Комплекс Tag7-Mts1 вызывает миграцию лимфоцитов, взаимодействуя с рецепторами CCR5 и CXCR3

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Для развития иммунного ответа необходимы, как минимум, два этапа: активация эффекторных лимфоцитов, способных убивать чужеродные клетки, и доставка их к очагу поражения. Поэтому для понимания процессов иммунной защиты следует иметь представление как о цитотоксических, так и о хемотаксических механизмах [1]. Важен также и поиск новых стимуляторов цитотоксичности и хемотаксичности. Цитокины, вызывающие миграцию лимфоцитов, именуются хемокинами. Одна из особенностей структуры хемокинов - две характерные дисульфидные связи. В зависимости от взаимного расположения первых двух N-концевых остатков цистеина хемокины делят на четыре класса (CC, C, CXC, CX3 C) [2]. Индукция хемотаксиса происходит через взаимодействие со специфическими хемотаксическими рецепторами. Эти рецепторы относятся к большой группе трансмембранных рецепторов, сопряженных с G-белком [3]. Взаимодействие хемокина с рецептором вызывает диссоциацию β-, γ-субъединиц G-белка, что приводит к активации каскада протеинкиназ и увеличению концентрации ионов Са2+ [4, 5]. Вторая структурная особенность хемокинов - их небольшая молекулярная масса (от 8-10 кДа) [6], но встречаются стимуляторы миграции лимфоцитов как с большей, так и с меньшей молекулярной массой [7]. Недавно мы показали, что миграцию лимфоцитов может вызывать комплекс из двух белков: Tag7 и Mts1 [8]. Mts1 (S100A4) принадлежит к семейству Са2+ связывающих белков. Известно, что он вовлечен в процесс метастазирования опухолевых клеток [9-12]. В то же время его ген активно экспрессируется в клетках иммунной системы, участвующих в противоопухолевой защите. Ранее мы показали, что Mts1 на поверхности CD4+ лимфоцитов участвует в узнавании HLA-отрицательных опухолевых клеток и способствует их лизису [13]. Белок Tag7 (PGLYRP1), ген которого был открыт в нашем институте, является белком системы врожденного иммунитета, участвующим как в антибактериальной, так и в противоопухолевой защите [14-16]. Подобно цитокинам, Tag7 способен активировать цитотоксичность лимфоцитов. В комплексе с основным белком теплового шока Tag7 оказывает цитотоксическое действие на TNFR1-несущие опухолевые клетки и тормозит рост опухоли [17, 18]. Он способен взаимодействовать с белком Mts1 с образованием стабильного хемоаттрактивного комплекса, вызывая миграцию лимфоцитов, при этом ни Mts1, ни Tag7, взятые по отдельности, такой активностью не обладают [8]. В связи с этим интересно выяснить, почему хемотаксическая активность появляется только после образования комплекса. Цель настоящего исследования состояла в выявлении рецепторов, индуцирующих миграцию клеток по градиенту концентрации Tag7-Mts1 и белка двухкомпонентного комплекса, способного взаимодействовать с этими рецепторами. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Белки Рекомбинантные белки Mts1 (S100A4) и Tag7 (PGLYRP1) экспрессировали в штамме Escherichia coli M15[pREP4] (Qiagen, США), содержащем плазмиду pQE-30 (Qiagen, США). В плазмиды pQE-30 ранее были клонированы кДНК белка Tag7 или Mts1. Mts1 очищали на Ni-NTA-агарозе (Qiagen, США) согласно протоколу производителя. Tag7 выделяли и очищали как описано в [19]. Сравнение первичных и пространственных структур белков проводили с использованием https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ и базы данных https:// ncbi.nlm.nih.gov/. Клеточные культуры В работе использовали мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), полученные из лейкомассы здоровых доноров последовательным центрифугированием в градиенте Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Швеция) как описано в [20]. Проточная цитофлуориметрия Клетки фиксировали в 4% формальдегиде (Sigma) и инкубировали с антителами к CCR5 и CXCR3 (Abcam, Великобритания) в течение ночи, а затем с антикроличьими IgG-PE (Beckman coulter, США) в темноте при 40 С в течение 2 ч. В каждой пробе анализировали не менее 104 клеток. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 MPL (Beckman coulter, США), данные обрабатывали в EXPO32 software (Applied Cytometry Systems, Sheffield, Великобритания). Анализ хемотаксической активности Для измерения хемотаксической активности использовали камеру Бойдена (Costar Corning Inc., США), в верхнюю часть которой добавляли 200×103 клеток РВМС, в нижнюю - хемоаттрактант в концентрации 10-9 М в среде RPMI 1640 (Gibco, США). Количество клеток, прошедших через мембрану, измеряли через 1.5 ч с помощью МТТ-теста (Sigma, США). В случае с преинкубацией антитела (в разведении 1 : 1000) или белки (Tag7, Mts1 в концентрации 10-8 M) добавляли к РВМС и инкубировали в течение 1 ч при 370 С, 5% СО2 , после чего дважды промывали средой. Все диаграммы, если не указано иначе, построены на основе не менее трех независимых экспериментов. Для статистической обработки использовали метод двусторонней ANOVA. Детекция хеморецепторов Клетки РВМС (~250 млн) суспендировали в 1.5 мл солюбилизационного буфера: 50 мМ Tрис, pH 7.5 с PMSF (Sigma, США) (1 мМ) и коктейлем ингибиторов протеаз (Calbiochem, Германия) в концентрации, указанной изготовителем, и детергентом Triton X-100 (Sigma, США) (1% по объему). После инкубации на качалке в течение 30 мин на льду полученную суспензию разводили в 10 раз, добавляя солюбилизационный буфер, не содержащий детергент, и центрифугировали при 185000 g (Beckman L7 Ultracentrifuge, США) в течение 1 ч при 4°C. Супернатант отбирали и наносили на BrCN-сефарозную колонку с конъюгированным Mts1. Связавшиеся белки разделяли с помощью 12% SDS-ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и детектировали методом вестерн-блотинга со специфическими антителами к CCR5 и CXCR3 (1 : 1000) и вторичными антикроличьими антителами (1 : 10000), конъюгированными с пероксидазой хрена, и проявляли с помощью набора ECL Plus (Amersham, Великобритания) согласно рекомендациям производителя. РЕЗУЛЬТАТЫ Хемотаксические рецепторы CCR5 и CXCR3 индуцируют движение лимфоцитов по градиенту концентрации комплекса Tag7-Mts1 На первом этапе исследования мы выявляли рецепторы, участвующие в передаче хемотаксического сигнала от описанного нами нового хемокина - Tag7-Mts1-комплекса. Ранее мы показали, что под действием этого комплекса могут направленно двигаться Т-лимфоциты и NK-клетки [8]. Поэтому мы оценивали присутствие на РВМС хемотаксических рецепторов CCR5 и CXCR3, наиболее высоко представленных на поверхности Т-лимфоцитов и NK-клеток. С помощью проточной цитофлуориметрии и высокоспецифичных антител мы показали, что исследуемые популяции РВМС содержат 54.8% клеток, несущих на поверхности рецептор CCR5, а клетки, экспрессирующие CXCR3, составляют 58.1% от общей популяции РВМС, т.е. оба рецептора присутствуют на РВМС (рис. 1А). Далее мы проверяли, участвуют ли эти рецепторы в индукции миграции лимфоцитов по градиенту концентрации комплекса Tag7-Mts1. С этой целью РВМС инкубировали с антителами к CCR5 или CXCR3 и исследовали движение этих клеток под действием комплекса Tag7-Mts1 (рис. 1Б). Можно видеть, что, в отличие от белков Tag7 и Mts1, взятых по отдельности, комплекс Tag7-Mts1 вызывает движение РВМС. Преинкубация с антителами к CCR5 практически полностью блокирует хемотаксис. В то же время антитела к CXCR3 снижали миграцию РВМС не более чем на 20%. Таким образом, оба исследуемых рецептора способны индуцировать движение клеток по градиенту концентрации комплекса Tag7-Mts1, но обладают различным сродством к этому комплексу. Учитывая более сильное ингибирование движения клеток антителами к CCR5, можно предположить, что пространственная структура функциональных участков комплекса Tag7-Mts1, участвующих во взаимодействии с CCR5, больше похожа на пространственную структуру участков CC-хемокинов - лигандов рецептора CCR5, обеспечивающих взаимодействие в комплексе. Mts1 может связываться с хемотаксическими рецепторами Далее мы определяли, какой из белков двухкомпонентного комплекса может взаимодействовать с рецепторами. Мы предварительно инкубировали РВМС с Tag7 или с Mts1 и исследовали миграцию таких клеток под действием комплекса Tag7-Mts1. На рис. 2А представлены результаты пяти независимых экспериментов без усреднения. Можно видеть, что в четырех случаях инкубация с Tag7 практически не влияет на подвижность клеток, а предварительная инкубация с Mts1 резко снижает движение РВМС. Наблюдаемые отклонения, возможно, зависят от иммунного статуса донора. Совпадение исследуемых эффектов в четырех случаях позволяет предположить, что Mts1 может связываться с рецептором. Для проверки этого предположения мы изучили возможность связывания CCR5 и CXCR3 с Mts1 с помощью аффинной хроматографии. На колонку с Mts1, иммобилизированным на Br-CN-сефарозе, наносили солюбилизированные мембранные белки РВМС, специфически связавшийся материал анализировали с помощью 12% SDS-ПААГ с последующим вестерн-блотингом (рис. 2Б). Антитела к CCR5 выявили белок 41 кДа, а антитела к CXCR3 - белок с 70 кДа, соответствующие по молекулярной массе этим рецепторам. Можно видеть более слабое связывание CXCR3 с Mts1, что подтверждает предположения о более высоком сродстве хемоаттрактивного комплекса Tag7-Mts1 к рецептору CCR5. Таким образом, Mts1 может связываться с CCR5 рецептором, но этого недостаточно для индукции движения клеток. Однако, взаимодействуя с CCR5, он препятствует связыванию с ним двухкомпонентного хемоаттрактанта и ингибирует движение клеток по градиенту концентрации комплекса Tag7-Mts1. Первичная и пространственная структуры фрагментов Tag7 и Mts1 имеют частичную гомологию со структурами фрагментов MIP1α Как уже сказано, ни один из белков комплекса Tag7-Mts1 не обладает стандартной для хемокинов структурой, называемой «греческий ключ». Поэтому мы сравнивали первичные и пространственные структуры белков Mts1, Tag7 и MIP1α, известного функционального лиганда рецептора CCR5. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей трех белков обнаружил гомологию фрагментов молекул Mts1 и Tag7 с некоторыми участками MIP1α. На рис. 3 слева вверху представлен результат сравнения фрагментов аминокислотных последовательностей. Mts1 имеет в С-концевой части 11-членный фрагмент (аминокислотные остатки 79-89), на 65% гомологичный 11-членному N-концевому фрагменту MIP1α (аминокислотные остатки 11-21). В центральной части молекулы Tag7 расположен 17-членный фрагмент (аминокислотные остатки 164-180), гомологичный фрагменту MIP1α (аминокислотные остатки 45-61), также расположенному в середине полипептидной цепи. На рис. 3 представлены пространственные структуры комплекса MIP1α с CCR5 [21] и пространственные структуры Tag7 [19] и Mts1 [22], координаты пространственных структур PDB ID: 5UIW, 1YCK, 3C1V соответственно. При сравнении пространственных структур белков Mts1 и Tag7 со структурой MIP1α видно, что C-концевой участок Mts1 (аминокислотные остатки 79-89) представляет собой α-спираль, выступающую из центральной глобулярной части молекулы. У хемокина MIP1α N-концевой участок (аминокислотные остатки 11-21) также далеко выступает из центральной части молекулы. Оба эти участка имеют по пять гидрофобных аминокислот. Фрагменты Tag7 (аминокислотные остатки 164-180) и MIP1α (аминокислотные остатки 45-61) представляют собой β-листы, в обоих белках находящиеся на поверхности молекул. Гомологичные аминокислоты (остатки 164-166 и 179-180) расположены в области, которая у MIP1α (остатки 45-47 и 60-61) участвует в непосредственном взаимодействии с рецептором CCR5. Ни один из белков комплекса Tag7-Mts1 не обладает пространственной структурой хемокина, однако, Mts1 и Tag7 содержат участки, гомологичные по своей аминокислотной и пространственной структурам участкам хемокина MIP1α, важным для активации рецептора CCR5. Возможно, в этом состоит причина того, что отдельно взятые Tag7 и Mts1 не обладают хемоаттрактантной активностью, и только стабильный двухкомпонентный комплекс этих белков способен инициировать миграцию лимфоцитов. ОБСУЖДЕНИЕ Представленные данные позволяют сделать два заключения. Хемотаксические рецепторы CCR5 и CXCR3 участвуют в индукции миграции РВМС по градиенту концентрации комплекса Tag7-Mts1. Один из компонентов этого комплекса - белок Mts1 - может связываться с обоими рецепторами. Следует отметить различную специфичность связывания комплекса Tag7-Mts1 с этими рецепторами. Исследуемый комплекс довольно слабо взаимодействует с рецептором CXCR3: не более 20% CXCR3 содержащих РВМС мигрируют по градиенту концентрации Tag7-Mts1. В то же время практически все популяции РВМС, несущие CCR5, могут двигаться под действием этого хемоаттрактанта. CCR5 присутствует, как правило, на клетках памяти, макрофагах и дендритных клетках. Недавно было показано, что он представлен на клеточной поверхности субпопуляций NK-клеток [23]. Исходя из набора клеток, несущих CCR5, можно предполагать, что комплекс Tag7-Mts1 может привлекать клетки иммунной системы в основном на ранних стадиях иммунного ответа. Нами показано, что предварительная инкубация клеток с белком Tag7 не ингибирует миграцию клеток под действием комплекса Tag7-Mts1. Возможно, Tag7 взаимодействует с хемотаксическим рецептором намного слабее, чем комплекс Tag7-Mts1. Tag7 не содержит также в полипептидной цепи гидрофобного фрагмента, способного связываться с трансмембранным активным центром рецептора. Mts1, напротив, может связываться с рецептором CCR5 и ингибировать движение РВМС, хотя и не обнаружено сходства в аминокислотных и пространственных структурах центрального участка молекул Mts1 и MIP1α. Механизм такого связывания требует дальнейшего исследования [19, 21, 22]. Аналогичные результаты получены нами недавно при исследовании взаимодействия цитотоксического комплекса Tag7-Hsp70 с рецептором известного цитокина TNFα - TNFR1. Tag7 связывался с TNFR1 и ингибировал цитотоксическое действие TNFα [24], но не обладал гомологией первичной и трехмерной структур с TNFα. Детальное изучение механизма взаимодействия CCR5 с лигандом позволило предложить гипотетическую схему контактов этого рецептора с лигандами [25]. Согласно этой схеме, взаимодействие хемокинового рецептора с лигандом - двухстадийный процесс. На первой стадии центральная часть молекулы хемокина взаимодействует со связывающим центром рецептора, расположенным на внеклеточном домене. Далее для активации рецептора необходимо взаимодействие N-концевого участка хемокина со вторым участком связывания, расположенным в пучке трансмембранных спиралей. Интересно, что сам Mts1 не может индуцировать миграцию клеток, хотя имеет гидрофобный фрагмент (аминокислотные остатки 79-89), гомологичный фрагменту MIP1α (аминокислотные остатки 11-21), индуцирующему изменение конформации рецептора. Учитывая различия в пространственной структуре Mts1 и в структуре классического хемокина, можно предположить, что после связывания с внеклеточным доменом на первой стадии взаимодействия Mts1 с рецептором CCR5 С-концевой фрагмент Mts1 не может проникнуть в мембрану клетки [22]. Взаимодействие с Tag7 изменяет, возможно, конформацию Mts1, обеспечивая доступ С-концевого участка к активному центру в трансмембранном пучке. Такая гипотетическая схема может объяснить, почему только комплекс Tag7-Mts1 способен вызывать миграцию РВМС. По-видимому, двухстадийное взаимодействие лигандов с рецепторами является общим свойством рецепторов различной природы. Сначала лиганд фиксируется на поверхности рецептора, затем происходит его активация. Ранее мы изучали взаимодействие двухкомпонентного комплекса Tag7-Hsp70 с рецептором TNFR1 и выявили функциональную активность каждого белка. Мы показали, что Tag7 может связываться с TNFR1, но не способен вызвать агрегацию его цитоплазматических доменов, необходимую для индукции цитолиза. Hsp70, способный агрегировать в растворе, связывается с Tag7 и вызывает тримеризацию рецептора. Не исключено, что Mts1 может связываться и с другими рецепторами на поверхности Т-лимфоцитов и NK-клеток и в комплексе с Tag7 индуцировать миграцию этих клеток. Однако этот вопрос требует дальнейшего изучения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В заключение следует отметить, что в результате проведенных исследований показано, что хемотаксический комплекс Tag7-Mts1 можно считать новым лигандом хемотаксических рецепторов CCR5 и CXCR3, представленных на клетках иммунной системы. Хотя ни один из белков этого лиганда не имеет структурного мотива классического хемокина, Tag7-Mts1 может индуцировать миграцию РВМС с участием классических хемокиновых рецепторов, причем проявляет большее сродство к CCR5. Также показано, что Mts1 - один из белков двухкомпонентного комплекса, может связываться с внеклеточным доменом CCR5, однако для активации рецептора требуется дополнительное взаимодействие Tag7 с его внеклеточным участком. Понимание процессов, лежащих в основе взаимодействия неклассического хемокина с классическим хемотаксическим рецептором, будет способствовать пониманию механизмов миграции клеток иммунной системы к очагу поражения и поиску новых хемокинов.

Об авторах

T. Н. Шарапова

Email: yashin_co@mail.ru
Россия

E. A. Романова

Email: yashin_co@mail.ru
Россия

Л. П. Сащенко

Email: yashin_co@mail.ru
Россия

Д. В. Яшин

Автор, ответственный за переписку.
Email: yashin_co@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы