Антибактериальное действие тиосульфинатов на мультирезистентные штаммы бактерий, выделенные от больных муковисцидозом

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Разработка новых подходов к созданию эффективных антибактериальных препаратов актуальна изза широкого распространения антибиотикорезистентных штаммов бактерий. Мультирезистентные микроорганизмы вызывают внутрибольничные инфекции, которые могут быть причиной осложнений у ослабленных больных. Серьезную проблему представляет хроническая легочная инфекция у больных муковисцидозом, вызванная ассоциацией таких возбудителей, как Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia complex и др. [1], при которой под воздействием длительной антибиотикотерапии происходит формирование мультирезистентных штаммов микроорганизмов, что обуславливает неэффективность терапии антибиотиками. Тиосульфинаты, обнаруженные в растениях рода Allium, обладают антимикробным действием [2]. Антибактериальный эффект аллицина, основного тиосульфината чеснока, обусловлен сочетанием снижения уровня клеточного глутатиона и инактивации ключевых метаболических ферментов вследствие модификации их тиоловых групп [3, 4]. Поскольку аллицин, окисляющий тиоловые группы ферментов и белков, имеет много мишеней в клетке, аллицин и другие тиосульфинаты, скорее всего, не должны вызывать резистентность [5]. В растениях рода Allium аллииназа [КФ 4.4.1.4] катализирует разложение сульфоксидов S-замещенных аналогов L-цистеина с образованием тиосульфинатов. Нами показано, что тиосульфинаты могут быть получены при помощи метионин-γлиазы (МГЛ, [КФ 4.4.1.11]) (схема). Тиосульфинаты, образующиеся при расщеплении сульфоксидов S-аллил-L-цистеина, S-метил-L-цистеина и S-этил-L-цистеина, катализируемом как МГЛ дикого типа, так и ее более эффективной мутантной формой С115Н, ингибируют рост грамположительных и грамотрицательных бактерий [6], в том числе P. aeruginosa, выделенной из кишечника мышей [7]. Целью данной работы было исследование антибактериального действия тиосульфинатов, полученных в реакции β-элиминирования трех сульфоксидов S-замещенных аналогов L-цистеина (схема), катализируемой С115Н МГЛ, на мультирезистентные штаммы грамотрицательных бактерий Achromobacter ruhlandii 155В, B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В, выделенных от больных муковисцидозом. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Выделение фермента, определение его активности, синтез сульфоксидов S-замещенных аналогов L-цистеина и получение тиосульфинатов проводили как описано ранее [6]. Концентрацию тиосульфинатов определяли согласно [8]. Антибактериальную активность тиосульфинатов определяли методом двукратных серийных разведений и методом диффузии в агаре. При определении антибактериальной активности тиосульфинатов методом двукратных серийных разведений [9] использовали бульон Мюллера-Хинтона и разведение культур штаммов 105 КОЕ/мл с добавлением препаратов в концентрациях от 1 до 0.0039 мг/мл с последующим высевом на плотную питательную среду (среда № 1 для P. aeruginosa 48В и кровяной агар для A. ruhlandii 155В и B. cenocepacia 122). Антибактериальную активность препаратов на твердой среде определяли при концентрации от 2 до 0.05 мг/мл путем высева из разведений культур штаммов от 104 до 107 КОЕ/мл на агар Мюллера-Хинтона диско-диффузионным методом и методом непосредственного нанесения исследуемых образцов в объеме 10 мкл. Резистентность штаммов к действию стандартных антибиотиков, назначаемых при муковисцидозе, определяли методом серийных разведений согласно клиническим рекомендациям о пограничных значениях МПК для каждого антибиотика [10]. Антибактериальную эффективность тиосульфинатов и антибиотиков сравнивали, используя диско-диффузионный метод при высеве из разведений культур штаммов 106 КОЕ/мл на агар Мюллера-Хинтона. Время инкубации культур на твердой питательной среде во всех экспериментах составляло 24-48 ч. В работе использовались штаммы A. ruhlandii 155В, B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В из коллекции культур лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций, НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ, выделенные от больных муковисцидозом. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Определяли антибактериальную активность аллицина, диметил- и дипропилтиосульфинатов против штаммов A. ruhlandii 155В, B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В, выделенных от больных муковисцидозом (табл. 1). Выявлены различия в характере и степени выраженности антимикробного действия тиосульфинатов. Наиболее активными в отношении B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В оказались аллицин и диметилтиосульфинат, дипропилтиосульфинат был менее активным. Величины МПК и МБК тиосульфинатов при действии на B. cenocepacia оказались равными или близкими, что свидетельствует о бактерицидном действии этих двух соединений. Значение МПК аллицина лежит в диапазоне, полученном для коммерческого аллицина против нескольких штаммов B. cepacia complex (0.008-0.062 мг/мл) [11]. На штамм P. aeruginosa 48В тиосульфинаты оказывают бактериостатическое действие, поскольку в исследуемом диапазоне концентраций тиосульфинатов значение МБК (1 мг/мл) определяется только для аллицина. Значения МПК и МБК аллицина для штамма P. aeruginosa 48В соответствуют величинам МПК (0.064-0.512 мг/мл) и МБК (0.128-1.024 мг/мл) аллицина против трех клинических штаммов P. aeruginosa [12]. Антибактериальное действие тиосульфинатов на штамм A. ruhlandii 155В было наименее значимым. Значения МПК, полученные в опыте по определению антибактериальной активности на твердой питательной среде диско-диффузионным методом (табл. 1), составили 2 мг/мл для диметил- и дипропилтиосульфинатов, что превышало максимальную концентрацию, используемую в методе серийных разведений. Наиболее эффективным против A. ruhlandii 155В оказался аллицин, обладающий бактерицидным действием в концентрации 1 мг/мл. Изменение антибактериальной эффективности тиосульфинатов определяли в зависимости от концентрации бактериальных клеток. Эксперимент был проведен диско-диффузионным методом (табл. 2) и методом нанесения образцов на твердую питательную среду. Результаты, полученные обоими методами, совпали. Тиосульфинаты в концентрации 2 мг/мл эффективно подавляют рост A. ruhlandii 155В и B. cenocepacia 122 при концентрации клеток до 107 КОЕ/мл включительно. Антибактериальное действие тиосульфинатов на P. aeruginosa 48B выражено слабо. Аллицин в максимальной концентрации незначительно подавляет рост P. aeruginosa 48B даже при минимальной концентрации клеток. Интересно, что среди тиосульфинатов только диметилтиосульфинат в концентрации 0.4 мг/мл (табл. 2) подавляет рост P. aeruginosa. Результаты, полученные для аллицина и диметилтиосульфината, хорошо соотносятся с данными для P. aeruginosa из кишечного тракта мышей [7]. Отсутствие зон задержки роста в опыте на твердой среде при низких концентрациях аллицина и диметилтиосульфината, вероятно, обусловлено медленной диффузией веществ в агар Мюллера-Хинтона. Таким образом, оптимальным методом определения антибактериальной активности исследуемых тиосульфинатов является метод серийных разведений. Резистентность штаммов A. ruhlandii 155В, B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В оценивали с использованием 17 антибиотиков, наиболее часто назначаемых при муковисцидозе (табл. 3). Штамм A. ruhlandii 155В оказался резистентным к 16 антибиотикам, штамм B. cenocepacia 122 - к шести, а P. aeruginosa 48В - к девяти антибиотикам. Полученные данные подтвердили формирование резистентности у этих штаммов после длительной антибиотикотерапии. Примечательно, что ни один из протестированных антибиотиков не оказывал антибактериального действия на все три бактериальных штамма. Мы сравнили эффективность антибактериального действия тиосульфинатов и антибиотиков широкого спектра действия, принадлежащих к трем различным группам, наиболее часто назначаемым при муковисцидозе: имипенема из группы карбапенемов, тобрамицина из группы аминогликозидов и ципрофлоксацина из группы фторхинолонов (табл. 4). Как и в случае двукратных серийных разведений, при определении антибактериальной активности диско-диффузионным методом на плотной питательной среде три штамма оказались резистентными к тобрамицину и ципрофлоксацину в стандартных концентрациях 10 мкг/диск. Диаметры зон ингибирования имипенема при действии на B. cenocepacia 122 и P. aeruginosa 48В сравнимы со значениями для диметилтиосульфината и незначительно больше зоны ингибирования B. cenocepacia 122 аллицином. Аллицин и диметилтиосульфинат подавляют рост A. ruhlandii 155В, в то время как к действию имипенема данный штамм резистентен. Полученные данные открывают возможность разработки препаратов для антибактериальной терапии хронической легочной инфекции у больных муковисцидозом.

Об авторах

В. В. Куликова

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvd@eimb.ru
Россия

M. Ю. Чернуха

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: tvd@eimb.ru
Россия

E. A. Морозова

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvd@eimb.ru
Россия

С. В. Ревтович

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvd@eimb.ru
Россия

A. Н. Родионов

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvd@eimb.ru
Россия

В. С. Коваль

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: tvd@eimb.ru
Россия

Л. Р. Аветисян

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: tvd@eimb.ru
Россия

Д. Г. Кулястова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: tvd@eimb.ru
Россия

И. A. Шагинян

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: tvd@eimb.ru
Россия

T. В. Демидкина

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: tvd@eimb.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы