Дифференцировка плюрипотентных клеток человека в мезодермальные и эктодермальные производные не зависит от типа репрограммированных изогенных соматических клеток

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Изменение эпигенетического состояния клетки с помощью тех или иных внешних условий кардинальным образом влияет на программу специализи рованной соматической клетки [1, 2]. При этом наиболее часто используемые интеграционные вирусные или неинтеграционные способы репрограммирования до плюрипотентного состояния не влияют су щественно на геном соматических клеток, подвергающихся репрограммированию [3]. Практическое использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) в медицинских или ис следовательских целях подразумевает применение дифференцированных производных плюрипотент ных клеток. Протоколы направленной дифференцировки основаны, главным образом, на изменении эпигенетического состояния плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) при воздействии на них усло вий, которые имитируют процессы, происходящие во время индивидуального развития организма. Таким образом, изначальное эпигенетическое состо яние и вариабельность отдельных линий иПСК, даже полученных из одного источника, могут оказывать значительное влияние на конечный результат диф ференцировки. Например, для выбора линии иПСК, наиболее подходящей для трансплантации получен ного из нее пигментного эпителия сетчатки глаза, проанализировано 25 линий клеток [4], что требует очень много времени и материалов. С целью изучения вклада процесса репрограммирования и эпигенома соматической клетки в конечное состояние иПСК, а также оптимизации выбора линий репрограммиро ванных клеток нами ранее была разработана система изогенных линий плюрипотентных и соматических клеток. Изогенная система клеточных линий позволила показать, что при полном функциональном ре программировании в клонах иПСК не остается сле дов их тканеспецифического происхождения. Однако в репрограммированных клетках присутствовали индивидуальные, специфичные для каждого клона иПСК «эпигенетические следы», говорящие о том, что приобретение клетками плюрипотентности про изошло не обычным путем, а через прохождение клеткой состояния, отличного от зародышевого пути [5]. Появление этих индивидуальных, не связанных с репрограммированием особенностей может быть вызвано технологическими манипуляциями in vitro, такими, как клонирование, сортировка клеток и др. Несомненно, направленное влияние таких манипуля ций на геном может отрицательно сказаться на даль нейшем применении иПСК. Так, широко обсуждается возможность создания банков репрограммированных линий клеток - как персональных, так и универ сальных линий иПСК, которые будут совместимы с большим количеством реципиентов [6]. При этом открытым остается вопрос, донорские клетки какого типа (фибробласты кожи, клетки крови, волосяной луковицы и т.д.) необходимо применять для репро граммирования. По результатам наших и других ис следований можно сделать вывод о функциональной идентичности изогенных иПСК, полученных из сома тических клеток различного типа [5, 7]. Однако, учи тывая, что в дальнейшем их придется дифференци ровать в специализированные типы клеток in vitro, необходимо знать, насколько будет различаться их способность к дифференцировке. В представленной работе изучали влияние гене тических манипуляций, отбора клонов и разделения клеток in vitro на молекулярно-генетические свойства иПСК. С этой целью использовали линии изогенных соматических клеток, полученных из эм бриональных стволовых клеток человека (ЭСК), и их репрограммированные в иПСК производные. Cравнивали способность к дифференцировке изо генных линий иПСК, репрограммированных из соматических клеток трех типов, в нейрональном и гемопоэтическом направлениях. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Клеточные линии В работе использовали линии клеток hESM01, hESM01n5 (далее n5), фибробласты, нейроны, клетки пигментного эпителия сетчатки, дифференцирован ные из hESM01n5 (F,N,R соответственно), и линии иПСК iF, iN, iR, полученные путем генетического репрограммирования линий F, N, R соответственно [5]. В экспериментах по гемопоэтической дифферен цировке использовали линии ЭСК HUES 9 [8], H9 [9], линии иПСК endo-iPS12 [10] и IPSRG2L [11]. Линии endo-iPSS5 и endo-iPSS9 получены репрограмми рованием клеток HUVEC с помощью вируса Сендай. Линии иПСК культивировали согласно [5]. Среды для гемопоэтической дифференцировки Среда 1 для эмбриоидных телец (ЭТ1): Stemline II (Sigma), пенициллин-стрептомицин («ПанЭко», 5000 Ед/мл пенициллина и 5000 Ед/мл стрептоми цина), VEGF (Prepro Tech) 100 нг/мл, BMP-4 (Prepro Tech) 50 нг/мл, FGF (Prepro Tech) 20 нг/мл. Среда 2 для эмбриоидных телец (ЭТ2): Stemline II (Sigma), пенициллин-стрептомицин («ПанЭко», 5000 ЕД/мл пенициллина и 5000 ЕД/мл стрептоми цина), VEGF (Prepro Tech) 100 нг/мл, BMP-4 (Prepro Tech) 50 нг/мл, FGF (Prepro Tech) 20 нг/мл, цито киновый коктейль CC110 (Stemcell Technologies) 100-кратный или SCF (Prepro Tech) 20 нг/мл. Гемангиобласты культивировали в полужидкой сре де (СГБ): Methocult 4436 (Stemcell Technologies), FGF (Prepro Tech) 20 нг/мл, VEGF (Prepro Tech) 50 нг/мл, SCF (Prepro Tech) 20 нг/мл, FLT3-L (Prepro Tech) 20 нг/мл, TPO (Prepro Tech) 20 нг/мл, рекомбинант ный HoxB4 2 мкг/мл. Гемопоэтическая дифференцировка ПСК ПСК культивировали на 35-мм чашке Петри (Corning), покрытой Matrigel matrix (BD), и вы ращивали до 70% монослоя и обрабатывали 0.05% раствором Trypsin-EDTA до одноклеточного со стояния. Трипсин инактивировали, добавляя среду DMEM («ПанЭко») c 10% фетальной бычьей сыво ротки (FBS, Gibco). Эмбриоидные тельца формиро вали в Aggrewell (Stemcell Technologies) в течение 24 ч в среде mTeSR1 (Stemcell Technologies) с до бавлением 10 мкМ Y-27632 (Stemgent). Переносили эмбриоидные тельца в 24-луночный планшет с низ кой адгезией (Costar) в объеме 1 мл на лунку в среде ЭТ1 и инкубировали в течение 48 ч. Из лунки отбирали 500 мкл, добавляли 500 мкл среды ЭТ2 и ин кубировали в течение 48 ч. Эмбриоидные тельца об рабатывали 0.05% Tripsin-EDTA в течение 4-6 мин. Затем трипсин инактивировали, добавляя среду DMEM c 10% FBS. Клетки центрифугировали в те чение 5 мин при 200 g. Клетки (200-500 тыс. в объеме не более 100 мкл cреды IMDM («ПанЭко»)) вносили в лунки 6-луночного планшета с низкой адгезией (Costar) со средой СГБ, используя шприцы (Stemcell Technologies) с тупой иглой для метилцеллюлозы. Инкубировали в течение 6-8 дней. Добавляли еще 2 мл СГБ и инкубировали 2-4 дня. Для сравнения эф фективности дифференцировки подсчитывали ко личество колоний гемангиобластов на 10 день после внесения в СГБ. Способность гемангиобластов дифференцировать ся в клетки крови проверяли путем внесения геман гиобластов в метилцеллюлозную среду Methocult 4436 (Stemcell Technologies). Результат оценивали по истечении 3 недель. Нейрональная дифференцировка Нейрональную дифференцировку в нейральные предшественники и нейроны проводили согласно [11]. FACS-анализ нейральных предшественников про водили с использованием антител к CD56 PE Abcam cat # 2412540 (Sony Biotechnology) (в разведении 1 : 25) и изотипического контроля Mouse IgG1PE Abcam cat # 2600560 (1 : 166). Для флуоресцентного анализа использовали антитела к βIII-тубулину в разведении 1 : 1000 (Abcam), вторичные антитела Invitrogen Goat anti Rabbit IgG Alexa Fluor 488 в разведении 1 : 1000. Выделение суммарной РНК из клеточных куль тур, ПЦР в реальном времени проводили согласно [5]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Отбор и селекция иПСК не вносят системных изменений в метилирование и транскрипцию генов Работа с культурами ПСК человека и особенно ге нетические манипуляции с этими клетками сопря жены с селекцией и/или клонированием клеток. Ранее мы получили и описали изогенную клеточную систему, которая позволяет изучать молекулярные механизмы процессов репрограммирования и диф ференцировки [5]. В процессе создания изогенной си стемы несколько раз проводили последовательный отбор клонов и сортировку клеток (рис. 1). В связи с этим возник вопрос, насколько манипуляции кло нирования ПСК человека в культуре могут оказы вать системное влияние на полногеномном уровне на экспрессию генов и метилирование ДНК, приводя к тому, что экспрессия некоторых генов и паттерны метилирования CpG изменялись просто из-за про хождения через «бутылочное горлышко» отбора. Селективное давление может приводить к повышен ной экспрессии генов, связанных с выживанием кле ток, и давать им преимущество в росте без изменения других свойств [12]. В разработанной нами системе (рис. 1) в линию ЭСК человека hESM01 были вве дены гены факторов репрограммирования под кон тролем индуцибельного промотора и выбран клон hESM01n5 (далее n5), который имел наименьший уровень «подтекания» трансгенов и сохранил свой ство плюрипотентности [5]. На следующем раунде отбора использовали магнитную сортировку диффе ренцированных производных n5 с помощью антител к специфическим маркерам трех типов соматических клеток человека. Последний раунд прохождения че рез «бутылочное горлышко» произошел после индук ции трансгенов и отбора клонов иПСК (рис. 1). Нами был проведен анализ профиля экспрессии генов и уровня метилирования ДНК (база данных GSE70739) в каждой линии клеток, полученных на каждом этапе разработки системы. Мы предположили, что селек тивное давление может приводить к последователь ному изменению экспрессии и/или метилирования генов, обеспечивать им преимущество в выживании и пролиферации. Для того чтобы идентифицировать гены и CpG, уровень экспрессии и метилирования ко торых постепенно повышался или понижался в ходе процедур отбора клеток, сравнивали уровни экспрес сии/метилирования в иПСК, в родительских линиях соматических клеток и в изогенной линии ЭСК n5. Значимым считали поэтапное увеличение/умень шение со значением 0.2 для метилирования CpG и изменение в 1.5 раза в случае экспрессии генов. Анализировали данные для 11 клеточных линий (две линии ЭСК, три линии соматических клеток и шесть линий иПСК), клетки которых прошли по три раун да «бутылочного горлышка». Было обнаружено, что транскрипция очень небольшого количества генов постепенно уменьшалась или увеличивалась во вре мя манипуляций с клетками, но уровень транскрипции ни одного гена не изменился во всех клеточных линиях синхронно (табл. 1). Это свидетельствует в пользу того, что использованный подход, иден тичный для всех линий иПСК, не внес системных изменений в экспрессионный профиль клеток, а на блюдаемые отклонения в экспрессии были случай ными. Однако анализ профиля метилирования изо генных линий ПСК и соматических клеток выявил постепенное увеличение уровня метилирования гена Rex1 (также известного как ZFP42) (табл. 2). В на стоящее время не существует однозначной инфор мации о функции этого гена в раннем эмбриональном развитии. По мнению одних исследователей этот ген считается маркером плюрипотентности [13], однако, даже в его отсутствие ЭСК мыши способны к самооб новлению и остаются плюрипотентными [14]. Как по казано ранее, в ЭСК человека Rex1 экспрессируется даже при 50% метилировании промотора [15]. С ис пользованием ПЦР в реальном времени мы проана лизировали уровень экспрессии Rex1 и сопоставили его с метилированием промоторного участка (рис. 2). Уровень экспрессии Rex1, так же как и степень ме тилирования его промотора, существенно варьирова ли в проанализированных линиях плюрипотентных клеток. Однако мы не обнаружили корреляции меж ду уровнем метилирования Rex1 и его экспресси ей. Например, в двух клонах iN (иПСК, полученные из нейронов) и одном клоне iR (иПСК, полученные из пигментного эпителия сетчатки) уровень экспрес сии Rex1 был более чем в 3 раза выше, чем во всех остальных линиях ПСК (рис. 2). Таким образом, культивирование, репрограммирование и отбор, ко торые привели к гиперметилированию промоторной области Rex1, не влияли на экспрессию гена в линиях иПСК. Это наблюдение дополнительно подтверждает предположение о вспомогательной роли Rex1 в под держании клетками плюрипотентности, а также ука зывает на то, что экспрессия Rex1 не зависит от ста туса метилирования и крайне неоднородна в разных линиях иПСК, как отмечали ранее [12, 15]. В целом, полученные результаты говорят о том, что проце дуры генетических модификаций, селекция клонов и сортировка клеток не оказывают системного вли яния на полногеномном уровне на экспрессию генов и метилирование ДНК в ПСК человека. Этот вывод имеет большое практическое значение в связи с воз можным применением технологий с использованием ПСК человека в регенеративной медицине. Сравнение способности изогенных ПСК к дифференцировке в гемопоэтическом направлении Разработанная изогенная система анализа репро граммирования и дифференцировки ПСК человека позволила доказать, что для репрограммирования можно использовать соматические клетки любого типа, так как в установление и поддержание состо яния плюрипотентности тип использованных клеток ощутимого вклада не вносит [5]. Однако, учитывая, что в дальнейшем будут использоваться дифферен цированные производные ПСК, остается открытым вопрос, насколько тип соматических клеток, из ко торых получены иПСК, будет влиять на эффектив ность дифференцировки. Для оценки такого влияния было решено изучить эффективность дифферен цировки изогенных иПСК человека, полученных из фибробластов (iF), нейронов (iN) и пигментного эпителия сетчатки (iR), в гемопоэтические клетки и нейроны. Для оценки эффективности гемопоэтиче ской дифференцировки ПСК через стадию эмбрио идных телец были дифференцированы в ранние ме зодермальные производные (рис. 3А). Полученные ранние мезодермальные производные обладали свойствами гемангиобласта, так как могли диффе ренцироваться в клетки крови (рис. 3Б) и эндотелий (данные не приведены). При внесении гемангиобла стов в полужидкую метилцеллюлозную среду, содер жащую гемопоэтические цитокины и факторы роста, гемангиобласты образовывали разные типы гемо поэтических колоний - эритроидные (КОЕ-Э), ма крофагальные (КОЕ-М), гранулоцитарные (КОЕ-Г), смешанные гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ), а также колонии смешанного типа КОЕ-микс, что говорит о том, что гемангиобласты принадлежат к клеткам кроветворного ряда. Примеры подобных колоний приведены на рис. 3Б. Способность различ ных линий иПСК дифференцироваться оценивали по количеству образующихся на 10 день в СГБ ко лоний гемангиобластов. Проведенный подсчет по казал, что способность ПСК к дифференцировке в гемопоэтическом направлении сильно варьирует между линиями, но не зависит от их происхожде ния. Например, самой низкой эффективностью ге мопоэтической дифференцировки обладала линия hESM01 (рис. 3В), а линия n5, полученная на ее ос нове, характеризовалась значительно большей эф фективностью гемопоэтической дифференцировки. Между собой изогенные линии иПСК практически не отличались по способности дифференцироваться, несмотря на то, что были получены из производных разных зародышевых листков. Фибробласты и клет ки крови принадлежат к одному зародышевому лист ку, однако эффективность дифференцировки iF была сравнимой с изогенными иПСК других типов сома тических клеток, полученных одновременно с ними. Остальные линии, использованные в качестве линий сравнения, проявляли различную эффективность дифференцировки. Следует отметить, что, в отличие от ранее опубликованных данных, мы не наблюдали сниженной эффективности дифференцировки ли ний иПСК человека в гемопоэтическом направлении по сравнению с ЭСК [16]. Эти результаты указыва ют на то, что способность к гемопоэтической диффе ренцировке является внутренним свойством каждой конкретной линии ПСК и оптимальное направление дифференцировки можно выбрать, используя, на пример, gene cards [17]. Изогенные линии иПСК име ли практически одинаковую способность к диффе ренцировке в гемопоэтическом направлении, так как, по-видимому, одинаковый способ и одновременность репрограммирования, а также культивирования и прочие внешние условия внесли больший вклад в сходство линий, чем было заложено различий в их тканевом происхождении. Сравнение способности изогенных ПСК к дифференцировке в нейрональном направлении Одно из наиболее востребованных направлений ис пользования дифференцированных производных ПСК - изучение функционирования нервной систе мы и терапия нейродегенеративных заболеваний. В связи с этим актуальным становится сравнитель ный анализ эффективности дифференцировки изо генных ПСК в нейрональном направлении. Для это го исходную линию ЭСК и изогенные ей иПСК iN, iF, iR дифференцировали по нейрональному пути (рис. 4А). Эффективность дифференцировки оце нивали по иммуноцитохимической окраске клеток и с помощью проточной цитофлуориметрии на ста дии нейрональных предшественников, несущих по верхностный антиген CD56 (NCAM). Разработанный протокол позволял с высокой эффективностью по лучать нейрональные предшественники, более 90% клеток были положительными по NCAM (рис. 4Б). Мы не обнаружили различий в эффективности дифференцировки до стадии нейрональных пред шественников между линиями ПСК различного происхождения. В ходе последующей дифферен цировки были получены постмитотические ней роны (рис. 4В), которые проанализировали иммуногистохимически на наличие βIII-тубулина. Мы также не обнаружили статистически значимых различий между линиями ПСК в эффективности дифференцировки в постмитотические нейроны (данные не приведены). Таким образом, как и в слу чае с гемопоэтической дифференцировкой, тип соматических клеток, использованных для репро граммирования, не играет роли в эффективной дифференцировке ПСК по нейрональному пути. Из полученных результатов следует несколько важных практических выводов. Во-первых, при соз дании банка аллогенных иПСК с целью их даль нейшего применения в виде дифференцированных производных не важен тип соматических клеток, использованных для репрограммирования. От од ного донора можно брать клетки кожи или крови, а от другого - нервную ткань (если она доступна). При этом полностью репрограммированные иПСК могут быть идентичными по своему потенциа лу дифференцировки. Кроме того, нами показано, что ни генетические манипуляции, ни селекция клонов ПСК не оказали системного влияния на их свойства. Несомненно, экспрессия генов скорее свя зана с изменениями в хроматине, чем с мутациями, влияющими на работу гена. Это дополнительно под тверждают недавно опубликованные данные о вы сокой генетической стабильности ПСК [18]. Хотя ранее были обнаружены значительные вариации в эпигенетических маркерах ПСК человека [19, 20], данные последних исследований свидетельствуют о том, что современные методы культивирования ПСК человека позволяют сохранять эпигенетиче ский профиль на протяжении длительного срока. Таким образом, линии ПСК и их производные уже сегодня могут представлять собой хорошо стандартизованные культуры, что открывает возможность их практического использования.

Об авторах

E. С. Филоненко

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Email: lagar@vigg.ru
Россия

M. В. Шутова

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Email: lagar@vigg.ru
Россия

Е. А. Хомякова

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН; Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства

Email: lagar@vigg.ru
Россия

Е. М. Васина

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Email: lagar@vigg.ru
Россия

О. С. Лебедева

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства

Email: lagar@vigg.ru
Россия

С. Л. Киселев

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН; Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства; Казанский федеральный университет

Email: lagar@vigg.ru
Россия

М. А. Лагарькова

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН; Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства; Казанский федеральный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: lagar@vigg.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы