YABBY3-ортологи дикорастущих видов томата: структура, полиморфизм и экспрессия

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Все процессы роста и развития растений контролируются факторами транскрипции, эволюция которых является одной из основных причин морфологического многообразия в растительном царстве [1-4]. В то время как происхождение цветка и репродуктивных органов связывают с дупликацией и изменениями генов семейства MADS-факторов транскрипции [5, 6], возникновение плоского листа из радиально-симметричного стебля и разнообразие форм гинецея считают следствием эволюции генов, кодирующих факторы транскрипции семейства YABBY [7]. Присутствие этих генов у покрытосеменных и голосеменных растений и их отсутствие у мхов и плаунов [8-10] предполагает происхождение генов YABBY от одного или двух предшественников в последнем общем предке семенных растений [10-12]. Диверсификация генов YABBY привела к возникновению отдельных членов семейства с уникальными функциями в развитии листьев, плодолистиков и семязачатков [8, 11, 13, 14]. Среди них гены YABBY2 и YABBY5, которые предположительно участвовали в эволюционной диверсификации морфологии столбика и тычиночной нити [15, 16]. Другие гены YABBY- семейства, INNER NO OUTER (INO) и CRABS CLAW (CRC), возникали, по-видимому, параллельно эволюции плодолистика и семязачатка в процессе модификации листоподобного репродуктивного спорофилла [11, 17]. У двудольных и однодольных растений гены YABBY играют сходные роли в развитии листа и подобных ему органов, обусловливая их абаксиально- адаксиальную асимметрию, разрастание пластинки и определение границ листа [4, 10, 18]. Помимо этого, гены YABBY вовлечены в процессы образования таких органов цветка, как нектарники, плодолистикии др. [19-21]. К настоящему времени механизм работы некоторых белков YABBY описан только у модельного растения Arabidopsis thaliana. Так показано, что YABBY1 (или FILAMENTOUS FLOWER, FIL), YABBY3 и YABBY5 совместно с другими компонентами транскрипционного комплекса поддерживают идентичность клеток адаксиальной поверхности листа, а также участвуют в инициации эмбриональной апикальной меристемы побега и ее постэмбриональном поддержании [22]. В активации экспрессии некоторых генов YABBY в нектарниках и плодолистиках принимают участие белки семейства MADS совместно с другими факторами [23]. В свою очередь, YABBY1 вместе с другими транскрипционными факторами контролирует пространственную активность MADS-генов и таким образом участвует в инициации закладки цветковых органов в правильном месте и количестве, определяя судьбу соответствующих клеток [24-26]. Гены YABBY кодируют небольшие белки (180-250 а.о.), состоящие из двух консервативных доменов [27, 28]. В N-концевой части белка находится мотив цинкового пальца Cys2Cys2-типа, а на С-конце расположен домен YABBY. Число генов YABBY в геномах растений варьирует. В геноме A. thaliana таких генов шесть, из которых четыре (YABBY1, YABBY2, YABBY3 и YABBY5) экспрессируются преимущественно в листьях и листоподобных органах (семядоли, чашелистики, лепестки, тычинки и плодолистики), а два других (CRC и INO) - в отдельных репродуктивных органах цветка [10, 23, 27]. У риса Oryza sativa идентифицировано восемь генов, при этом у двух из них (OsYABBY2 и OsYABBY7) выявлено по два транскрипта, образованных в результате альтернативного сплайсинга [29]. У томата овощного (Solanum lycopersicum), одной из основных овощных культур, идентифицировано девять генов семейства YABBY (YABBY1, YABBY2, YABBY3, YABBY5a, YABBY5b, CRCa, CRCb, FAS, INO) [30, 31]. S. lycopersicum вместе с 12 дикорастущими родственными видами составляют секцию Lycopersicon рода Solanum [32]. Виды томата сильно различаются по морфофизиологическим характеристикам, включая морфологию листа и цветка. В зависимости от строения репродуктивной системы виды томата делятся на само- и перекрестноопыляемые, при этом последние отличаются большим полиморфизмом, крупными цветками и выступающим рыльцем пестика [32]. Известно, что система репродукции, находящаяся в зависимости от морфофизиологии цветка, а также различия в структуре листа могут быть следствием различной активности факторов транскрипции YABBY [7]. В первую очередь, это касается белков группы YABBY1/YABBY3, которые экспрессируются практически во всех асимметричных наземных органах растения. Идентификация генов, ортологичных YABBY3, у дикорастущих видов томатов и оценка их полиморфизма стали целью данной работы. К настоящему времени полные последовательности гена YABBY3 известны только у двух видов томатов - S. lycopersicum и S. pennellii, а паттерны экспрессии этого гена определены только у S. lycopersicum [31] и S. pimpinellifolium [30]. Поэтому полученные нами данные, основанные на анализе большего количества видов томата, дополнят знания о генах YABBY и их возможных функциях. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Для работы был сформирован набор из 13 образцов 11 видов томатов из коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова (ВИР). Исследуемые виды отличались как системой скрещивания, так и морфологическими характеристиками плода (табл. 1). Растения выращивали из семян в теплице (8/16 ч - ночь/день; 23/28°C - ночь/день; интенсивность освещения - 300-400 мМ/м2). Геномную ДНК выделяли из листьев растений с помощью набора ZR-96 Plant/ Seed DNA Kit (Zymo research, Irvine, США). Спустя 5 недель после высадки растений в теплицу, как только началось формирование плодов, собирали одновременно с каждого растения образцы тканей листьев, молодых бутонов, открытых цветков и незрелых зеленых плодов в период с 9.00 до 12.00. Собранный материал немедленно замораживали и растирали в жидком азоте. Суммарную РНК выделяли с помощью набора RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Германия). кДНК синтезировали с использованием набора GoScript (Promega, Madison, США). На основе полных нуклеотидных последовательностей гена YABBY3 S. lycopersicum (GeneID:101247051) и S. pennellii (GeneID:107026918) были разработаны специфичные праймеры sYB3F 5'-AATCAAATCAATCACAAAARCAG-3' и sYB3R 5'-CACATTAATTGGTTAGACACTTA-3' для амплификации полноразмерных копий этого гена у исследуемых видов. Для секвенирования также были разработаны дополнительные внутренние праймеры sYB3ex2R 5'-ATTAGTGCAGTGTCCACATC-3' и sYB3ex4R 5'-TTGATGAATCGGTTGTAAGC-3'. Гены амплифицировали с использованием полимеразы LongAmp® Hot Start Taq DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, США) в следующих условиях: исходная денатурация (10 мин, 94°C); 35 циклов денатурации (30 с, 94°C), отжига (30 с, 58°C) и синтеза (4 мин, 65°C); завершающий синтез (10 мин, 65°C). ПЦР-фрагменты очищали с помощью QIAEX® II Gel Extraction kit (QIAGEN, Hilden, Германия), клонировали в плазмидный вектор pGEMT-easy (Promega, Madison, США) и секвенировали с использованием систем BigDye и Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Waltham, США; ЦКП Биоинженерия). Полученные последовательности выравнивали и анализировали с помощью программы MEGA 7.0 [33]. Для сравнительного анализа использовали известные полные последовательности гена YABBY3 двух видов томата (S. lycopersicum cv. Heinz (GeneID:101247051) и S. pennellii (GeneID:107026918)), картофеля S. tuberosum (GeneID:102577797) и A. thaliana (GeneID: 827914). Положение нуклеотидных и аминокислотных замен определяли относительно последовательности S. lycopersicum cv. Heinz (GeneID:101247051). Структурные домены ортологов YABBY3 определяли с помощью программы NCBI-CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi) и опубликованных данных [27, 28]. Для филогенетического анализа использовали известные последовательности генов, кДНК и белков семейства YABBY S. lycopersicum (SlYABBY1 (XM_004229745), SlYABBY2 (XM_004241308), SlYABBY3 (XM_004245689), SlYABBY5a (XM_004242730), SlYABBY5b (XM_004251674), SlFAS (NM_001247461), SlINO (XM_004239291), SlCRCa (XM_004238984), SlCRCb (XM_004228801)) и A. thaliana (AtYABBY1 (AF136538), AtYABBY2 (AF136539), AtYABBY3 (AF136540), AtYABBY5 (NM_179750), AtINO (AF195047), AtCRC (AF132606)). Анализ проводили с использованием пакета программ MEGA 7.0 методом Maximum Likelihood (ML), модели подбирали с помощью программы Modeltest. Возможное влияние аминокислотных замен на структуру и функции белков оценивали с помощью матрицы Грэнтсема [34] и программы PROVEAN [35]. Трехмерную структуру белков анализировали с использованием программы Phyre2 [36] и визуализировали посредством Chimera-1.11.2 (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/). Экспрессию генов, ортологичных YABBY3, определяли в молодых листьях, молодых бутонах, открытых цветках и зеленых незрелых плодах методом количественной ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) с использованием набора «Реакционная смесь для проведения РВ-ПЦР в присутствии SYBR GreenI и ROX» (ООО «Синтол», Москва, Россия) на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, США). Для проведения РВ-ПЦР использовали праймеры tY3rt1F 5'-GTCACACTTACTTCTCTCCTTCAC-3' и tY3rtR 5'-CAGGAGGTCTGTTAACAACGG-3'. Реакции проводили в двух биологических и трех технических повторах в следующих условиях: 95°C - 5 мин; 40 циклов (95°C - 15 с, 62°C - 50 с). Уровень относительной экспрессии оценивали с использованием гена CAC в качестве референсного [37]. Статистический анализ, включая оценку статистической значимости различий экспрессии в различных органах каждого исследуемого вида томата методом t-теста с коррекцией Велча (Unpaired t-test with Welch’s correction) (табл. 3), проводили с помощью программы GraphPad Prism v. 7.02. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Полные последовательности генов, ортологичных YABBY3, определены у 13 образцов 11 видов томата (род Solanum секция Lycopersicon). Сравнительный анализ этих последовательностей выявил их высокую гомологию (идентичность 95-99%) с известным геном YABBY3 томата (ID: 101247051). Общая длина гена варьировала от 2622 п.н. у S. neorickii до 2713 п.н. у S. cheesmaniae. Гены состояли из семи экзонов и шести интронов (табл. 2) и содержали участки, кодирующие консервативные HMG-подобный домен YABBY (125-176 а.о.) и домен цинкового пальца Cys2Cys2-типа (18-62 а.о.) (рис. 1). Размер кДНК YABBY3 в девяти анализируемых образцах, включая все красноплодные и три зеленоплодных (S. chmielewskii, S. chilense, S. habrochaites) вида, составил 651 п.н. (табл. 2). У S. neorickii размер кДНК составил 654 п.н., что обусловлено дупликацией TCA во втором экзоне (вставка в аминокислотной последовательности N66_H67insH). У S. arcanum, S. corneliomulleri, S. peruvianum и S. peruvianum var. dentatum - 660 п.н., благодаря вставке 9 п.н. в первом экзоне (P17_S18insPPP). У S. pennellii, который считается наиболее древним видом [32], размер кДНК 645 п.н. обусловлен делецией 6 п.н. во втором экзоне (H67del, H68del). В соответствии с этим длина аминокислотных последовательностей ортологов YABBY3 составила 217 а.о. (S. neorickii), 219 а.о. (S. arcanum, S. corneliomulleri, S. peruvianum и S. peruvianum var. dentatum) и 216 а.о. (остальные образцы). Интересно, что из ранее описанных консервативных мотивов, характерных для белков YABBY1/3, у ортологов YABBY3 видов рода Solanum присутствуют кладоспецифичные мотивы FIL-A, -D, -E, -F и -G, но отсутствуют FIL-B и -C, обычно локализованные в междоменной области [12] (рис. 1). В сравнении с ранее охарактеризованным YABBY3 сорта Heinz S. lycopersicum (ID: 101247051) в генах YABBY3 исследуемых образцов выявлено 317 вариабельных сайтов, большей частью локализованных в интронах. В экзонах выявлены 24 замены, из которых восемь несинонимичные. Обнаруженные в кДНК замены локализуются преимущественно в последовательности, кодирующей междоменную область, и на 3'-конце. В области, кодирующей домен цинкового пальца, идентифицирована единственная замена - транзиция A59G у S. galapagense, которая приводит к замещению глутамина на аргинин Q20R (рис. 1). В последовательности, кодирующей YABBY- домен, выявлено пять нуклеотидных замен, из которых только транзиция A434G у S. peruvianum var. dentatum (3966) приводит к замещению глутаминовой кислоты на глицин E145G (рис. 1). В белках YABBY3 из 11 замещений аминокислотных остатков (рис. 1) четыре (S64C, Y76C, D116G, E145G) признаны радикальными (значения физико-химической дистанции по матрице Грэнтсема < 57.9). В то же время оценка, проведенная в программе PROVEAN, обобщающей известные алгоритмы оценки аминокислотных замен и инделей, определила как радикальную только одну замену (E145G в YABBY-домене у S. peruvianum var. dentatum), тогда как остальные замены, делеции и вставки определены как нейтральные. Исследование влияния замен на функцию белков нуждается в дополнительном экспериментальном анализе. Моделирование (Phyre2) трехмерной структуры ортологов YABBY3 выявило неупорядоченную организацию более 60% последовательности, в то время как 29% было предсказано с достоверностью более 90% на основе известных структур белков, содержащих HMG-домен (PDB: d1qrva, d1k99a и др.). Достоверно предсказанная последовательность представляла собой домен YABBY, гомологичный домену HMG [10], состоящий из двух α-спиралей, соединенных петлей (helix-loop-helix) (рис. 2). HMG-домен предположительно связывается с малой бороздкой ДНК и изгибает двойную спираль в этой точке [38]. Проведенный филогенетический анализ показал, что все известные гены семейства YABBY S. lycopersicum кластеризуются с соответствующими ортологами A. thaliana (рис. 3). На дендрограмме, построенной по кДНК, гены YABBY формировали четыре субкластера: YAB1/3 (гены YABBY1 и YABBY3); YAB2/5 (YABBY2, YABBY5 и FAS); CRC (гены CRC); INO (гены INO) (рис. 3А). Кластеры, образованные в результате анализа аминокислотных последовательностей (рис. 3Б), были аналогичны вышеописанным, за исключением YABBY2 и YABBY5, которые формировали отдельные субкластеры, что соответствует предложенному ранее разделению семейства YABBY на пять подсемейств [10, 23]. Филогенетический анализ, основанный на геномных последовательностях YABBY3, разделил анализируемые образцы видов томата на два кластера с ответвлением наиболее древнего вида S. pennellii и картофеля S. tuberosum (рис. 4). Результаты в целом находятся в согласии с разделением томатов как на зеленоплодные и красноплодные, так и на само- и перекрестноопыляемые виды. При этом два зеленоплодных самоопыляемых вида S. chmielewskii и S. neorickii попадают в противоположные кластеры, соответствуя, видимо, эволюционно- пограничной точке происхождения красноплодных самоопыляемых видов из зеленоплодных перекрестноопыляемых. Данные экспрессии генов YABBY покрытосеменных предполагают, что гены YABBY1/3 сохранили древний паттерн экспрессии [12], транскрибируясь в абаксиальной части примордиев всех наземных боковых органов (за исключением семязачатков) [25, 41]. Это подтверждается и полученными данными, отражающими экспрессию гена YABBY3 в вегетативных и генеративных органах S. chmielewskii, S. lycopersicum cv. Silvestre recordo, S. habrochaites и S. peruvianum var. dentatum. У S. habrochaites экспрессия гена в листьях несколько выше, чем в цветках, а у остальных трех видов отсутствуют статистически значимые различия в уровнях экспрессии в цветках и листьях (рис. 5, табл. 3). При этом у исследуемых видов, кроме S. peruvianum var. dentatum, ген YABBY3 в плодах практически не экспрессируется (рис. 5). Данные четыре вида были выбраны для анализа экспрессии в силу их принадлежности к четырем эволюционно отдаленным друг от друга группам. S. lycopersicum является красноплодным, самоопыляемым видом относительно недавнего происхождения; S. chmielewskii - зеленоплодный, но самоопыляемый - на эволюционной лестнице стоит между красноплодными самоопыляемыми и зеленоплодными перекрестноопыляемыми видами; S. peruvianum - представитель зеленоплодных перекрестноопыляемых видов; и, наконец, S. habrochaites (зеленоплодный перекрестноопыляемый) считается одним из наиболее древних видов томата [32]. Паттерн экспрессии YABBY3 S. peruvianum var. dentatum несколько отличался от паттерна у остальных анализируемых образцов, хотя причина низкого уровня экспрессии в бутоне не совсем ясна (рис. 5). У S. habrochaites динамика экспрессии аналогична динамике у S. lycopersicum и S. chmielewskii, однако уровень транскрипции во всех анализируемых органах почти в 2 раза ниже. В целом, выявленные паттерны экспрессии YABBY3 у S. lycopersicum, S. chmielewskii и S. habrochaites совпадают с таковыми у S. pimpinellifolium, где максимальный уровень экспрессии YABBY3 наблюдается в молодых бутонах и снижается по мере развития цветка и плода [30]. Показано, что у A. thaliana как конститутивная экспрессия гена YABBY3, так и ее выключение приводят к аномальному развитию листьев и цветков из-за потери полярной дифференцировки органов [18]. Вариабельность уровня экспрессии этого гена также может отражаться на строении и морфофизиологии органов, в частности, листьев, цветков и плодов анализируемых образцов томата. Значимый уровень экспрессии гена в плодах S. peruvianum var. dentatum может указывать на вероятное сохранение идентичности абаксиальной ткани в оболочке плода. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной работе в 13 образцах культивируемых и дикорастущих видов томата идентифицированы гены, ортологичные YABBY3. Эти гены кодируют факторы транскрипции, которые играют одну из ключевых ролей в определении абаксиально-адаксиальной асимметрии всех наземных латеральных органов растения. Структура генов YABBY3 и кодируемых ими белков сходна с ранее охарактеризованными членами семейства YABBY. Филогенетический и экспрессионный анализ подтвердил, что идентифицированные гены относятся к подсемейству YABBY1/3 и, возможно, имеют консервативные функции в различных видах томата.

Об авторах

M. A. Филюшин

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: michel7753@mail.ru
Россия

M. A. Слугина

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: michel7753@mail.ru
Россия

A. В. Щенникова

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: michel7753@mail.ru
Россия

E. З. Кочиева

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: michel7753@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы