Белок CG9890 с доменами цинковых пальцев - новый компонент ENY2-содержащих комплексов дрозофилы

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Ранее мы показали, что инсуляторный белок Su(Hw), содержащий домен цинковых пальцев, взаимодействует с ENY2 и привлекает ENY2-содержащие комплексы на Su(Hw)-зависимые инсуляторы дрозофилы, участвуя одновременно в регуляции транскрипции и позиционировании ориджинов репликации. В данной работе обнаружено, что ENY2 взаимодействует еще с одним белком - CG9890, который также содержит домен цинковых пальцев. Подтверждено взаимодействие ENY2 и CG9890. Показано, что белок CG9890 локализован в клеточном ядре и взаимодействует c белковыми комплексами SAGA, ORC, dSWI/SNF, TFIID, THO.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Регуляция экспрессии генов эукариот - комплексный многофакторный процесс, который может происходить на нескольких последовательных этапах транскрипции (инициация и элонгация), процессинга мРНК, экспорта мРНП из ядра, трансляции и фолдинга белков [1]. Локальная структура хроматина, положение гена относительно функциональных ядерных компартментов и дальние взаимодействия регуляторных элементов являются дополнительным уровнем регуляции генетических процессов в контексте сложной организации генома эукариот в трехмерном пространстве ядра [2-4]. Белок ENY2 - мультифункциональный фактор, участвующий в различных стадиях экспрессии генов [5-15]. Разнообразные клеточные функции ENY2 определяются активностями тех белковых комплексов, в составе которых он обнаруживается. Так, ENY2 является субъединицей деубиквитинирующего модуля SAGA - важного коактиватора транскрипции у дрозофилы [13, 16]. Этот комплекс обладает гистон-ацетилтрансферазной активностью. Вносимая им модификация узнается бромодоменами ремоделирующих хроматин комплексов семейства SWI/SNF, за счет чего происходит их привлечение на гены, регулируемые SAGA [17]. В результате активного ремоделирования структуры хроматина происходит локальное удаление или дестабилизация нуклеосом, что создает благоприятные условия для связывания РНК-полимеразы и различных факторов транскрипции, необходимого для регуляции транскрипции [18, 19]. Кроме того, ENY2 обнаружен в составе комплекса AMEX, взаимодействующего с белками ядерной поры (NPC) и участвующего в экспорте мРНК из ядра [14]. Будучи общим компонентом двух указанных комплексов, ENY2 отвечает за локализацию части SAGA-регулируемых генов у ядерной поры, тем самым участвуя в создании локальных транскрипционно активных участков на периферии ядра. ENY2-зависимое позиционирование определенных генетических локусов вблизи NPC обеспечивает высокую скорость экспорта новосинтезированной РНК, что абсолютно необходимо при ответе на стресс или гормональный сигнал. Осуществляемое белком ENY2 привлечение комплексов, участвующих в создании участков локально открытого хроматина, играет важную роль в обеспечении барьерной активности Su(Hw)-зависимых инсуляторов [15]. Кроме того, Su(Hw) - первый белок высших эукариот, роль которого была показана в позиционировании ориджинов репликации в геноме дрозофилы [20, 21]. Привлечение комплексов SAGA и dSWI/SNF на сайты связывания этого белка приводит к образованию областей с низкой локальной плотностью нуклеосом, что способствует связыванию комплекса ORC, ответственного за сборку преинициаторного комплекса репликации. По всей видимости, ENY2-содержащие комплексы принимают участие не только в регуляции экспрессии генов, но также важны для синхронизации транскрипции и репликации в ходе клеточного цикла. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Клеточные линии и трансфекция В работе использовали линию клеток S2 Drosophila melanogaster. Трансфекцию клеток проводили при помощи Effectene Transfection Reagent (Qiagen) по протоколу производителя. Генетическая конструкция, использованная для трансфекции, кодировала белок CG9890, маркированный 3×FLAGэпитопом. Антитела Были использованы следующие антитела: полученные в нашей лаборатории поликлональные кроличьи антитела к GCN5, Xmas-2, OSA, N-концу TBP, Thoc5, ORC2, ORC3, PB, Moira, любезно предоставленные L. Tora кроличьи антитела к ADA2b. Поликлональные антитела α-CG9890 получены из сыворотки крови кролика, иммунизированного полноразмерным белком CG9890, экспрессированным в Escherichia coli. Все кроличьи антитела были очищены. Концентрация всех антител, полученных в лаборатории, составляла около 1 мг/мл. Также использовали мышиные антитела против ламина Dm0 (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Department of Biological Sciences), антитела к FLAG-эпитопу (Sigma), а также антитела к FLAGэпитопу, конъюгированные с пероксидазой хрена. Разведение коммерческих антител 1 : 500, разведение антител, полученных в лаборатории, варьировало для получения оптимального сигнала на вестернблоте. В качестве вторичных антител использовали антитела козы или осла к иммуноглобулинам кролика и мыши, узнающие как полноразмерные иммуноглобулины, так и специфичные только к легким цепям антител (разведение 1 : 5000). Вторичные антитела были конъюгированы с пероксидазой хрена. Кроме того, для флуоресцентной микроскопии использовали вторичные антитела Cy3 и AlexaFluor™ 488 (разведение 1 : 500). Иммунофлуоресцентная микроскопия клеток линии S2 D. melanogaster Прикрепившиеся к покровным стеклам клетки линии S2 дважды промывали 1×PBS, фиксировали 3.7% ПФА (pH 7.5) в течение 10 мин, промывали 1×PBS 2 раза по 5 мин. Затем обрабатывали 0.2% раствором Triton X-100 в 1×PBS в течение 5 мин, промывали 1×PBS 2 раза по 5 мин, после чего в течение 10 мин инкубировали в 3% обезжиренном сухом молоке, разведенном в 1×PBS. Первичные антитела разводили в 3% молоке/PBS, препараты инкубировали с антителами (1 ч, комнатная температура, влажная камера). Использовали антитела мыши против ламина Dm0 (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Department of Biological Sciences) в разведении 1 : 5000, поликлональные антитела кролика против CG9890 (разведение 1 : 1000). Препараты промывали 3 раза по 5 мин в 1×PBS, затем инкубировали со вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной камере, закрытой фольгой. В качестве вторичных антител использовали: антитела против IgG (H+L) кролика, конъюгированные с Cy3 (Amersham), антитела против IgG мыши, конъюгированные с AlexaFluor 488 (Molecular Probes) в разведении 1 : 500. Закрытые фольгой препараты промывали 3 раза по 5 мин в 1×PBS и инкубировали с DAPI (разведение 1 : 1000, Sigma) в течение 10 с. Препараты отмывали в течение 5 мин в 1×PBS. После высушивания покровное стекло заключали в трис-глицериновый буфер (Vectashield) на предметном стекле. Края покровного стекла покрывали лаком во избежание высыхания препарата и попадания иммерсии внутрь него. Препараты смотрели непосредственно после получения, используя световой микроскоп Leica. Использовали объектив ×100 с иммерсией. Обработку изображений проводили с помощью программы ImageJ. Иммунопреципитация Для выделения ядер клетки центрифугировали в течение 5 мин при 500g при +4°C. Осадок промывали 1 мл буфера LB cyto 3 (3 мМ MgCl2 , 20 мМ HEPES NaOH, pH 8.0) с добавлением бутирата натрия (ингибитор деацетилаз) до конечной концентрации 20 мМ. Затем проводили повторное центрифугирование в тех же условиях, тщательно ресуспендировали осадок клеток в 200 мкл буфера LB cyto 3 с добавлением бутирата натрия до конечной концентрации 10 мМ и ингибитора протеаз (Protease Inhibitor Cocktail (PIC), Roche). После чего инкубировали на льду в течение 15 мин. После центрифугирования избавлялись от супернатанта, и далее использовали только ядерную фракцию. Осадок ядер растворяли в 500 мкл MN буфера III (20 мМ HEPES KOH, 3 мМ MgCl2 , 0.1% NP40, 0.1 M KCl, pH 8.0) с добавлением бутирата натрия до конечной концентрации 20 мМ (ингибитор деацетилаз) и ингибитора протеаз (PIC, Roche). ДНК фрагментировали, обрабатывая клетки ультразвуком (2 раза по 10 с, перерыв 1 мин, средняя мощность прибора) на льду. После ресуспендирования клетки инкубировали в течение 30 мин с 2 ед. ДНКазы I на льду и центрифугировали при 16 000g в течение 20 мин при +4°C. Для коиммунопреципитации использовали поликлональные антитела к белку CG9890 и иммуноглобулины сыворотки крови неиммунизированного кролика в качестве отрицательного контроля. Антитела были иммобилизованы на Mab-сефарозе. Лизат клеток линии S2 (200 мл) инкубировали с 15 мкл 50% Mab-сефарозы с иммобилизованными на ней антителами в течение 3 ч на качалке при +4°С. Сефарозу отмывали буфером MN III (3 раза по 10 мин) при +4°С. Результаты анализировали с помощью вестерн-блотинга. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ взаимодействия белков ENY2 и CG9890 Ранее с целью идентификации новых белковых партнеров ENY2 был проведен скрининг библиотеки кДНК эмбрионов дрозофилы в двугибридной дрожжевой системе. Идентифицировали более 10 взаимодействующих белков, часть из которых была изучена [11-15, 20-22]. В ходе скрининга выявили взаимодействие ENY2 с еще неохарактеризованным белком CG9890, изучению которого посвящена данная статья. Как предсказывает биоинформатический анализ аминокислотной последовательности CG9890, он относится к семейству белков, несущих домен цинковых пальцев C2H2 - самый часто встречающийся у эукариот ДНК-связывающий мотив [23]. Белки этого семейства вовлечены в разнообразные клеточные функции, что обеспечивается возможностью участия домена цинковых пальцев в специфическом узнавании не только ДНК, но также РНК и белков [24-26]. Для подтверждения взаимодействия белков ENY2 и CG9890 была создана генетическая конструкция для экспрессии белка CG9890, маркированного 3×FLAG-эпитопом. Создана линия клеток S2 D. melanogaster, экспрессирующая этот слитый белок, и проведена его иммунопреципитация из лизата клеток с использованием антител к белку ENY2 и неспецифических антител в качестве отрицательного контроля. Результаты иммунопреципитации анализировали с помощью вестерн-блотинга и детектировали с помощью антител к эпитопу 3×FLAG (Sigma). Как видно на рис. 1, антитела к белку ENY2 преципитируют белок 3×FLAG_CG9890 (дорожка 3), в то время как неспецифические антитела не преципитируют (дорожка 2). Таким образом подтверждено взаимодействие белков ENY2 и CG9890. Для дальнейшего изучения CG9890 получены поликлональные антитела к этому белку и аффинно очищены на колонке, содержащей рекомбинантный белок CG9890. Анализ специфичности антител с помощью вестерн-блотинга показал, что данные антитела узнают полосу в районе 60 кДа, что близко к расчетной массе белка 53 кДа (данные не представлены). Изучение внутриклеточной локализации белка CG9890 Внутриклеточную локализацию белка CG9890 определяли с использованием иммуноокрашивания клеток линии S2 дрозофилы охарактеризованными нами поликлональными антителами. Результаты эксперимента представлены на рис. 2. В результате анализа серии микрофотографий установлено, что белок CG9890 локализуется преимущественно в клеточном ядре, хотя некоторое его количество присутствует и в цитоплазме. Анализ взаимодействий белка CG9890 с субъединицами ENY2-содержащих комплексов Так как было подтверждено взаимодействие белков ENY2 и CG9890, предположили, что CG9890 участвует в некоторых ENY2-зависимых процессах, а его взаимодействие с отдельными партнера ми ENY2 может определять механизм его функционирования в клетке. Для проверки данной гипотезы было решено исследовать, с какими субъединицами ENY2-содержащих комплексов взаимодействует белок CG9890. С этой целью проведен эксперимент по иммунопреципитации белков из лизата клеток S2 D. melanogaster поликлональными антителами α-CG9890 с последующим вестерн-блот-анализом, результаты которого представлены на рис. 3. В результате проведенных экспериментов обнаружено взаимодействие белка CG9890 с белками, входящими в состав различных ENY2-содержащих комплексов. В частности, с субъединицами ORC2 и ORC3 комплекса ORC, участвующего в позиционировании ориджинов репликации. Также обнаружены взаимодействия с такими белками, принимающими участие в регуляции транскрипции, как TBP (субъединица комплекса TFIID - функционального партнера ENY2), GCN5 (субъединица гистон-ацетилтрансферазного комплекса SAGA, содержащего ENY2), Thoc5 (субъединица ENY2-содержащего комплекса THO, участвующего в формировании мРНП и элонгации транскрипции). Факт взаимодействия CG9890 с комплексами, вовлеченными в транскрипцию, согласуется с данными о ядерной локализации этого белка. Также нами выявлено взаимодействие CG9890 с белком Polybromo (PB) - субъединицей ремоделирующего хроматин комплекса dSWI/SNF, необходимого для создания области открытого хроматина при активации промотора. Взаимодействие с белком Xmas-2 (комплекс AMEX) показать не удалось (данные не представлены). Таким образом, CG9890 взаимодействует с транскрипционными комплексами, вовлеченными в инициацию и элонгацию транскрипции, но не с комплексом AMEX, связанным с экспортом мРНК из ядра в цитоплазму, что указывает на участие CG9890 в первых стадиях транскрипционного цикла. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Ранее мы обнаружили, что инсуляторный белок Su(Hw), содержащий домен цинковых пальцев, взаимодействует с ENY2 и привлекает ENY2 содержащие комплексы на Su(Hw)-зависимые инсуляторы дрозофилы, участвуя одновременно и в регуляции транскрипции, и в позиционировании ориджинов репликации. В данной работе нами выявлено взаимодействие ENY2 еще с одним белком - CG9890, который, как и Su(Hw), содержит домен цинковых пальцев. По аналогии с Su(Hw) мы предполагаем, что CG9890 является ДНКсвязывающим белком, который привлекает ENY2 содержащие комплексы на свои сайты связывания, организуя таким образом регуляторные элементы генома, необходимые для функционирования клетки. Нами показано, что белок CG9890 локализован в ядре клетки. Подтверждено взаимодействие ENY2 и CG9890. Биохимическими методами выявлена связь белка CG9890 с ENY2-содержащими комплексами SAGA, ORC, dSWI/SNF, TFIID и THOC. Взаимодействие с белком Xmas-2 (комплекс AMEX) показать не удалось. Таким образом, CG9890 взаимодействует с комплексами, вовлеченными в инициацию и элонгацию транскрипции, но не с комплексом AMEX, участвующим в экспорте мРНК из ядра в цитоплазму, что указывает на «работу» CG9890 на первых стадиях транскрипционного цикла. Кроме того, CG9890 взаимодействует с комплексом ORC, необходимым для позиционирования точек начала репликации.

×

Об авторах

Н. A. Фурсова

Институт биологии гена РАН

Email: krasnov@genebiology.ru
Россия

Ю. В. Николенко

Институт биологии гена РАН

Email: krasnov@genebiology.ru
Россия

Н. В. Сошникова

Институт биологии гена РАН

Email: krasnov@genebiology.ru
Россия

M. Ю. Мазина

Институт биологии гена РАН

Email: krasnov@genebiology.ru
Россия

Н. E. Воробьева

Институт биологии гена РАН

Email: krasnov@genebiology.ru
Россия

A. Н. Краснов

Институт биологии гена РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: krasnov@genebiology.ru
Россия

Список литературы

  1. Orphanides G., Reinberg D. // Cell. 2002, V.108, №4, P.439-451
  2. Maksimenko O., Georgiev P. // Front. Genet. 2014, V.5, P.28
  3. van Bemmel J.G., Pagie L., Braunschweig U., Brugman W., Meuleman W., Kerkhoven R.M., van Steensel B. // PLoS One. 2010, V.5, №11, e15013
  4. Rando O.J., Chang H.Y. // Annu. Rev. Biochem. 2009, V.78, P.245-271
  5. Mardanov P.V., Krasnov A.N., Kurshakova M.M., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G. // Genetika. 2005, V.41, №4, P.536-541
  6. Krasnov A.N., Kurshakova M.M., Ramensky V.E., Mardanov P.V., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G. // Nucleic Acids Research 2005, V.33, №20, P.6654-6661
  7. Georgieva S.G., Nabirochkina E.N., Pustovoitov M.V., Krasnov A.N., Soldatov A.V. // Genetika. 2001, V.37, №1, P.18-23
  8. Orlova A.V., Kopytova D.V., Krasnov A.N., Nabirochkina E.N., Ilyin Y.V., Georgieva S.G., Shidlovskii Y.V. // Dokl. Biochem. Biophys. 2010, V.434, P.227-231
  9. Kopytova D.V., Orlova A.V., Krasnov A.N., Gurskiy D.Y., Nikolenko J.V., Nabirochkina E.N., Shidlovskii Y.V., Georgieva S.G. // Genes Dev. 2010, V.24, №1, P.86-96
  10. Kopytova D.V., Krasnov A.N., Orlova A.V., Gurskiy D.Y., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G., Shidlovskii Y.V. // Cell Cycle. 2010, V.9, №3, P.479-481
  11. Kurshakova M.M., Kopytova D.V., Nabirochkina E.N., Soshnikova N.V., Georgieva S.G., Krasnov A.N. // Genetika. 2009, V.45, №3, P.330-335
  12. Kurshakova M.M., Kopytova D.V., Nabirochkina E.N., NikolenkoIu V., ShidlovskiiIu V., Georgieva S.G., Krasnov A.N. // Genetika. 2009, V.45, №10, P.1332-1340
  13. Zhao Y., Lang G., Ito S., Bonnet J., Metzger E., Sawatsubashi S., Suzuki E., Le Guezennec X., Stunnenberg H.G., Krasnov A. // Molecular Cell 2008, V.29, №1, P.92-101
  14. Kurshakova M.M., Krasnov A.N., Kopytova D.V., Shidlovskii Y.V., Nikolenko J.V., Nabirochkina E.N., Spehner D., Schultz P., Tora L., Georgieva S.G. // EMBO J. 2007, V.26, №24, P.4956-4965
  15. Kurshakova M., Maksimenko O., Golovnin A., Pulina M., Georgieva S., Georgiev P., Krasnov A. // Molecular Cell 2007, V.27, №2, P.332-338
  16. Helmlinger D., Tora L. // Trends Biochem. Sci. 2017, V.42, №11, P.850-861
  17. Baker S.P., Grant P.A. // Oncogene. 2007, V.26, №37, P.5329-5340
  18. Mazina M.Y., Nikolenko Y.V., Krasnov A.N., Vorobyeva N.E. // Genetika. 2016, V.52, №2, P.164-169
  19. Krasnov A.N., Mazina M.Y., Nikolenko J.V., Vorobyeva N.E. // Cell Biosci. 2016, V.6, P.15
  20. Vorobyeva N.E., Mazina M.U., Golovnin A.K., Kopytova D.V., Gurskiy D.Y., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G., Georgiev P.G., Krasnov A.N. // Nucleic Acids Research 2013, V.41, №11, P.5717-5730
  21. Mazina M., Vorob’eva N.E., Krasnov A.N. // Tsitologiia. 2013, V.55, №4, P.218-224
  22. Krasnov A.N., Vorobyova N.E., Mazina M.Y. // Dokl. Biochem. Biophys. 2018, V.479, №1, P.80-82
  23. Razin S.V., Borunova V.V., Maksimenko O.G., Kantidze O.L. // Biochemistry (Mosc.). 2012, V.77, №3, P.217-226
  24. Brayer K.J., Segal D.J. // Cell Biochem. Biophys. 2008, V.50, №3, P.111-131
  25. Brown R.S. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2005, V.15, №1, P.94-98
  26. Fedotova A.A., Bonchuk A.N., Mogila V.A., Georgiev P.G. // Acta Naturae. 2017, V.9, №2, P.47-58

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Фурсова Н.A., Николенко Ю.В., Сошникова Н.В., Мазина M.Ю., Воробьева Н.E., Краснов A.Н., 2018

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах