CaMKII участвует в вызванном холином торможении секреции ацетилхолина в моторных синапсах мыши

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Холин образуется в холинергических синапсах в результате гидролиза медиатора ацетилхолина (АХ) с помощью фермента ацетилхолинэстеразы. Наряду с обратным захватом в нервную терминаль для восполнения там синтеза АХ, холин играет важную роль в ауторегуляции секреции АХ по механизму обратной связи. Этот механизм реализуется благодаря способности холина избирательно активировать пресинаптические никотиновые холинорецепторы альфа7-типа (альфа7-нХР) [1]. Эти рецепторы широко представлены в центральных и периферических синапсах и известны не только своей способностью пропускать внутрь ионы натрия и кальция при активации холином и другими агонистами, деполяризуя мембрану, но и запускать разнообразные внутриклеточные каскады с участием ферментов и каналов [2]. Кроме того, недавно в молекуле альфа7-нХР нашли аминокислотный кластер, обеспечивающий их функциональное взаимодействие с G-белками. Это расширяет возможность работы альфа7-нХР не только как быстро десенситизируемых ионотропных рецепторов, но и как особых метаботропных рецепторов, осуществляющих длительную сигнализацию, приводящую к долговременным эффектам [3]. Таким образом, неоднозначность последствий активации пресинаптических альфа7-нХР в разных типах синапсов представляет малоизученную и актуальную проблему. Недавно мы установили, что в нервно-мышечных синапсах мыши холин (0.1 мМ) подавляет вызванный выброс АХ, и этот тормозной эффект сопровождается Са2+-зависимым выбросом депонированного Са2+ через рианодиновые рецепторы и далее - активацией Са2+-активируемых калиевых каналов SК-типа терминалей, что и приводит к торможению секреции АХ [4]. При этом оставалось не ясным, может ли в данном каскаде участвовать активность Са2+-зависимых ферментов, таких, как протеинкиназа С (PKC) и/или кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа типа II (CaMKII). В связи с этим целью данной работы было тестирование изменений секреции АХ в моторных синапсах мыши, вызываемых холином в сочетании с действием блокаторов кальмодулина и Са2+-зависимых ферментов - СаМKII и PKC. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах диафрагмальной мышцы (m. diaphragma - n. phrenicus) взрослых (P30) самцов мышей 129/Sv, полученных из Института нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАН, Москва, Россия. Всего было использовано 16 животных. Мышей умерщвляли посредством быстрого обезглавливания. Животных содержали в соответствии с Директивой 86/609/EEC по обращению человека с лабораторными животными, протокол был одобрен комиссией по биоэтике биологического факультета МГУ. Все эксперименты проводили при комнатной температуре 20-22°С. Использовали стандартный, ранее описанный нами протокол приготовления рассеченного нервно-мышечного препарата левой полудиафрагмы с диафрагмальным нервом [4]. Миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП) и вызванные раздражением диафрагмального нерва многоквантовые потенциалы концевой пластинки (ПКП) регистрировали с помощью внутриклеточных стеклянных микроэлектродов, заполненных 2.5 М КCl (сопротивление кончика микроэлектрода 15-20 МОм). Регистрации ПКП в каждом синапсе предшествовала регистрация МПКП в течение 100 с, затем стимулировали диафрагмальный нерв в режиме короткого ритмического залпа (50 стимулов длительностью 0.1 мс с частотой 50 Гц). Сигналы регистрировали с использованием усилителя Neuroprobe Amplifier Model 1600 (A-M Systems), сигналы на жесткий диск компьютера записывали с помощью аналого-цифрового преобразователя Е-154 с интерфейсом PowerGraph (L-Card). Данные затем обрабатывали в программе MiniAnalysis (Synaptosoft). В контроле регистрировали МПКП и ПКП от пяти и более разных синапсов, после чего в перфузионный раствор в определенном порядке добавляли исследуемые вещества, далее регистрировали активность разных синапсов на протяжении 1-1.5 ч. В каждой серии экспериментов использовали не менее трех нервно-мышечных препаратов. В работе использовали холин, хелеритрин (Sigma, США), W-7, KN-62 (Enzo Life Sciences, США). Оценивали амплитуду, временной ход МПКП и ПКП, частоту МПКП и квантовый состав ПКП (его рассчитывали как отношение средней корректированной на нелинейную суммацию амплитуды ПКП [5] к средней амплитуде МПКП). Статистическую значимость различий между выборками оценивали по t-критерию Стьюдента и критерию Манна- Уитни. Уровень значимости отличий между двумя выборками составлял 0.05 (n - количество исследованных синапсов). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Пресинаптическое действие холина, как и в предыдущей нашей работе [4], изучали при его концентрации 100 мкМ, близкой к имеющейся в синаптической щели при расщеплении АХ и незначительно превышающей EC50 для активации альфа7-нХР [6]. Холин не вызывал значимых изменений мембранного потенциала мышечных волокон, а также частоты генерации спонтанных МПКП. Средняя амплитуда МПКП на фоне действия холина (1.08 ± 0.09 мВ (n = 17)) также не изменялась значимо по сравнению с контролем (1.05 ± 0.08 мВ (n = 15), p > 0.05). При запуске коротких ритмических залпов (50 Гц, 1 с) наблюдали характерные изменения амплитуды и квантового состава ПКП по ходу залпа. Вслед за кратковременным облегчением передачи развивалась депрессия в виде снижения амплитуды ПКП по сравнению с первым в залпе, после чего амплитуда ПКП (и квантовый состав) устанавливается на постоянном сниженном уровне по сравнению с первым ПКП (рис. 1). При перерыве между залпами порядка 2 мин и более картина повторных залпов в отдельном синапсе или других тестируемых синапсах устойчиво воспроизводилась. Аппликация холина приводила к снижению амплитуды ПКП в залпе за счет снижения их квантового состава. Значения квантового состава ПКП под действием холина статистически значимо снижались по всему ходу залпа по сравнению с контролем до 64-71% (p < 0.05). При этом рисунок залпа в целом остался неизменным (рис. 1). Уменьшение амплитуды и квантового состава ПКП наблюдалось, начиная с 15-20 мин от начала воздействия холина, и сохранялось на сниженном уровне на протяжении всего времени аппликации холина (в течение 45-60 мин). Эффекты блокатора PKC хелеритрина Аппликация на мышцу блокатора PKC хелеритрина (4 мкМ) в течение 30-40 мин не вызывала значимых изменений характера залповой синаптической активности - ни квантовый состав ПКП по ходу залпа, ни сам рисунок залпа (начальное облегчение, последующая депрессия, фаза «плато») достоверно не изменялись под действием хелеритрина (р > 0.05). Более того, хелеритрин никак не повлиял и на тормозные эффекты холина в отношении квантового состава ПКП при залповой активности синапсов (рис. 2А). Отсюда следует, что и Са2+-сигналы, поступающие в терминаль при активации холином альфа7-нХР с последующим выбросом депонированного кальция, и возможная метаботропная сигнализация альфа7-нХР с участием Gq-белка, как показано на других объектах [3], не способны активировать PKC и вовлечь ее в торможение секреции АХ в моторных синапсах. Это согласуется с нашими и опубликованными данными, где показано, что в моторных терминалях активация PKC может запускаться входом кальция в терминаль через другие Са2+- входы, в частности, при работе Са2+-каналов L-типа, и соучаствовать в облегчении секреции АХ [7]. Эффекты блокатора кальмодулина W-7 Следующим шагом работы было исследование эффектов холина на фоне предварительного выключения регуляторной активности кальмодулина с помощью его ингибитора W-7 (10 мкМ). Блокатор кальмодулина не оказывал собственного действия на передачу и не влиял значимо на тормозной эффект холина в отношении вызванной секреции АХ, хотя тормозное действие холина в условиях ингибирования кальмодулина было менее выражено, чем при действии только холина (рис. 2Б). Эффекты блокатора CaMKII KN-62 В последней серии изучали возможную активацию и участие собственно CaMKII в тормозных эффектах холина. Для этого использовали избирательный блокатор CaMKII - KN-62 (3 мкМ). При перфузии нервно-мышечного препарата раствором, содержащим KN-62, в течение 30-40 мин мы не обнаружили значимых сдвигов ни амплитуды МПКП, ни изменений квантового состава ПКП по ходу коротких залпов. Так, амплитуда МПКП в контроле составляет 0.91 ± 0.05 мВ (n = 20), при действии KN-62 0.85 ± 0.04 мВ (n = 23, p > 0.05), а на фоне холина в присутствии KN-62 - 0.83 ± 0.06 мВ (n = 25). Однако на фоне действия KN-62 на моторные синапсы аппликация холина не вызвала достоверного снижения амплитуды и квантового состава ПКП в залпе по сравнению с контролем (рис. 3). Это показывает, что обнаруженное нами ранее подавление выброса АХ при действии холина на пресинаптические альфа7-нХР предполагает, наряду с другими процессами [4], активацию CaMKII и ее участие в торможении секреции медиатора. В настоящее время в терминалях центральных и периферических синапсов выявлена активация пресинаптической CaMKII как за счет входов наружного [8], так и выброса внутриклеточного кальция [9], и возможность ее разнонаправленного влияния на секрецию медиаторов и комедиаторов [9, 10]. При активации альфа7-нХР эндогенным либо экзогенным холином в синапсах ЦНС наблюдается модуляция вызванного выброса медиатора. Недавно в синапсах гиппокампа описана генерация кальциевого сигнала при воздействии холина на пресинаптические альфа7-нХР, приводящая к возрастанию амплитуды возбуждающих постсинаптических потенциалов, однако эти эффекты не сопровождались активацией CaMKII и сохранялись в присутствии блокатора KN- 62 [11]. Ранее нами впервые было показано, что в периферических синапсах мыши активация альфа7- нХР холином приводит к торможению вызванной секреции медиатора АХ, и это торможение можно полностью предотвратить блокированием рианодиновых рецепторов или SK-каналов [4]. Настоящая работа существенно дополняет эти представления. Оказалось, что в механизмах ауторегуляции секреции АХ с участием холина и альфа7-нХР участвует также и CaMKII. Выявленная нами вовлеченность СaMKII в ауторегуляцию секреции АХ позволяет добавить эту киназу к уже описанной совокупности ферментов, способных по-разному участвовать в передаче сигнала при активации альфа7-нХР в разных типах клеток [3, 11]. Таким образом, при исследовании роли альфа7-нХР в регуляции клеточных процессов необходимо учитывать возможность активации CaMKII. До сих пор единственным примером участия CaMKII в работе нервно-мышечных синапсов грызунов была обнаруженная нами недавно активация и вклад фермента в усиление секреции АХ при входе кальция по L-типу кальциевых каналов [12]. В данной работе впервые описан качественно отличный способ активации и участия CaMKII в работе терминалей, когда активация альфа7-нХР сопровождается вовлечением CaMKII в торможение секреции АХ. Роль популяции СaMKII, расположенной в непосредственной близости от альфа7-нХР и внутритерминальных кальциевых депо, может заключаться в усилении и продлении обеспечиваемого работой рианодиновых рецепторов кальциевого сигнала, необходимого для активации калиевых каналов SK-типа. Таким образом, в моторных нервных терминалях мыши впервые выявлен каскад реакций, запускаемый действием холина на пресинаптические альфа7-нХР, приводящий к подавлению секреции АХ. Показано, что в этом каскаде задействованы не только выброс депонированного кальция и кальций-активируемые K+-каналы SK-типа, но и активность Са2+-зависимого фермента CaMKII.

Об авторах

A. E. Гайдуков

Автор, ответственный за переписку.
Email: gaydukov@gmail.com
Россия

O. П. Балезина

Email: gaydukov@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы