Второй активный центр в эндолитической трансгликозилазе gp144 бактериофага phiKZ

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Бактериофаг phiKZ (vB_PaeM_KZ, GenBank NC_004629) принадлежит к семейству Myoviridae и служит «фагом-основателем» таксономического рода гигантских фагов, инфицирующих грамотри цательные бактерии Pseudomonas aeruginosa и не которые близкородственные бактерии [1]. рhiKZ подобные фаги служат объектом для различных геномных [2], эволюционных [3] и структурных [4-6] исследований. Лизис бактерии-хозяина на поздних стадиях ин фекции фагом phiKZ осуществляется пептидогли канлизирующим ферментом (эндолизином) gp144. Этот белок имеет модульное строение и состоит из двух доменов - N-концевого, отвечающего за пер вичное связывание с субстратом, и каталитического С-концевого [7]. Пептидогликансвязывающая функ ция N-концевой части полипептида (остатки 9-69) экспериментально доказана с помощью белковой хи меры с присоединенным зеленым флуоресцентным белком [8, 9]. С-Концевой домен gp144 (остатки 70- 260) имеет выраженную гомологию с литическими трансгликозилазами класса 1. Каталитический ме ханизм был подтвержден масс-спектрометрическим анализом продуктов расщепления пептидогли кана [10]. Литические трансгликозилазы - фер менты, расщепляющие β-1,4-гликозидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой (NAM) и N-ацетилглюкозамином (NAG) с образованием ци клического ангидрида N-ацетилмурамовой кислоты (связь между О6 и С1) [11]. Пространственная струк тура phiKZ gp144 апофермента (3BKV) и фермента со связанной молекулой хитотетраозы (3BKH) по лучена с помощью рентгеновской кристаллографии с разрешением 2.6 Å [12]. С-Концевой домен белка в основном состоит из α-спиралей и структурно гомо логичен каталитическому домену литических транс гликозилаз класса 1. Согласно общепринятой модели [11] за каталитическое действие в активном центре отвечает единственный аминокислотный остаток - у phiKZ gp144 это Glu115 [12]. Однако мутагенез это го остатка не приводил к полной инактивации фер мента, оставляя около 30% активности у мутантного белка [8]. Таким образом, данная работа проведена с целью выявления роли других аминокислотных остатков в катализе phiKZ gp144 и уточнения струк турной организации активного центра. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Направленный мутагенез Основные манипуляции молекулярного клонирова ния в Escherichia coli выполняли в соответствии с [13]. В качестве матрицы для точечного мутагенеза ис пользовали плазмиду pKZ144, содержащую ген 144 бактериофага phiKZ в векторе pQE30 (Qiagen) [7]. Для направленного мутагенеза использовали набор QuickChange Kit (Stratagene). В полимеразной цеп ной реакции (ПЦР) использовали праймеры: E115A Fw 5’-CATTTGCTTCTATTGCATCAGCATTCGATTAC- 3’, Е115А Re 5’-GTAATCGAATGCTAGTGCAATAGAAGCAAATG- 3’, Н200L Fw 5’-GATCTTTAGCTCTCTTCTTTGGGCCTGG- 3’, Н200L Re 5’-CCAGGCCCAAAGAAGAGAGCTAAA TAAAGATC-3’, Y197F Fw 5’-ACTGATACTGATCTTTTTTTAGCTCACTTCTTT- 3’, Y197F Re 5’-AAAGAAGTGAGCTAAAAAAAGATCAGTATCAGT- 3’. E178A Fw 5’-GCGGAACTGATTAAGCAAACATGAACATTCTG- 3’, Е178А Re 5’-CAGAATGTTCATGTTTGCTTAATCAGTTCCGC- 3’. После проведения ПЦР плазмиду с геном фер мента дикого типа разрушали при помощи DpnI эндонуклеазы, специфичной к метилированной ДНК. Полученный материал использовали для электро порации клеток E. coli NovaBlue (Novagen). Клетки высевали на чашки Петри со средой Lb agar, со держащую антибиотик ампициллин в концентра ции 100 мкг/мл и культивировали при 37°С в тече ние 16 ч. Плазмиды pKZ144-Е115А, pKZ144-Н200L, pKZ144-Y197F, pKZ144-E115A/H200L, pKZ144- E115A/Y197F, pKZ144-H200L/Y197F, pKZ144- E178A, pKZ144-E115A/E178A выделяли из индиви дуальных клонов с помощью набора QiaQuick Spin (Qiagen), присутствие заданной мутации проверяли секвенированием. Выделение и очистка белков Клетки E. coli штамма AD494(DE3) (Novagen), трансформированные соответствующими плазми дами, растили в среде 2хYT при 37°С до A600 ~ 0.6 отн. ед., после чего индуцировали экспрессию до бавлением изопропилтио-β-D-галактозида до ко нечной концентрации 0.5 мМ. Клетки инкубиро вали в течение 4 ч при 37°С и умеренной аэрации. Далее клетки E. coli из 0.15 л среды осаждали центрифугированием при 3500 об/мин в течение 15 мин, осадок ресуспендировали в 10 мл буфе ра А (20 мМ Трис-HCl pH 8.0, 100 мМ NaCl, 1 мМ о-фенилметансульфонилфторида (PMSF)). Клетки разрушали ультразвуком (Techpan MD20), нерас творимые фрагменты отделяли центрифугировани ем при 15000 об/мин в течение 20 мин. Супернатант наносили на колонку с Ni-NTA-агарозой (Qiagen). Элюцию аффинно связанного белка проводили 200 мМ имидазолом в буфере А. Очищенный пре парат белка диализовали против 20 мM буфера Трис-HCl pH 8.0, 50 мM NaCl и хранили при -70оС. Концентрацию белка определяли спектрофотоме трически, измеряя поглощение при 280 нм на спек трофотометре GENESYS 10 (Thermoelektron). Коэффициент экстинкции рассчитывали с помо щью программы VectorNTI, основываясь на кон центрации ароматических остатков в молекуле белка. Изменения вторичной структуры мутантных белков оценивали спектроскопией кругового дих роизма на спектрополяриметре JASCO J-500 в кю вете 0.05 см (Hellma) в Na-фосфатном буфере pH 6.2 при комнатной температуре. Определение активности Ферментативную активность белковых препаратов определяли с использованием в качестве субстрата суспензии клеточных стенок P. aeruginosa PAO1, по лученной обработкой клеток хлороформом для уда ления внешней клеточной мембраны. Для приготов ления суспензии клеточных стенок клетки РАО1 растили при 37оС в среде 2xTY до A500 ~ 0.6 отн. ед. Клетки осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 4000 об/мин. Клеточный осадок ресу спендировали в буфере 50 мМ Tрис-HCl pH 7.8, на сыщенном хлороформом, и инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре с перемешива нием. Остатки клеточных стенок осаждали центри фугированием в течение 15 мин при 4000 об/мин. Полученный осадок ресуспендировали в 10 мМ Na фосфатном буфере pH 6.2, 120 мМ NaCl, доводили поглощение при 500 нм до 0.6-1 отн. ед. Образец фермента объемом 30 мкл добавляли к 270 мкл суспензии клеточных стенок на плашке и измеряли уменьше ние оптической плотности на спектрофотометриче ском ридере Viktor (Perkin Elmer) при комнатной температуре в течение 1.5 ч с интервалом 1 мин. За 1 ед. пептидогликанлитической активности при нимали активность, вызывающую линейное сниже ние поглощения на 0.001 отн. ед. в 1 мин. Результаты измерений обрабатывали при помощи программы Activity Calculator [14]. Эксперименты проводили в трехкратной повторности, результаты усредняли и сравнивали с соответствующими отрицательными контролями и положительным контролем, содержа щим лизоцим куриного яйца. Моделирование и молекулярная динамика Молекулу субстрата строили и релаксировали в программе Avogadro [15]. Докинг проводили к от релаксированной, а затем замороженной нативной структуре с помощью веб-сервиса SwissDock [16] и выбирали вариант, наиболее похожий по ори ентации и положению на структуру 3BKV [12]. Распределение зарядов в нативной белковой моле куле рассчитывали с помощью программ PDB2PQR [17, 18] и APBS [19]. Конформационную подвижность белка изучали методом молекулярной динамики. Исходя из кри сталлической структуры 3BKH [12], создали ги дратированные модели на основе силового поля AMBER [20, 21]. Моделирование проводили в паке те GROMACS [22-25] со следующими параметрами: время симуляции 100 нс, шаг 2 фс, радиус обреза ния ван-дер-ваальсовых взаимодействий 1 нм, ме тод учета электростатических взаимодействий PME, температура 300 K с раздельным термостатирова нием белка и раствора, использовали периодические граничные условия с кубической ячейкой. Анализ данных проводили путем сравнения среднеквадратичного отклонения структур точеч ных мутантов от структуры фермента дикого типа. За референсную структуру принимали конформа цию трансгликозилазы, полученную путем молеку лярной динамики при 300 K. Сравнение проводили по атомам белкового остова только тех аминокислот, которые находятся вблизи субстрата (аминокислоты: 110-116, 125-150, 168-185, 195-210, 220-230) и мо гут влиять на его связывание с ферментом. В связи с тем, что при комнатной температуре подвижность молекулы слишком велика, чтобы на доступных временах вычисления сделать статистически досто верные выводы о конформационных отличиях, при меняли метод отжига структур к низким температу рам. Систему плавно замораживали в течение 1 нс от 300 К до температуры жидкого азота (77 K). РЕЗУЛЬТАТЫ Анализ рентгеноструктурных данных phiKZ gp144 3BKV [12] показал, что пространственное располо жение Glu115 в активном центре относительно моле кулы субстрата не оптимально, и вероятно наличие «неканонического» аминокислотного остатка, также участвующего в катализе. В качестве таких остатков мы предположили His200, обладающий пониженной электронной плотностью, и высококонсервативный остаток Tyr197, координирующий участок субстрата в положении -1. Пространственная структура 3BKV phiKZ gp144 показывает высокую степень сходства каталити ческого домена со структурой аналогичного домена трансгликозилазы Slt70 из E. coli [26]. Положение и ориентация каталитического остатка Glu115 в gp144 сходны с положением Glu478 в Slt70. Ранее был предложен механизм катализа трансгликозила зы Slt70, отличающийся от классического механизма наличием дополнительного остатка Tyr597, который находится в каталитическом центре фермента и уча ствует в катализе. Функция Tyr597 заключается в активации каталитического остатка Glu478 через образование водородной связи с ним, что увеличи вает отрицательный заряд на Glu478 и облегчает протонирование О-гликозидной связи [27]. В поли пептиде phiKZ gp144 имеется остаток Tyr197, рас положение и ориентация которого сходны с Tyr597 в Slt70. Высокая степень пространственной гомо логии позволяет предположить, что катализ phiKZ gp144 происходит аналогично механизму Slt70. Основная гипотеза, объясняющая частич ное сохранение активности фермента при за мене основного каталитического остатка, пред полагает существование двух каталитических участков - главного Glu115/Tyr197 и дублирующего Glu178/Tyr147. Расположение аминокислот пред полагаемого второго активного центра относительно цепи пептидогликанового субстрата сходно с рас положением аминокислот основного активного цен тра. Совмещение положения боковых цепей остатков «основного» и «дублирующего» активного центров с помощью вычисления минимального среднеква дратичного отклонения показывает практически одинаковую позицию (рис. 1). Для экспериментального подтверждения роли остатков, принимающих участие в работе активного центра phiKZ gp144, получен ряд одиночных и двой ных мутантов по этим аминокислотам. Введение то чечных мутаций не влияло существенно на раство римость или вторичную структуру (по результатам связывания с аффинной колонкой и спектроскопии кругового дихроизма). Мутантные белки очищали с помощью Ni-хелатной хроматографии [7] без существенных изменений. Полученные препараты со держали 3-6 мг мутантного белка с чистотой > 90%. Одиночные мутанты Е115А, Е178А и Y197F по каждому из остатков в отдельности имели оста точную активность 54, 63 и 51% соответственно по сравнению с исходным белком phiKZ gp144 (рис. 2, табл. 1). Все мутанты проявляли максимальную активность при том же составе буфера, что и фер мент дикого типа (pH 6.2 и I = 120 мM NaCl), далее все реакции проводили в этих условиях. Мутация His приводила к снижению активности на 20-30%, что подтверждает предположение об участии остат ков гистидина в координации субстрата. В контексте высказанной гипотезы не совсем ло гична потеря активности мутантом E115A/Y197F, в котором мутированы оба остатка основного актив ного центра, а дополнительный не изменен. Для объ яснения этого явления необходимо было рассмотреть как детали пространственного взаимодействия белка с субстратом, так и возможные изменения в конфор мации белка, вызванные мутациями. Поскольку хи тотетраоза, которую использовали как эмулятор субстрата в экспериментах по кристаллизации phiKZ gp144 [12], достаточно сильно отличается по своей конформации от естественного субстрата (NAMNAG) 3, проводили молекулярный докинг по вы числению возможных конфигураций связывания субстрата с молекулой белка. Наиболее вероятное расположение субстрата в бороздке активного цен тра показано на рис. 1. Для дополнительной оценки изменения конформа ций белка при различных заменах проведен молеку лярно-динамический анализ конфигурации бороздки путем изучения ее внешнего вида (рис. 3А) и рассто яний между Cα-атомами аминокислотных остатков 126 и 229 (рис. 3Б, табл. 2). Скорее всего, при неко торых мутациях нарушается сеть взаимодействий между боковыми цепями остатков, формирующих активный центр, вследствие чего область бороздки активного центра phiKZ gp144 довольно сильно из меняет свою конформацию. Например, при мутациях аминокислотных остатков основного активного цен тра изменяется форма бороздки, в которую укла дывается субстрат, что может вызывать снижение аффинности белка к субстрату и, как следствие, ре акционной способности. Видно, что двойная мутация по основному активному центру приводит к наиболее сильному «открытию» бороздки (рис. 4). Вычислено распределение зарядов на доступ ной растворителю поверхности каждого мутанта. Вычисление поверхностного заряда глобулы белка phiKZ gp144 показывает, что бороздка связывания субстрата имеет преимущественно положительный заряд. Замены аминокислотных остатков в активных центрах также в ряде случаев приводят к сильному изменению распределения зарядов (рис. 5). Мутант E115A/Y197F не обладает активностью, несмотря на то, что один из реакционных центров остался не измененным. Двойная мутация близкорасполо женных аминокислот привела к сильному измене нию конформации поверхности, связывающей суб страт (рис. 4), а также к смене заряда в этой области бороздки (рис. 5). Такое изменение свойств поверхности, вероятно, не позволяет этому мутанту phiKZ gp144 связывать субстрат, и фермент полностью те ряет активность. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Литические трансгликозилазы - класс пептидо гликанлизирующих ферментов, которые играют активную роль в жизненных циклах бакте рий [28] и бактериофагов [29]. Трансгликозилазы действуют на тот же участок пептидогликана, что и лизоцимы ([КФ 3.2.1.17]; пептидогликан-N ацетилмурамоилгидролазы, мурамидазы) - β-1,4 гликозидную связь между остатками NAM и NAG. Основным отличием трансгликозилаз от мурамидаз является отсутствие нуклеофильного каталитического остатка. Также различия проявляются в свя зывании олигосахарида в сайтах связывания +1 и +2. Классический механизм действия трансгликозилаз предполагает наличие одного кислотного каталити ческого остатка, расположенного в активном цен тре фермента между субсайтами +1 и -1. На первой стадии реакции каталитический аминокислотный остаток протонирует гликозидный кислород с образованием оксокарбониевого катиона и дальнейшим разрывом О-гликозидной связи между NAM и NAG. На второй стадии реакции происходит внутримоле кулярная нуклеофильная атака С6-гидроксилом С1 углерода оксокарбониевого катиона с образованием 1,6-оксазалонового цикла NAM. При этом каталити ческий остаток Glu активирует С6-гидроксил, оття гивая на себя протон гидроксила [11]. Мы предполагаем, что в полипептидной цепи трансгликозилазы phiKZ gp144 находятся два ак тивных центра: основной, E115/Y197, и дублирую щий, E178/Y147. Участок молекулы пептидогликана может связаться с бороздкой на глобуле фермен та двумя способами (рис. 6). Предположительно, направление укладки субстрата имеет значение для протекания реакции и определяет, какой из ак тивных центров проведет реакцию деградации субстрата. Таким образом, при инактивации одно го из участков активного центра соответствующее направление укладки субстрата не будет сопрово ждаться ферментативным расщеплением. Ключевым остатком, осуществляющим атаку на β-1,4-гликозидную связь, является Glu. При его замене происходит полная инактивация одно го из активных центров, что приводит к снижению активности фермента в 2 раза. Одиночные мутации по остатку Tyr также снижают активность фермента. В пространственной модели активного центра Glu и Tyr обращены друг к другу и образуют водородную связь. Большую часть времени симуляции методом молекулярной динамики они скоординированы та ким же образом. Можно предположить, что Tyr фик сирует Glu в положении, наиболее выгодном с точ ки зрения протекания реакции. Замена Tyr на Phe приводит к смещению боковой цепи Glu в сторону от выгодного положения и изменению активности мутантного сайта. В эксперименте с двойным мутан том E178A/Y197F не обнаружено инактивации сайта. Несмотря на выключение одного из активных цен тров, вызванное заменой Glu, второй остается актив ным без остатка Tyr. Двойной мутант E115A/E178A активности не проявляет, поскольку произведены за мены атакующих остатков Glu в обоих реакционных центрах. Мутант E115A/Y197F не обладает активностью, несмотря на то, что один из реакционных центров остался в нативном состоянии. Двойная мутация близкорасположенных аминокислот привела к сильному изменению конформации связывающей субстрат поверхности (рис. 4), а также к смене заряда в этой области бороздки (рис. 5). Такое изменение свойств поверхности, вероятно, не позволяет phiKZ gp144 связывать субстрат, и фермент полностью теряет активность. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные нами данные подтверждают гипотезу о двух активных центрах у phiKZ gp144 и проясняют механизм действия этого фермента. Дополнительный активный центр появился, вероятно, в ходе эволюционного развития, на что указывает высокая гомоло гия структур активных центров. В настоящее время появляется все больше штаммов патогенных и условно патогенных бакте рий, устойчивых к синтетическим антибиотикам. Альтернативой антибиотикам могут быть «энзиби отики» - токсичные для бактерий ферменты, в том числе пептидогликангидролазы [29]. Один из наибо лее эффективных подходов к конструированию энзи биотиков, активных в отношении грамотрицательных патогенов, - комбинирование ферментов с полика тионными пептидами [30] или создание химерных белков с такими пептидами (артилизины) [31, 32]. Поликатионные пептиды способствуют проникнове нию фермента через внешнюю мембрану бактерии. В этом контексте каталитический домен phiKZ gp144 в силу своей высокой активности и специфичности представляет подходящий объект для создания ин женерных ферментативных противомикробных пре паратов. Детальное понимание механизмов действия пептидогликанлизирующих ферментов позволит создавать на их основе более эффективные средства борьбы с патогенными бактериями.

Об авторах

O. В. Чертков

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: kmi@ibch.ru
Россия

Г. A. Армеев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: kmi@ibch.ru
Россия

И. В. Упоров

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: kmi@ibch.ru
Россия

С. A. Легоцкий

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: kmi@ibch.ru
Россия

Н. Н. Сыкилинда

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: kmi@ibch.ru
Россия

A. K. Шайтан

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: kmi@ibch.ru
Россия

Н. Л. Клячко

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: kmi@ibch.ru
Россия

K. A. Мирошников

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: kmi@ibch.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы