Особенности ответов TRPV1-рецепторов при их активации протонами, капсаицином и их смесью при разных мембранных потенциалах

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Капсаициновые рецепторы (TRPV1) представляют собой сложноорганизованные полимодальные сен сорные системы, которые реагируют на разнообраз ные стимулы как химической, так и физической при роды [1-12]. В большинстве случаев эти воздействия вызывают открытие поры канально-рецепторного комплекса и возникновение трансмембранного ион ного тока. Полимодальность TRPV-рецепторов приво дит к тому, что они способны реагировать не только на аппликацию отдельных агонистов, но и на их ком бинации. Последнее, как правило, вызывает взаим ную потенциацию ответов, что ранее было описано для разных сочетаний агонистических воздействий, в том числе капсаицина, производных арахидоновой кислоты, рН, а также таких физических стимулов, как изменение температуры, мембранного потенци ала или давления [1-13]. В частности, имеются дан ные о том, что закисление среды повышает чувстви тельность TRPV1-рецепторов к капсаицину [4, 14, 15], а повышение температуры смещает зависимость их активации потенциалом в сторону деполяризации [16]. Поскольку закисление среды является важным признаком развивающейся воспалительной реакции [17], то потенциацию TRPV1-рецепторов, наблюда емую при сочетании этих факторов с другими аго нистическими воздействиями (например, с капсаи цином), можно рассматривать как часть сигнального механизма, запускаемого в клетке в ответ на воспаление. Описание феноменологии такой потенциации и ее механизма представляет практический интерес как для понимания самого воспалительного процесса, так и для изучения путей его коррекции. Тем не менее анализ опубликованных данных свидетельствует о том, что описание потенциации TRPV1-рецепторов, наблюдаемой при их одновре менной активации двумя агонистами, не является полным. В частности, отсутствуют данные о том, как такое взаимодействие может зависеть от мем бранного потенциала - важного параметра клетки, влияющего как на сигнальные каскады, так и на сами рецепторы, в том числе и капсаициновые. Задачей настоящей работы было изучение взаимо действия агонистов капсаицина и протонов при раз ных значениях потенциала фиксации. Показано, что нелинейная суммация отве тов рецепторов TRPV1 на совместную апплика цию протонов и капсаицина наблюдается лишь при потенциалах, близких к потенциалу покоя. При деполяризации мембраны при развитии воспа ления и различных патологий суммация становит ся линейной. По всей видимости, данное свойство TRPV1-рецепторов является защитным, ограничи вающим их гиперактивацию в патологических состо яниях. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Работа выполнена на рекомбинантных рецепторах TRPV1, конститутивно или транзиентно экспресси рующихся в клетках CHO. Клетки CHO культиви ровали в стандартных условиях в среде DMEM/F12 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, «Биолот») c 10% эмбриональной бычьей сывороткой (fetal bovine serum, Hyclone) и 1% гентамицином в инкубато ре с влажной атмосферой, 5% содержанием CO2 при температуре 37°C. Трансфекцию проводили с помощью липофектамина-2000 (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. Для транс фекции на 35-мм чашку Петри с культурой СНО на носили 0.5 мкг плазмиды, кодирующей ген TRPV1, и 0.5 мкг плазмиды, кодирующей ген eGFP, которые были предоставлены Dr. Staruschenko и Dr. Medina соответственно. Эксперименты проводили со 2 по 5 день после трансфекции. Эффективность трансфек ции определяли по интенсивности флуоресценции GFP, оцениваемой на микроскопе MF-51 (M-shot). Часть работы выполнена на конститутивно трансфи цированных клетках CHO, любезно предоставленных лабораторией Е.В. Гришина. Различия между двумя видами трансфекции отсутствовали, поэтому данные были объединены. Регистрацию токов осуществляли в конфигура ции «целая клетка» в режиме фиксации мембран ного потенциала. В работе использовали усилитель EPC10 (HEKA Electronik, США) и пакет программ PatchMaster v8.2 (HEKA Elektronik). Тестовые рас творы апплицировали с помощью системы смены растворов NANION (Nanion, Германия) через микро манифолд с внутренним диаметром 250 мкм, время замены раствора составляло около 100 мс. Для сни жения десенситизации рецепторов в результате мно гократной аппликации растворов частота их предъ явления не превышала 1 раза в 45 с. Регистрирующие пипетки изготавливали на микрокузнице P-87 (Sutter Instruments Сo., США) из боросиликатных заготовок с филаментом (Sutter Instruments С o.). Наружный и внутренний диаметры заготовок - 1.5 и 0.86 мм соответственно. Сопротивление заполнен ных пипеток составляло 3-6 МОм. Для электрофи зиологических тестов клетки переносили в раствор следующего состава (мМ): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgSO4, 2.5 CaCl2; 10 глюкоза; 10 HEPES, рН 7.4. Состав пи петочного раствора (мМ): 100 CsF, 40 CsCl, 5 NaCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, рН 7.2. Для приготовления рас творов использовали реактивы фирмы Sigma (США). Капсаицин разводили согласно рекомендациям фир мы (Sigma), в 96% этаноле до концентрации 10 мМ и добавляли необходимое количество для получения указанных конечных концентраций. Статистическую обработку осуществляли с помо щью программы EXCEL. Сравнение средних значе ний и оценку их принадлежности к одной/разным выборкам проводили с помощью парного t-теста Стьюдента, поскольку выборки средних были полу чены на одной клетке. Поскольку разные клетки име ли разные амплитуды ответов на капсаицин и прото ны (ввиду разной плотности рецепторов и различий размеров клеток), то при измерении потенциру ющего действия мы нормировали амплитуды тока каждой клетки на амплитуду капсаицинового ответа этой клетки. Величину ЕС50 и коэффициента Хилла оценивали с помощью пакета ORIGIN при аппрок симации экспериментальных данных теоретической кривой уравнения Хилла: I = Imax(1/(1 + (EC50/[C])s)), где Imax - амплитуда тока при насыщающих концен трациях лигандов, капсаицина или рН; I - амплитуда тока при текущей концентрации лиганда [C]; EC50 - концентрация половинного максимального эффекта; s - коэффициент Хилла. ЕС50 для концентрации про тонов обозначен в тексте в единицах кислотности - pH50. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Для исследования совместного действия использу емых агонистов TRPV1-рецепторов сначала оце нивали диапазон рабочих концентраций при их аппликации по отдельности. С этой целью строили графики дозовой зависимости действия капсаици на и протонов при мембранном потенциале -80 мВ. Полученные результаты представлены на рис. 1. Видно, что ответы на закисление среды возникают при рН 6.5, далее их амплитуда растет с повышени ем кислотности и достигает насыщения при рН 5.5 и выше. Ответы на капсаицин появлялись при кон центрации 0.01 мкМ, достигали насыщения при зна чениях, близких к 100 мкМ. Однако с ростом концен трации капсаицина амплитуда ответов снижалась. Вероятно, падение амплитуды ответов при высоких концентрациях капсаицина связано с его неспеци фическим действием на мембрану клеток. Поэтому концентрации капсаицина выше 100 мкМ в дальней шем не использовали. EC50 для капсаицина составила 2.2 ± 1.2 мкМ (n = 10), а рН50 для рецепторов TRPV1 составил 6.0 ± 0.05 (n = 10), что хорошо согласуется с данными [4]. Следует отметить, что ни капсаицин, ни рН в исследованных концентрациях не вызывали тока у нетрансфицированных клеток CHO. Ответы на капсаицин и рН у трансфицированных клеток блокировались 10 мкМ рутениевого красного. Это свидетельствует о том, что регистрируемые в этих условиях токи опосредованы рецепторами TRPV1. Для изучения взаимодействия эффектов протонов и капсаицина при разных потенциалах использовали следующий протокол. Сначала регистрировали ответ на аппликацию раствора с определенным значени ем рН, далее подавали раствор с капсаицином, после чего апплицировали раствор с заданным рН и кап саицином совместно и в тех же концентрациях. В от дельной серии экспериментов мы показали, что из менение порядка (последовательности) аппликации агонистов не влияло на амплитуды ответов. В ходе анализа данных амплитуду ответа на совместную ап пликацию капсаицина и протонов (I(рH+Кап)) сопостав ляли с суммой амплитуд ответов (IpH + IКап), получен ных при аппликациях капсаицина (IКап) и протонов (IpH) по отдельности. Полученные данные иллюстри рует рис. 2, где в качестве тестовых концентраций капсаицина и протонов взяты 0.1 мкМ и рН 5.0 соот ветственно. Из рис. 2 видно, что амплитуда ответов на совместную аппликацию используемых агонистов (I(pH+Кап)) может существенно превышать сумму ам плитуд ответов (IpH + IКап), полученных при аппли кациях капсаицина (IКап) и рН (IpH) по отдельности. Данная потенциация зависит от уровня мембранно го потенциала и максимально выражена в условиях гиперполяризации клетки. При потенциале -40 мВ амплитуда тока, вызываемого 0.1 мкМ капсаицином при рН 5.0, достоверно превышала сумму ответов, вызываемых при аппликации 0.1 мкМ капсаицина и при снижении рН до 5.0, при р < 0.01; при потенци але -120 мВ это различие было достоверно при р < 0.001. Смещение МП в сторону деполяризации сни жает уровень потенциации и приближает амплитуду ответа на совместную аппликацию капсаицина и про тонов к сумме ответов при их независимой апплика ции. При 20 и -20 мВ различия амплитуд совместного ответа и суммы амплитуд отдельных ответов на аго нисты недостоверны. Для более детальной характеристики феномена потенциации TRPV1-рецепторов аналогичные экс перименты проводили при разных концентрациях агонистов. Концентрацию капсаицина варьировали в диапазоне от 0.1 до 10 мкМ, а уровни рН - от 5.5 до 7.0. В качестве параметра оценки выявленной потенциации использовали отношение амплитуды тока, полученного при совместной аппликации аго нистов (I(pH+Кап)), к сумме амплитуд токов, получен ных при аппликации этих агонистов по отдельности (IpH + IКап). В графическом виде значения этой ве личины (I(pH+Кап))/(IpH + IКап) представлены на рис. 3. В столбцах этого рисунка приведены данные, полу ченные при одних и тех же значениях рН, где ва рьировали концентрацию капсаицина, а в строках - при одних и тех же концентрациях капсаицина, где варьировали рН. Следует отметить, что при концен трации капсаицина больше 10 мкМ эффект потенци ации не наблюдался, поэтому тесты с более высокой концентрацией агониста не проводили. Из рис. 3 видно, что эффект потенциации за висит от всех параметров, контролируемых в этих тестах. Наибольший эффект наблюдали в условиях максимальной гиперполяризации клеток при мак симальной закисленности среды и наименьших кон центрациях капсаицина (см. верхний левый график на рис. 3). Видно, что степень потенциации TRPV1 рецепторов прямо зависит от концентрации прото нов и растет по мере закисления при фиксации кон центрации капсаицина. При этом потенцирующее действие протонов лучше проявляется при низких концентрациях капсаицина и практически исчезает при повышении концентрации до 10 мкМ. Таким об разом, наблюдается обратная зависимость потенциации токов, вызванных протонами, от концентрации капсаицина, т.е. при возрастании концентрации кап саицина происходит уменьшение степени потенци ации. Чувствительность потенциации рецепторов капса ицина к мембранному потенциалу клетки позволяет предположить, что аппликация капсаицина в услови ях снижения рН среды будет приводить к изменению вольт-амперных характеристик ответов капсаици нового рецептора на действие агонистов. Для про верки этого предположения мы сопоставили вольт амперные характеристики каналов, полученные при активации рецепторов капсаицином, протонами и совместной аппликации этих агентов при концен трациях, которые в предыдущих опытах соответ ствовали максимальной выраженности эффекта по тенциации. Результат этих экспериментов показан на рис. 4. Ответы на протоны, капсаицин характери зуются входящим выпрямлением, что хорошо согласуется с данными [2, 14]. При совместной аппликации протонов и капсаицина степень выпрямления умень шается. Ослабление выпрямляющих свойств рецеп торов TRPV1 можно рассматривать как элемент ме ханизма, который регулирует сигнальные функции рецепторов при развитии воспалительных реакций, рецепции боли, терморегуляции и прочих функций, в которые вовлечены TRPV1-рецепторы [1-12]. Полученных нами данных недостаточно для фор мирования окончательного вывода о механизмах по тенциации капсаициновых рецепторов при совмест ной аппликации капсаицина и протонов. Однако, учитывая факт изменения выпрямляющих свойств канала при совместной подаче агонистов, в каче стве механизма этого явления можно рассматривать как потенциал-зависимое увеличение чувствитель ности этих рецепторов к одному из агонистов в при сутствии другого, так и возможность модификации параметров инактивации рецепторов в данных экс периментальных условиях. Для проверки этих пред положений и выявления механизмов взаимодействия ответов, вызываемых при активации рецепторов протонами и капсаицином при разных потенциалах, а также физиологического значения такого взаимо действия необходимы дополнительные исследования. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Обнаруженная зависимость потенцирующего дей ствия агонистов TRPV1 при их совместной аппли кации от мембранного потенциала показывает еще одну особенность рецепторов TRPV1, позволяющую им тонко подстраивать свой ответ к совокупности внешних и внутренних факторов. Так, потенциация ответов TRPV1 при гиперполяризации позволяет этим рецепторам включаться на ранней стадии вос паления, когда концентрация воспалительных аген тов еще не слишком высока. Поскольку срабатывание данных рецепторов может быть связано с запуском апопоптоза, то исчезновение потенциации ответов при совместной аппликации агонистов на фоне де поляризации будет служить защитным механизмом. Однако понимание функциональной значимости ам плитуды ответов TRPV1, а также характеристика молекулярных механизмов, опосредующих взаимо действие разных агонистов данных рецепторов, тре бует дальнейших исследований.

Об авторах

E. A. Цветков

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: k.bolshakov@biotechnologies.ru
Россия

Н. Н. Потапьева

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Email: k.bolshakov@biotechnologies.ru
Россия

K. В. Большаков

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН; Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: k.bolshakov@biotechnologies.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы