК-дуплексы в комплексе с MBD4cat изогнуты в об ласти модифицированного нуклеотида, нуклеотид вывернут из двойной спирали, а азотистое основа ние находится в активном центре. MBD4cat образует прямые контакты с пятью фосфатными группами, расположенными с 5′- и 3′-стороны от вывернуто го нуклеотида [12]. Два аминокислотных остатка, Arg468 и Leu508, встраиваются в ДНК через малую бороздку и заполняют пространство в дуплексе, ко торое образуется после выворачивания модифици рованного нуклеотида. Предполагается, что гидролиз N-гликозидной связи протекает по механизму ну клеофильного замещения [7]. Нуклеофильная атака на С1'-атом осуществляется либо координированной в активном центре фермента молекулой воды, либо карбоксильной группой Asp560 [7, 12]. Ранее в работе [13] была изучена предстацио нарная кинетика накопления продукта реакции N-гликозилирования G/T-содержащего ДНК субстрата в ходе катализируемого MBD4 процесса в условиях одного оборота фермента в течение 15 с - 10 ч. Показано, что кинетика процесса характеризу ется двумя фазами: начальной быстрой и следующей за ней медленной фазой, возникающей из-за прочно го связывания фермента с продуктом реакции - АР сайтом. Цель настоящей работы состояла в изучении ме ханизмов узнавания ферментом специфического сайта в субстрате и формирования каталитически компетентного состояния. Для этого исследовали конформационную динамику MBD4cat и модельных ДНК-субстратов на коротких временах в интервале 2 мс-200 с в условиях, соответствующих или близких «одному обороту фермента». Изменения конформа ции белка регистрировали по изменению флуорес ценции остатков триптофана (Trp), а конформации ДНК - по изменению флуоресценции остатка 2-ами нопурина (aPu) или по эффективности резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) пары кра сителей FAM/BHQ1. В качестве субстратов исполь зовали дуплексы, содержащие пару U : G, а в ка честве аналога продукта - дуплексы, содержащие неразрезаемый аналог AP-сайта - остаток (2R,3S)- 2-(оксиметил)-3-окситетрагидрофурана (F-сайт). Влияние длины дуплекса на связывание фермента с ДНК и поиск повреждения изучали с использовани ем субстратов разной длины: 12, 17 и 28 п.н. На осно вании полученных данных определили кинетический механизм взаимных конформационных перестро ек в процессе взаимодействия ДНК-гликозилазы MBD4cat с ДНК, содержащей модифицированные ну клеотиды. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В работе использовали реактивы производ ства Sigma-Aldrich (США): акриламид, N,N’ метиленбисакриламид, дитиотреит, мочевину, EDТА, ацетонитрил, глицерин, трис-(гидроксиметил) аминометан, а также отечественные реактивы квали фикации «ос. ч.». Все растворы готовили на дважды дистиллированной воде. ДНК-субстраты Дезоксирибоолигонуклеотиды синтезированы в ла боратории бионанотехнологий ИХБФМ СО РАН на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе ASM-800 («Биоссет», Новосибирск, Россия) с использованием коммерческих амидофосфитов нуклеозидов и CPG носителей (GlenResearch, США). Нативные и моди фицированные дезоксирибоолигонуклеотиды вы деляли с помощью ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1200 (США), используя колонку Zorbax SB-C18 (5 мкм) 4.6 × 150 мм, в линейном градиенте ацетони трила (0 → 50%) в присутствии 20 мМ ацетата триэтиламмония, рН 7, в течение 30 мин при скорости элюции 2 мл/мин. Фракции, содержащие дезокси рибоолигонуклеотиды, высушивали под вакуумом, растворяли в воде и осаждали 2% LiClO4 в ацетоне. После промывки чистым ацетоном и высушива ния осадки дезоксирибоолигонуклеотидов раство ряли в воде и хранили при -20°С до использования. Гомогенность очищенных дезоксирибоолигонуклео тидов подтверждали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях (20% полиакриламид ный гель, 8 М мочевина, 0.1 М трис-боратный буфер, рН 8.3). Дезоксирибоолигонуклеотиды визуализиро вали с помощью красителя Stains-All (Sigma, США). Субстраты и лиганды фермента представляли собой 12-, 17- и 28-звенные дезоксирибоолигонуклеотид ные дуплексы, представленные в табл. 1. Фермент MBD4cat Каталитический домен ДНК-гликозилазы человека MBD4cat (аминокислотные остатки 426-580) был выделен из клеток Escherichia coli Rosetta 2, трансфор мированных плазмидой pET29b-MBD4cat как опи сано ранее [11, 14]. Плазмида pET29b-MBD4cat, содержащая ген MBD4cat, была любезно предостав лена М.К. Сапарбаевым (Groupe Réparation de l’ADN, Université Paris-Sud XI, Institut Gustave Roussy, Франция). Культуру клеток E. coli Rosetta 2 вы ращивали в среде LB (1 л), содержащей 50 мкг/мл канамицина, при температуре 37°С до оптической плотности 0.6-0.7 на длине волны 600 нм. После этого температуру понижали до 20°С и индуци ровали транскрипцию, добавляя изопропил-β- D-тиогалактопиранозид до 0.2 мМ. После индукции клетки инкубировали в течение 16 ч, затем осажда ли центрифугированием (10 мин при 12000 об/мин) и готовили суспензию клеток в 30 мл буферного раствора I (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8), содержа щего 50 мМ KCl. Клетки лизировали под давлением при помощи Френч-пресса SIM AMINCO. Все после дующие процедуры проводили при 4°С. Клеточный лизат центрифугировали (40 мин при 30000 об/мин), супернатант наносили на колонку I (Q-Sepharose Fast Flow, Amersham Biosciences, Швеция) и промы вали буферным раствором I (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8), содержащим 50 мМ KCl. Фракции, содер жащие белок, собирали и наносили на колонку II (HiTrap-Helating™, Amersham Biosciences, Швеция) в буферном растворе II (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8), содержащем 500 мМ NaCl и 20 мМ имида зол. Хроматографию проводили в буферном раство ре II и линейном градиенте 20 → 500 мМ имидазола. Оптическую плотность раствора регистрировали на длине волны 280 нм. Чистоту белка определяли с помощью гель-электрофореза. Фракции, содержа щие белок MBD4cat, диализовали в буфере (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.5, 1 мМ EDТА, 1 мМ дитиотре ит, 250 мМ NaCl, 50% глицерин) и хранили при -20°С. Концентрацию фермента рассчитывали из значе ния оптической плотности раствора белка на длине волны 280 нм и коэффициента молярной экстинкции 54493 М-1см-1 [15]. Все эксперименты по исследованию ферментатив ной реакции проводили в буферном растворе: 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 50 мМ KCl, 1 мМ EDТА, 1 мМ дити отреит, 9% глицерин при 25°C. Электрофорез в ПААГ Продукты реакции разделяли с помощью электро фореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с исполь зованием меченных 32P по 5′-концу олигонуклео тидов, содержащих модифицированное основание. Мечение олигонуклеотидов по 5’-концу проводили согласно [16]. Зависимости степени превращения субстрата от времени определяли следующим образом. К 10 мкл буферного раствора, содержащего 32P-меченый олигонуклеотид и эквимолярное коли чество комплементарного олигонуклеотида, добавля ли 10 мкл 2.0-4.0 мкМ фермента в том же буферном растворе. Реакционную смесь быстро перемешивали и через определенные промежутки времени отби рали аликвоты объемом 2 мкл, которые переносили в предварительно подготовленные пробирки, содер жащие 2 мкл раствора 7 М мочевины, 0.1% бромфе нолового синего и 0.1% ксиленцианола. Затем до бавляли 1 мкл 1 М NaOH и инкубировали при 56оC в течение 15 мин для гидролиза фосфодиэфирных связей в АР-сайтах. Раствор нейтрализовали экви валентным количеством соляной кислоты, наносили на ПААГ и проводили электрофорез при напряжен ности 50 В/см. Количество образующегося продук та определяли путем сканирования радиоавтогра фа на приборе Molecular Imager FX phosphorimager (Bio-Rad, США) и обработки данных в программном пакете Gel-Pro Analyzer 4.0 (Media Cybernetics, США). Степень накопления продуктов рассчитывали как отношение площадей пиков продуктов к сумме площадей пиков продуктов и пика исходного оли гонуклеотида. Ошибка определения, как правило, не превышала 20%. Изучение кинетики процесса методом остановленной струи Кинетические кривые флуоресценции регистриро вали методом остановленной струи на спектрометре SX.18MV (Applied Photophysics, Великобритания). Белок MBD4cat содержит восемь остатков Trp и семь остатков Tyr. Возбуждение флуоресценции MBD4cat проводили на длине волны 290 нм, регистрацию флу оресценции - на длинах волн более 320 нм (фильтр WG-320, Schott, Германия). В этих условиях основ ной вклад в флуоресценцию белка обеспечивают остатки Trp (> 90%). При использовании субстратов, содержащих остатки aPu, флуоресценцию возбуж дали на длине волны 310 нм, а регистрацию прово дили на длинах волн более 370 нм (фильтр LG-370, Corion, США). Для анализа эффективности перено са энергии FRET пары FAM/BHQ1 флуоресценцию красителя FAM возбуждали на длине волны 494 нм. Флуоресценцию красителя FAM регистрировали на длинах волн более 515 нм при использовании све тофильтра OG-515 (Schott, Германия). «Мертвое» время прибора составляло 1.4 мс. Каждую кинетиче скую кривую получали, усредняя, как минимум, три экспериментальные кривые. Анализ кинетических данных Для получения минимальной кинетической схемы, описывающей взаимодействие фермента с субстратами, и расчета констант скорости конформационных переходов в ходе всех элементарных стадий полу чали набор кинетических кривых для разных кон центраций фермента или субстрата. Количественную обработку результатов проводили с помощью про граммы DynaFit (BioKin, США) [17] путем оптимиза ции значений параметров, входящих в кинетические схемы, как описано ранее [18-20]. РЕЗУЛЬТАТЫ Взаимодействие MBD4cat с 28-звенным ДНК дуплексом На рис. 2А представлены кинетические кривые из менения интенсивности флуоресценции остатков Trp в процессе взаимодействия MBD4cat с 28-звенным субстратом U28. Поскольку MBD4cat образует контак ты лишь с пятью нуклеотидами ДНК, использова ние в качестве субстрата 28-звенного ДНК-дуплекса приводит к значительному вкладу в суммарную скорость процесса стадии поиска остатка урацила в ДНК. Действительно, из полученных кинетических кривых (рис. 2А) видно, что интенсивность флуорес ценции Trp уменьшается в широком временном диа пазоне - 2 мс-10 с. Затем следует фаза роста интен сивности флуоресценции Trp (10-100 с). Анализ накопления продуктов реакции с по мощью электрофоретического разделения реак ционной смеси в ПААГ (рис. 2Б) показал, что про цесс характеризуется двумя фазами: быстрой (до ~200 c) и медленной (до 1600 с и выше). На начальном участке кинетических кривых (до 200 с) наблюда ется «скачок», за которым следует медленный рост. Такой вид кривых свидетельствует о существовании скоростьлимитирующей стадии после каталитиче ской реакции. Увеличение концентрации U28 с 0.25 до 1.0 мкМ приводит к увеличению количества рас щепляемого субстрата на стадии «скачка» до 0.7 мкМ. Однако при дальнейшем увеличении концентрации U28-субстрата до 2.0 мкМ это значение незначитель но увеличивается до 0.9 мкМ, что свидетельству ет о насыщении активной формы фермента ДНК субстратом. Таким образом, данные о накоплении продуктов реакции показывают, что концентрация активной формы фермента равна примерно 1.0 мкМ. Достаточно низкое значение активной формы ката литического домена MBD4cat (~ 25%), по-видимому, связано с особенностями сборки полипептида в функ циональный белок в клетках E. сoli, что согласуется с данными [13]. Таким образом, можно предположить, что паде ние интенсивности флуоресценции Trp в области 2 мс-~10 с характеризует образование первичного комплекса и поиск модифицированного основания, а рост в интервале ~10-100 c - каталитически-ком петентной конформации фермента и начало про цесса накопления продукта. Необходимо отметить, что повышение интенсивности флуоресценции Trp в интервале 10-100 с (рис. 2А) совпадает по времени с началом накопления продуктов реакции (рис. 2Б). Скоростьлимитирующей стадией ферментативного процесса скорее всего является стадия диссоциации комплекса фермент-продукт, что согласуется с вы водами, сделанными ранее [10]. Количественный анализ кинетических кри вых взаимодействия MBD4cat c 28-звенным ДНК-субстратом (рис. 2А) позволил предложить мини мальную кинетическую схему, удовлетворительно описывающую экспериментальные данные. Две равновесные стадии характеризуют первичное свя зывание ДНК и последующий процесс перестройки конформации фермента, приводящий к образованию каталитически компетентного комплекса, в котором N-гликозидная связь подвергается необратимому гидролизу. Завершает ферментативный цикл рав новесная стадия диссоциации комплекса фермента и ДНК-продукта. Константы скорости и константы равновесия, характеризующие приведенные на схе ме стадии, представлены в табл. 2. Используя кон станты скорости элементарных стадий, получены значения стационарных параметров ферментативно го процесса (Km и kcat), которые хорошо согласуются с данными [11, 13]. Используя уравнение (1), на основании данных (е0 = 4.0 мкМ, s0 = 0.5 мкМ, рис. 2Б) оценили фак тическую скорость стационарной фазы реакции Vst ≈ (3.2 ± 1.2) × 10-5 мкМ/c. Ожидаемое значение максимальной скорости каталитической реакции, оцененное по формуле Vmax = kcat × е0, где е0 - исход ная концентрация фермента, с учетом 25% активно сти фермента равно 4.6 × 10-2 мкМ/c. Это означает, что лимитирующей является не химическая стадия, а, вероятно, диссоциация комплекса фермента с про дуктом реакции, что коррелирует с наличием «скач ка» на кинетических кривых накопления продукта. Vst = Δ[P]/Δt, (1) где Δ[P] - прирост концентрации продукта Р за вре мя Δt. Взаимодействие MBD4cat с 17-звенным ДНК дуплексом Кинетические кривые, полученные при взаимо действии MBD4cat с более коротким 17-звенным ДНК-субстратом, имеют две фазы изменения ин тенсивности флуоресценции Trp, как и в случае с 28-звенным дуплексом (рис. 3А). Анализ про дуктов реакции с помощью электрофоретического разделения реакционной смеси в ПААГ (рис. 3Б) показал, что в случае U17-субстрата накопле ние продуктов происходит в интервале времени < 1000 с. Кинетические кривые имеют выраженный «скачок» накопления продукта в интервале времени до 200 с с последующим медленным увеличением концентрации продукта. Последующее замедление накопления продуктов реакции свидетельствует о том, что процесс диссоциации комплекса фер мент-продукт является скоростьлимитирующим, как и для U28-субстрата. Анализ кривых кинетики флуоресценции, пред ставленных на рис. 3А, показал, что они описывают ся минимальной кинетической схемой. Константы скорости и равновесия, характеризующие эти ста дии, представлены в табл. 2. Интересно отметить, что уменьшение на 11 нуклеотидов неспецифиче ского участка дуплекса U17-субстрата по сравнению с U28-субстратом не приводит к значительным из менениям констант скорости образования и распада первичного комплекса (E•S)1. Тем не менее уменьше ние длины дуплекса привело к увеличению констан ты равновесия K2, характеризующей образование каталитического комплекса (E•S)2, в 2.4 раза по срав нению с U28-субстратом (13.0 и 5.5 соответственно). Это должно быть связано с уменьшением времени поиска поврежденного участка, который происходит как путем одномерной диффузии вследствие сколь жения и небольших «прыжков» (hopping) [21-23] фермента по цепи ДНК, так и трехмерной диффузии, включающей множественные акты ассоциации-дис социации. Как и в случае U28-субстрата, у U17-субстрата фактическая стационарная скорость накопления продукта Vst составляет ~ (6.2 ± 0.9) × 10-5 мкМ/с при е0 = 4.0 мкМ, s0 = 0.5 мкМ, и меньше значения Vmax = 4.2 × 10-2 почти в 1000 раз. Это различие, а так же «скачок» на кинетических кривых накопления продукта реакции (рис. 3Б) свидетельствуют о том, что диссоциация комплекса фермента с продуктом реакции лимитирует скорость ферментативного про цесса. Взаимодействие MBD4cat с 12-звенным ДНК дуплексом На рис. 4 представлены кривые изменения ин тенсивности флуоресценции остатков Trp, соот ветствующие процессу взаимодействия MBD4cat с 12-звенным субстратом U12. Из рис. 4А видно, что кинетические кривые имеют две фазы: паде ния интенсивности (10-500 мс) и роста с выходом на плато (0.5-10 с). Кинетика накопления продуктов ферментативной реакции, определенная с помо щью электрофоретического разделения реакцион ной смеси в ПААГ (рис. 4Б), свидетельствует о том, что каталитическая стадия проходит на временах порядка (≥ 1000 с), т.е. значительно медленнее ста дий, соответствующих изменению интенсивности Trp. Следовательно, изменения интенсивности флу оресценции остатков Trp, зарегистрированные в ин тервале времени до 200 с, скорее всего отражают начальные конформационные изменения фермен та в ходе образования фермент-субстратного ком плекса и дальнейшую перестройку конформации фермента. При этом каталитически компетентное состояние формируется неэффективно, и реакция гидролиза N-гликозидной связи значительно за медляется по сравнению с 17- и 28-звенными суб стратами. Поэтому для анализа серии кинетических кривых использовали только равновесные стадии связывания ДНК, характеризующие образование комплексов (E•S)1 и (E•S)2 на схеме. Константы ско рости, характеризующие эти стадии и полученные путем анализа кинетических кривых изменения интенсивности флуоресценции фермента (рис. 4А), представлены в табл. 2. Сравнение констант скорости взаимодействия MBD4cat с 12- и 17-звенным субстратами показы вает, что при уменьшении длины дуплекса на пять нуклеотидов значительно уменьшается скорость как образования первичного комплекса (E•S)1, ха рактеризуемого константой скорости k1, так и его распада, k-1, - в 24 и 14 раз соответственно. При этом константа ассоциации Е и S с образованием комплек са (E•S)1, K1, уменьшается лишь в 2 раза. Можно предположить, что неспецифический участок U17 субстрата выполняет функцию матрицы, с которой в условиях быстрого равновесия образуется первич ный комплекс (E•S)1, что позволяет ферменту произ водить эффективный поиск поврежденного участка. Действительно, константа образования k2 каталити ческого комплекса (E•S)2 в случае U17-субстрата в 17 раз больше, чем в случае U12-субстрата. Таким обра зом, увеличение неспецифического участка дуплекса на пять нуклеотидов в U17-субстрате по сравнению с U12-субстратом приводит к уменьшению общей кон станты диссоциации Kd в 10 раз (табл. 2). Отсутствие в U12-субстрате неспецифического участка, по видимому, препятствует образованию правильно ориентированной активной конформации фермента. Взаимодействие MBD4cat с аналогом продукта Удаление модифицированного основания фермен том MBD4 приводит к образованию АР-сайта в ДНК. Для того чтобы идентифицировать природу кон формационных изменений фермента и ДНК, проис ходящих в процессе связывания продукта реакции, содержащего AP-сайт, использовали его стабиль ный аналог, представляющий собой остаток (2R,3S)- 2-(оксиметил)-3-окситетрагидрофурана (F-сайт), не содержащий OH-группу в положении С1′ дезок сирибозы. Взаимодействие MBD4cat с F12-лигандом должно приводить к формированию комплекса, ими тирующего комплекс фермента с продуктом реакции после осуществления каталитической стадии фер ментативного процесса. Кинетические кривые изменения интенсивности флуоресценции Trp при взаимодействии MBD4cat и F12-лиганда имеют двухфазный профиль (рис. 5), как и в случае U12-субстрата (рис. 4). Можно пред положить, что уменьшение и последующий рост ин тенсивности флуоресценции Trp имеют такую же природу, как и у ДНК-дуплекса, содержащего ури дин. Таким образом, независимо от природы моди фицированного нуклеотида первичное связывание и дальнейшая перестройка конформации фермента в процессе взаимодействия MBD4cat с ДНК приводят к образованию каталитически активного комплекса (рис. 5). Полученные кинетические кривые удовлет ворительно описываются двухстадийной равновесной кинетической схемой. Константы скорости, ха рактеризующие эти стадии, представлены в табл. 2. Сравнение констант скорости и равновесия (табл. 2), характеризующих взаимодействие MBD4cat с U12-субстратом и F12-лигандом, показыва ет, что с аналогом продукта реакции первичный ком плекс образуется примерно в 10 раз более эффективно. Нужно отметить, что константы равновесия второй стадии отличаются менее чем в 2 раза. Таким образом, можно сделать заключение, что поиск и связывание поврежденного участка ДНК ферментом MBD4cat происходят более эффективно в случае де стабилизированного F-сайтом ДНК-дуплекса. Сравнительный анализ конформационных изменений фермента и ДНК Для того чтобы уточнить природу процессов, проис ходящих при образовании каталитического комплек са и зарегистрированных по изменению интенсивно сти остатков Trp фермента, использовали модельные ДНК-дуплексы, несущие флуоресцентные остатки (табл. 1) в качестве «сенсоров» конформационных изменений ДНК. Известно, что интенсивность флу оресценции aPu в ДНК зависит от микроокружения флуорофора и изменяется, например, в результате локального плавления дуплекса в непосредствен ной близости от флуорофора [24-26]. В двухцепо чечных структурах ДНК при образовании стэкинга с соседними основаниями интенсивность флуорес ценции остатков aPu резко уменьшается по сравне нию с одноцепочечной ДНК. Использование UaPu17 субстрата, несущего остаток aPu с 3′-стороны от уридина, позволило зарегистрировать конформа ционные изменения в ДНК, происходящие при вза имодействии с MBD4cat, вероятно, в результате выворачивания поврежденного нуклеотида из ДНК и встраивания в образовавшуюся полость остатков Arg468 и Leu508. Как видно из рис. 6, на кинети ческой кривой, характеризующей взаимодействие MBD4cat и UaPu17-субстрата, имеется фаза быстрого роста (1-50 мс) интенсивности флуоресценции aPu, свидетельствующая о дестабилизации центральной части дуплекса на начальных этапах фермент-суб стратного взаимодействия. Кроме того, для исследования изменений структу ры ДНК-субстрата применили метод FRET. Для этого использовали FAM-U-BHQ1-субстрат, содержащий красители FAM и BHQ1 на 5′-концах олигонуклеоти дов, формирующих дуплекс, что позволило зареги стрировать конформационные изменения дуплекса, связанные с изменением расстояния между краси телями. Видно (рис. 6), что на начальном участке ки нетической кривой (1-50 мс) происходит небольшое уменьшение FRET-сигнала, свидетельствующее об изгибании дуплекса. Сравнение с кривой изме нения интенсивности флуоресценции остатков Trp показывает, что в этот момент времени (< 100 мс) фермент не претерпевает значительных конформа ционных изменений. Поэтому можно предположить, что в процессе первичного связывания ДНК проис ходит изгибание спирали и частичное плавление центральной части дуплекса. По-видимому, именно такие индуцированные ферментом изменения струк туры дуплекса позволяют MBD4cat различать моди фицированные и немодифицированные основания в процессе скольжения по двойной спирали ДНК. Интересно, что фаза роста интенсивности флу оресценции остатков Trp (10-100 с), совпадающая с начальным накоплением продукта реакции, не при водит к изменению FRET-сигнала. Однако скорость лимитирующая стадия диссоциации комплекса фер мента с продуктом реакции вызывает медленный рост FRET-сигнала в интервале времени 100-3000 с, а также приводит к медленному накоплению продук тов реакции (рис. 6). Интенсивность флуоресценции aPu при связыва нии ДНК-дуплексов, содержащих урацил (UaPu17) и F-сайт (FaPu12), изменяется разнонаправленно (рост и падение соответственно) и в разные про межутки времени (t < 0.1 c и 0.1 c < t < 1 c соответ ственно). Фазу роста интенсивности флуоресценции aPu для UaPu17-субстрата, отражающую локальное плавление дуплекса при образовании первичного комплекса, невозможно зарегистрировать в случае FaPu12-лиганда, поскольку расположенный с 3′-сто роны от F-сайта остаток aPu уже находится в ме нее гидрофобном окружении, чем в канонической ДНК. Однако при взаимодействии MBD4cat с FaPu12 лигандом наблюдается хорошо выраженное умень шение интенсивности флуоресценции aPu на более поздних временах (до 1 с). Уменьшение интенсив ности флуоресценции aPu, связанное с увеличени ем гидрофобности окружения остатка aPu, скорее всего свидетельствует о встраивании аминокислот ных остатков MBD4cat (Arg468 и Leu508) в дуплекс на этих временах. ОБСУЖДЕНИЕ Опираясь на данные рентгеноструктурного анализа [11, 12], можно предположить, что при взаимодей ствии MBD4cat с ДНК в начальный момент времени об разуется первичный комплекс, в котором аминокис лотные остатки образуют систему неспецифических контактов с рибозофосфатным остовом, позволяющую ферменту за счет тепловых движений двигаться вдоль двойной спирали в поиске поврежденного нуклеоти да. Известно, что поиск ферментами специфических сайтов в молекуле ДНК происходит путем сочета ния одномерной (1D) и трехмерной (3D) диффузии: без диссоциации фермент-субстратного комплекса за счет «скольжения» фермента и небольших «прыж ков» по цепи ДНК, и путем множественных актов дис социации-ассоциации соответственно [21, 23]. Длина участков 1D-диффузии отличается у разных ДНК гликозилаз. Показано, что урацил-ДНК-гликозилаза UNG между актами диссоциации способна пере мещаться на длину, примерно соответствующую четырем нуклеотидам [27]. У 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы hOGG1 это расстояние может составлять от 60 [28] до 400 [29] нуклеотидов. ДНК-гликозилазы Fpg, Nei, Nth и hOGG1 [30-32] в процессе поиска по врежденного участка в молекуле ДНК используют некоторые остатки в качестве детекторов поврежден ного участка ДНК. Если в ДНК-связывающем центре фермента оказывается модифицированный нуклео тид, то это приводит к формированию специфических контактов, выворачиванию этого нуклеотида из ДНК дуплекса, встраиванию модифицированного основа ния в активный центр фермента и перемещению ами нокислотных остатков-детекторов в образовавшуюся полость в ДНК-дуплексе. Такие конформационные перестройки не позволяют ферменту смещаться со специфического сайта на ДНК и заканчиваются фор мированием каталитически компетентного комплекса. Интересно отметить, что фермент MBD4cat, относя щийся вместе с hOGG1 и Nth к структурному семей ству ДНК-гликозилаз с мотивом HhH, также встраи вает Arg468 и Leu508 в ДНК-дуплекс при образовании каталитического комплекса. Поэтому, эти аминокис лотные остатки могут выполнять функцию детекторов в процессе поиска поврежденного нуклеотида. Сравнение кривых кинетики флуоресценции для 12-, 17- и 28-звенных ДНК-субстратов свиде тельствует о том, что с увеличением длины дуплекса происходит замедление фазы уменьшения интенсив ности флуоресценции Trp, характеризующей поиск модифицированного основания в процессе сколь жения или перепрыгивания MBD4cat по цепи ДНК. С использованием флуоресцентно меченных UaPu17 и FAM-U-BHQ1-субстратов показано, что в первич ном комплексе происходят изгибание ДНК-дуплекса и его локальное плавление. В последующий момент времени поврежденный нуклеотид выворачива ется из дуплекса, и аминокислотные остатки фер мента встраиваются в образовавшуюся полость. Результаты, полученные с использованием флуорес центно меченного аналога продукта реакции FaPu12, показывают, что встраивание Arg468 и Leu508 в ДНК-дуплекс предшествует фазе роста интенсив ности флуоресценции Trp. Встраивание аминокис лотных остатков в ДНК обеспечивает специфическое узнавание модифицированного основания. Фаза ро ста интенсивности флуоресценции Trp характеризу ет образование каталитически-активного комплекса и во всех случаях заканчивается к 100-200 с, что со впадает с начальным скачком накопления продуктов реакции. Диссоциация комплекса фермента с про дуктом реакции является скоростьлимитирующей стадией всего процесса. Наблюдаемая скорость ката литической реакции заметно увеличивается с увеличением длины дуплекса. Это указывает на возможное участие соседних с модифицированным основани ем неповрежденных участков ДНК в формировании правильно ориентированной и активной конформа ции MBD4cat. Таким образом, впервые в режиме реального вре мени зарегистрированы конформационные перехо ды в ферменте MBD4 и ДНК-субстратах в ходе их взаимодействия, установлен кинетический меха низм, рассчитаны константы скорости образования и распада промежуточных фермент-субстратных комплексов и определена природа взаимных кон формационных перестроек в процессе узнавания по вреждения и его удаления.

Об авторах

Д. A. Яковлев

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: fedorova@niboch.nsc.ru
Россия

A. A. Кузнецова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: fedorova@niboch.nsc.ru
Россия

O. С. Федорова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: fedorova@niboch.nsc.ru
Россия

Н. A. Кузнецов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: nikita.kuznetsov@niboch.nsc.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы