Сфероиды HER2-положительной аденокарциномы молочной железы человека как модель для тестирования противоопухолевых иммунотоксинов

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Сложная структура солидных опухолей in vivo соз дает объективные трудности в исследовании опухолевого процесса и оценке терапевтического по тенциала противоопухолевых препаратов in vitro. Использование с этой целью монослойной культуры опухолевых клеток, несмотря на ее широчайшее рас пространение, не отражает ряда особенностей реальной опухоли, прежде всего, ее трехмерной организации. Трехмерное строение опухоли предполагает существование многочисленных межклеточных кон тактов, а также значительных градиентов концентрации газов, питательных веществ и катаболитов по всему объему образования, способствуя формированию специфического микроокружения клеток различных слоев. В свою очередь, это приводит к гетерогенности клеточных популяций в опухоли, вы ражающейся в варьировании профилей экспрессии генов и метаболизма. Гетерогенность опухоли во многом определяет ответ новообразования на терапевтическое воздействие. Кроме того, наличие межклеточных контактов затрудняет проникновение крупных молекул внутрь опухоли, в результате чего на эффективность лекарственных препаратов влияет их способность к диффузии через опухолевую массу [1]. В связи с этим все большее распространение получают трехмерные модели опухоли in vitro, такие, как сфероиды опухолевых клеток. Многоклеточные опухолевые сфероиды представляют собой плотные конгломераты опухолевых клеток и воспроизводят аваскулярную стадию развития опухолевого узла, т.е. небольшую первичную опухоль, ранний метастаз или зону опухоли, расположенную далеко от сосуда. Структурная близость сфероида к реальной опухоли обусловливает бóльшую релевантность данной модели, позволяя с ее помощью более корректно оценивать противоопухолевый эффект исследуемых агентов в условиях in vitro [2, 3]. Учитывая стреми тельное развитие таргетной (направленной) терапии [4], актуально получение и использование сфероидов клеток, экспрессирующих молекулярные мишени, определяющие специфичность исследуемого таргетного агента. Нами получены сфероиды аденокарциномы мо лочной железы человека, сверхэкспрессирующей ре цептор-мишень HER2, и показана информативность использования данной модели для оценки глубины проникновения HER2-специфичного иммунотоксина 4D5scFv-PE40 и его противоопухолевого эффекта. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Получение сфероидов аденокарциномы молочной железы человека В работе использовали клетки аденокарциномы молочной железы человека SKBR-3 (номер по каталогу ATCC - HTB-30), характеризующиеся сверхэкспрессией рецептора HER2 [5]. Клетки культивировали в среде McCoy’s 5A, содержащей 1.5 мМ глутамина (HyClone, США), с добавлением 10% (v/v) эмбриональной сыворотки теленка (HyClone, США), при 37°C и 5% CO2. Для снятия клеток с подложки использовали раствор Версена («ПанЭко», Россия). Сфероиды получали тремя способами. В первом варианте использовали 96-луночный культуральный планшет со стандартной адгезией поверхности (Corning, США), предварительно покрытый 1% рас творомагарозы (AppliChem, Германия), приготовленным на дистиллированной воде (50 мкл на лун ку). Во втором и третьем вариантах использовали 96-луночные планшеты из пластика со сверхнизкой адсорбцией Ultra Low Attachment Microplate с плоским и круглым дном соответственно (Corning, США). Во всех вариантах суспензию клеток SKBR-3 вноси ли в лунки соответствующих планшетов в количестве 200 клеток на лунку. Изображения сфероидов получали методом фазового контраста на инвертированном микроскопе Axiovert 200 с использованием объектива EC Plan-Neofluar 10 × /0.3 (Carl Zeiss, Германия). Объем формировавшихся сфероидов (V, мкм3) рассчитывали по формуле: V = a×b2 ⁄2, где a - больший диаметр (мкм), b - меньший диаметр (мкм). Получение иммунотоксина 4D5scFv-PE40 Рекомбинантный иммунотоксин 4D5scFv-PE40 [6] нарабатывали в клетках Escherichia coli штамма BL21(DE3), трансформированных плазмидой pSD-4D5scFv-PE40, содержащей ген соответствующего белка под контролем lac-промотора. Очистку белка проводили последовательно методами металл-хелат ной аффинной хроматографии на колонке HisTrap FF 1 ml (GE Healthcare, США) и анионообменной хроматографии на колонке QSepharose FF 1 ml (GE Healthcare, США) согласно инструкциям производителя. Фракции, содержащие белок, анализировали с помощью электрофореза в 12% ПААГ в денатурирующих условиях согласно стандартному протоколу. Анализ цитотоксичности иммунотоксина 4D5scFv-PE40 в отношении монослоя и сфероидов SKBR-3 Для исследования цитотоксичности иммунотокси на 4D5scFv-PE40 в отношении монослойной культуры SKBR-3 суспензию клеток высевали на 96-лу ночный культуральный планшет (Corning, США) по 2000 клеток на лунку и культивировали в течение ночи. После этого ростовую среду в лунках заменяли на свежую, содержащую 4D5scFv-PE40 в различных концентрациях (10-5-102 нМ), и инкубировали в течение 72 ч. Жизнеспособность клеток оценивали методом МТТ-теста [7]. Для этого заменяли среду в лунках на свежую, содержащую 0.5 мг/мл MTT (Alfa Aesar, Великобритания), и инкубировали в течение 4 ч. Образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в ДМСО («ПанЭко», Россия), затем измеряли оптическую плотность в лунках при 570 нм с использованием планшетного спектрофотометра Synergy MX (BioTek, США). Сфероиды получали по описан ной выше методике с использованием 96-луночных круглодонных планшетов из пластика со сверхнизкой адсорбцией и культивировали в течение ночи. Цитотоксичность иммунотоксина 4D5scFv-PE40 в отношении сфероидов изучали таким же образом, но увеличивали время инкубации в его присутствии до 168 ч. Относительную жизнеспособность клеток представляли в виде процентного отношения усреднен ной оптической плотности в лунках с обработанными клетками к усредненной оптической плотности в лунках с необработанными клетками. Оценку цитотоксичности иммунотоксина в отношении сфероидов оценивали также по данным объема сфероидов на последний день инкубации в присутствии иммунотоксина: в этом случае относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процентное отношение усредненных объемов обработанных и необработанных сфероидов. Обработку полученных данных проводили в программе GraphPad Prism 6 (GraphPad Software). Расчет IC50 проводили методом нелинейной регрессии с использованием четырехпараметрической модели доза-эффект. Оценка проникновения иммунотоксина 4D5scFv-PE40 в сфероиды Для визуализации проникновения иммунотоксина в сфероид 4D5scFv-PE40 конъюгировали с низкомолекулярным флуоресцентным красителем DyLight650. Для проведения реакции конъюгации белок переводили в боратный буфер (400 мM H3BO3, 70 мM Na2B4O7, pH 8.0) методом гель-фильтрации на колонке PD SpinTrap G-25 (GE Healthcare, США). Для конъюгации использовали N-гидроксисукцинимидное производное DyLight650 NHS Ester (Thermo Fisher Scientific, США), обеспечивающее конъюгацию красителя по первичным аминогруппам белка. Инкубировали белок с 7-кратным молярным избытком DyLight650 NHS Ester, разведенного в ДМСО, в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте в соответствии с рекомендациями производителя. Несвязавшийся краситель удаляли методом гель-фильтрации на колонке PD SpinTrap G-25, уравновешенной фосфатно-солевым буфером (PBS), pH 7.4 («ПанЭко», Россия). Для получения сфероидов суспензию клеток SKBR-3 вносили в лунки 96-луночного круглодонного планшета из пластика со сверхнизкой адсорбцией по 1000 клеток на лунку и культивировали в течение ночи. Сфероиды инкубировали в среде, содержащей флуоресцентные конъюгаты 4D5scFv-PE40, в течение 2 ч при 37°С. После этого сфероиды дважды промывали PBS и фиксировали 10% формалином, приготовленным на PBS, в течение 15 мин в темно те. Изображения сфероидов получали с помощью конфокального микроскопа Axio Observer Z1 LSM 710 NLO/Duo (Carl Zeiss, Германия) с объективом EC Plan-Neofluar 20×/0.50. Для возбуждения флуоресценции DyLight650 использовали гелий-неоновый лазер 633 нм. Сигнал регистрировали в диапазоне 643-735 нм. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Известно, что раковые клетки, в том числе ряд линий рака молочной железы человека, как правило, характеризуются высокой склонностью к образованию сфероидов в культуре [8-12]. Однако в ряде работ обнаружены сложности получения хорошо оформленных сфероидов клеток линии SKBR-3 в широком диапазоне условий культивирования, в том числе при включении в ростовую среду компонентов вне клеточного матрикса (Matrigel) или повышении ее вязкости за счет добавления метилцеллюлозы [9, 10]. Культивирование клеток SKBR-3 в различных условиях, препятствующих формированию монослойной культуры (рис. 1А), показало их существенное влияние на способность данной культуры клеток формировать сфероиды. При выращивании на агарозной подложке клетки формировали рыхлые агрегаты неправильной формы, сильно варьирующие по размеру, с неровными краями. Диаметр наиболее крупных агрегатов на 2-е сут после посадки клеток составлял 30-100 мкм и достигал 60-140 мкм в течение 8 дней культивирования (рис. 1Б). Более успешным оказалось использование низко адгезивного пластика. Уже через сутки культивирования в лунках круглодонного планшета формировалось по одному сфероиду, представляющему собой плотный округлый конгломерат клеток диаметром около 160-200 мкм с четко очерченной границей. К 8-му дню культивирования сфероиды достигали 250-560 мкм в диаметре (рис. 1В). На плоскодонных планшетах формировалось 20-30 сфероидов округлой формы, в большинстве с четкой ровной границей, размером 30-60 и 130-360 мкм на 2-й и 8-й дни культивирования соответственно (рис. 1Г). С учетом особенностей формирования трехмерных структур SKBR-3 в различных условиях культивирования оптимальным признано использование круглодонного планшета из пластика со сверхниз кой адсорбцией, который применяли в дальнейшем. Показано, что динамика роста сфероидов, полученных с помощью этого подхода, имеет сложный характер: начальная экспоненциальная фаза, в нашем эксперименте длившаяся около 10 дней, сменяется фазой замедления роста (рис. 2). Аналогичная зависимость, описываемая функцией Гомпертца, характеризует рост опухолей in vivo [13]. Замедление роста сфероида может быть связано с изменением соотношения различных популяций клеток по мере увеличения его размеров и все более затрудненного поступления кислорода и нутриентов в глубь сфероида: увеличением доли неделящихся (покоящихся) клеток и/или гибелью покоящихся клеток, сопровождающейся разрастанием некротического ядра [3, 14]. Одна из важных особенностей линии SKBR-3, использованной нами для получения сфероидов, - сверхэкспрессия рецептора HER2. Этот рецептор относится к семейству рецептора эпидермального фактора роста человека и является важным участником сети сигнальной трансдукции, контролирующей процессы пролиферации, дифференцировки, апоптоза клеток [15]. Высокий уровень экспрессии HER2, характерный для многих типов рака, и его роль в патогенезе опухолей делают данный рецептор перспективной мишенью для создания таргетных противоопухолевых препаратов [16, 17]. Многообещающими агентами для таргетной терапии считаются рекомбинантные иммунотоксины - белки слияния, содержащие функционально независимые направляющий и токсический модули. Направляющим модулем, обеспечивающим нацеленную доставку таких конструкций к опухолевым клеткам, служат фрагменты антитела или узнающие полипептиды неиммуноглобулиновой природы, а токсическое действие об условлено модифицированными природными белковыми токсинами различного происхождения [18]. Нами проанализировано влияние на рост полученных сфероидов созданного ранее рекомбинантного иммунотоксина 4D5scFv-PE40, содержащего HER2 специфичное антитело 4D5scFv в качестве направляющего модуля и 40 кДа фрагмент псевдомонадного экзотоксина А (PE40) в качестве токсического моду ля [6]. В присутствии 4D5scFv-PE40 в ростовой среде рост сфероидов значительно замедлялся (рис. 3). Эффект иммунотоксина на размер сфероидов имел дозозависимый характер (рис. 4). Полное ингибирование роста сфероидов было достигнуто при концентрациях иммунотоксина более 1 нМ (рис. 3, нижний ряд). При этом иммунотоксин влиял также на морфологию сфероидов: в отличие от контроля, уже на 2-е сут инкубации с иммунотоксином сфероиды разрыхлялись и теряли характерные очертания (рис. 3, нижний ряд). Известно, что плотная упаковка клеток в структуре сфероида обеспечивается повы шением экспрессии и накоплением на поверхности клеток белков межклеточных контактов, в частности кадгеринов [19, 20]. Поскольку токсический эффект псевдомонадного экзотоксина А проявляется бло кадой биосинтеза белка в клетках-мишенях [21], обнаруженный эффект иммунотоксина 4D5scFv-PE40 на морфологию сфероидов может быть обусловлен снижением количества белков клеточной адгезии в клетках. Сравнительный анализ цитотоксичности 4D5scFv- PE40 в отношении клеток SKBR-3 в монослое и в сфероидах методом МТТ показал значительную резистентность сфероидов к данному агенту. Так, эффект 4D5scFv-PE40 в отношении монослойной культуры проявлялся в диапазоне концентраций от 0.1 пМ до 0.1 нМ с IC50 около 0.8 пМ в результате 72-часовой инкубации (рис. 5, слева). Это хорошо согласуется с результатами, полученными ранее для другой HER2-сверхэкспрессирующей линии клеток, SKOV-3 [22]. В то же время жизнеспособность клеток в сфероидах практически не снижалась в аналогичных условиях. При увеличении длительности инкубации до 168 ч токсическое действие иммунотоксина 4D5scFv-PE40 наблюдали только при увеличении его концентрации до 1 нМ, а значение IC50 составило более 100 нМ (рис. 5, справа). Явление большей резистентности опухолей in vivo к терапевтическим агентам по сравнению с соответствующими опухолевыми клетками в культуре хорошо известно [23, 24]. Ранее нами был показан токсический эффект иммунотоксина 4D5scFv-PE40, взятого в пикомолярных концентрациях, на HER2-сверхэкспрессирующие клетки аденокарциномы яичника человека SKOV-kat в культуре, в то время как его активность in vivo в отношении ксенографт ной опухоли SKOV-kat проявлялась при введении в наномолярной концентрации [25]. Очевидно, что использование монослойной культуры опухолевых клеток не позволяет предсказать диапазон эффективных концентраций тестируемого агента в условиях организма. Резистентность, как правило, определяется совокупностью факторов различной природы, отражающих как свойства самой опухоли, так и фармакокинетику препарата. Один из таких факторов - недостаточное накопление препарата в опухоли в результате его плохого проникновения в опухолевую массу, что, в свою очередь, может быть вызвано высоким давлением интерстициальной жидкости, неравномерным расположением со судов в опухоли, многочисленными межклеточными контактами и/или присутствием элементов внеклеточного матрикса. Это имеет особенное значение в случае белковых препаратов, в частности, рекомбинантных иммунотоксинов, размер молекул которых (50-70 кДа) обусловливает, с одной стороны, не большое время циркуляции в кровотоке (20-30 мин), а с другой - медленную диффузию в ткани [26-28]. Для оценки глубины проникновения иммунотоксина в толщу сфероида мы получили конъюгаты 4D5scFv-PE40 с флуоресцентным красителем DyLight650. Показано, что в результате 2-часо вой инкубации 4D5scFv-PE40, меченный флуоресцентным красителем, проникает на глубину около 80-100 мкм (при диаметре сфероида 400-500 мкм), что соответствует нескольким поверхностным слоям клеток (рис. 6). Эти результаты согласуются с данными о проникновении Fab-фрагментов антител, размер которых лежит в том же диапазоне (около 50 кДа), в сфероиды рака толстой кишки человека [29]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, существенная разница в выраженности токсического действия иммунотокси на 4D5scFv-PE40 на сфероиды и монослой клеток SKBR-3 может во многом объясняться его неэффективным проникновением в глубь сфероида и воз действием только на клетки внешних слоев. В этом случае использование сфероидов, состоящих только из опухолевых клеток, позволяет оценить влияние непосредственно межклеточных контактов на эф фективность тестируемого препарата. В связи с этим мы полагаем, что полученная нами модель опухо левого сфероида может быть успешно использована при поиске путей повышения эффективности накопления противоопухолевых агентов в опухоли за счет одновременного воздействия на межклеточные контакты. Это представляет особый интерес для разработки и исследования HER2-специфичных агентов, поскольку рецептор HER2, как правило, скрыт белками клеточной адгезии и может быть не доступен для связывания с таргетным препаратом [30, 31]. Такое воздействие, в частности, возможно при использовании белков, действие которых направлено на плотные межклеточные контакты [32]. Указанный подход, предложенный несколько лет назад, показал свою эффективность при использовании полноразмерных терапевтических антител и, по-видимому, представляет интерес для развития таргетной противоопухолевой терапии.

Об авторах

И. В. Балалаева

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: irin-b@mail.ru
Россия

E. A. Соколова

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: irin-b@mail.ru
Россия

A. Д. Пужихина

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Email: irin-b@mail.ru
Россия

A. A. Брилкина

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Email: irin-b@mail.ru
Россия

С. M. Деев

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Национальный исследовательский Томский политехнический университет

Email: irin-b@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы