Иммуномакс - агонист TLR4 - влияет на фенотип легочных макрофагов при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у мышей

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Бронхиальная астма (БА) - это заболевание, в основе которого лежит хроническое воспаление дыхательных путей. Воспаление, обуславливающее гиперреактивность бронхов, развивается под влиянием Т-хелперов второго типа (Th2-ответ). За последние 15-20 лет заболеваемость БА среди населения Российской Федерации выросла более чем в 3 раза и составила 902.8 на 100000 населения (2007 г.). Обострения БА у детей и взрослых в большинстве случаев ассоциированы с острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ). Некоторые виды вирусов, такие, как респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), риновирусы, метапневмовирус, вирусы гриппа, парагриппа и коронавирусы, детектированы в секретах дыхательных путей в период обострения БА [1]. В связи с этим разработка новых средств профилактики ОРВИ является важной проблемой системы здравоохранения. Альвеолярные Мф (аМф) - доминантная популяция клеток бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), отличаются способностью приобретать разнообразные фенотипы в зависимости от сигналов микроокружения (классически активированные М1, альтернативно активированные М2). Регуляторную роль различных фенотипов Mф in vivo активно изучают, но накапливаются данные, свидетельствующие о том, что Мф могут участвовать в патогенезе БА [2, 3]. Среди рецепторов распознавания молекулярных образов патогенов (pathogen pattern recognition receptors, PRR) наиболее изучены Toll-подобные рецепторы (TLR), активация которых необходима для запуска механизмов врожденного иммунного ответа на инфекцию. В связи с этим считается, что агонисты TLR могут использоваться в качестве иммунотерапевтических препаратов или адъювантов вакцин для лечения инфекционных заболеваний. Выделенный из проростков картофеля [4] TLR4 агонист Иммуномакс эффективен в отношении целого ряда патогенов как вирусной (папилломавирус, герпесвирус), так и бактериальной природы, а также обладает потенциальной противоопухолевой активностью [5]. Ранее сообщалось, что иммуномодулятор Иммуномакс активирует моноциты, Мф, NK и дендритные клетки [6]. В данной работе изучена роль М2 Mф при воспалении БА, индуцированной вирусными инфекциями, а также возможность искусственного изменения поляризации Мф из М2 в М1 с помощью агонистов TLR с целью повышения эффективности иммунной защиты от РСВ на фоне иммунного ответа аллергического типа. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Поляризация макрофагов мыши посредством препарата Иммуномакс в экспериментах in vitro Макрофаги (Мф), выделенные из костного мозга мыши, помещали в 24-луночные планшеты в концентрации 105 клеток на лунку и в течение 7 дней культивировали в среде, содержащей гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). Через 7 дней клетки в течение 24 ч обрабатывали IL-4 для получения М2 Мф, Иммуномаксом - для получения М1 или питательной средой для М0. Через 24 ч после обработки IL-4 среду заменяли на новую с Иммуномаксом для реполяризации М2 в М1, а также добавляли Иммуномакс в М0 для реполяризации в М1. Схема эксперимента представлена на рис. 1А. Через 24 ч после обработки лизаты клеток отбирали, замораживали при -80°C и хранили до момента исследования. Далее образцы анализировали методом ПЦР-РВ, определяя при этом уровень мРНК генов iNOS и ARG1 мыши. Эксперименты в условиях in vivo Профилактический эффект Иммуномакса in vivo мы оценивали на двух экспериментальных моделях: РСВ-инфекции у мышей и вирус-индуцированного обострения БА у мышей. Схема экспериментов представлена на рис. 2А и 2Б соответственно. В каестве вирусного агента был выбран РСВ штамм А2. В экспериментах использовали самок мышей линии BALB/c массой 18-20 г из питомника «Столбовая», Россия. В экспериментах были сформированы по четыре группы животных (N = 17) (рис. 2). По восемь мышей из каждой группы использовали для гистологического исследования и ПЦР-анализа. Часть мышей (N = 4) использовали для анализа фенотипов популяций макрофагов в легких (посредством комплексного клеточного анализа бронхиального лаважа и клеточного инфильтрата легких с помощью многопараметровой проточной цитометрии). Четырех мышей из каждой группы использовали для идентификации количества РСВ-специфических CD4+ Т-клеток, секретирующих IFN-γ и IL-4, методом ELISPOT через 1.5 месяца после инфекции. На основании работы Misharin и соавт. [7] для идентификации популяций клеток миелоидного ряда мы выбрали следующее сочетание антител - CD11b Brilliant Violet 510™, CD45 AlexaFluor®, Ly-6C PE, CD11cPE/Dazzle™ 594, CD49bPerCP/Cy5.5, Ly-6GPE/Cy7, F4/80APC, I-A/I-EAPC/Cy7. Для сортировки клеток использовали проточный цитометр FACSAria II. Экспрессию мРНК генов iNOS и ARG1 в отсортированных Мф оценивали методом ПЦР-РВ. С целью оценки противовирусного эффекта агонистов TLR методом ПЦР-РВ определяли уровень РНК РСВ в лизатах клеток, выделенных из гомогенатов легких. Для идентификации секретирующих IFN-γ и IL-4 РСВ-специфических CD4+ Т-клеток использовали коммерческие наборы Mouse IL-4 ELISPOT Set и Mouse IFN-γ ELISPOT Kit (BD Biosciences, США) согласно инструкции производителя. Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи программного обеспечения GraphPad Prism version 4.0. Данные считали статистически значимыми при P < 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Мы изучали возможность Иммуномакса, агониста TLR4, переводить макрофаги мыши из состояния М0 и М2 в М1. Фенотип Мф определяли, используя информацию об экспрессии мРНК генов iNOS и ARG1 - маркеров М1- и М2-фенотипов соответственно [8]. Полученные нами данные подтверждают способность Иммуномакса реполяризовать клетки в состояние М1. В частности, в обработанных Иммуномаксом М0 повышается экспрессия iNOS и снижается экспрессия ARG1. Такой же эффект мы наблюдали в М2-клетках, обработанных Иммуномаксом (повышение уровня мРНК гена iNOS и снижение ARG1 (рис. 1Б, В)). На следующем этапе мы перешли к изучению in vivo профилактического эффекта от применения Иммуномакса как в экспериментах с РСВинфекцией у мышей, так и с обострением БА на фоне РСВ-инфекции (рис. 2). В этой серии мы оценивали целый ряд параметров, таких, как функция дыхания, клеточный состав БАЛ, гистологические изменения, уровень сывороточных овальбуминспецифических антител разных классов (IgE, IgG1 и IgG2). Не выявлено статистически значимых различий в величинах этих показателей у животных экспериментальных групп (данные не представлены). Однако следует отметить, что в эксперименте с БА+РСВ мы выявили тенденцию к снижению уровня овальбуминспецифических IgG1-антител в сыворотке крови мышей, получавших Иммуномакс (данные не представлены). Классическим носителем свойств антител являются Th2-зависимые IgG1 антитела, содержание которых может увеличиваться при аллергических заболеваниях. Снижение под воздействием Иммуномакса уровня IgG1-антител, наблюдаемое в нашем исследовании, по всей видимости, свидетельствует о развитии иммунных реакций по Th1-типу. Интересно, что эти реакции наблюдаются на системном уровне, несмотря на интраназальное введение препарата. Особый интерес представлял фенотип легочных Мф мышей в разных условиях эксперимента, так как мы предполагаем, что при интраназальном введении Иммуномакс действует на клетки этого типа, переводя их в состояние М1. Чтобы проверить эту гипотезу, мы выделяли Мф из легких посредством сортировки на проточном цитометре FACSAria II и оценивали экспрессию мРНК генов iNOS и ARG1. При анализе данных ПЦР-РВ мы отметили тенденцию к повышению уровня iNOS (рис. 3А) и значимое снижение уровня ARG1 (рис. 3В) в Мф мышей с БА, обработанных Иммуномаксом, на фоне РСВинфекции. Это указывает на поляризацию Мф в противовирусное М1-состояние. Однако в эксперименте с РСВ-инфекцией у мышей подобной тенденции не выявлено (рис. 3Б,Г). При оценке вирусной нагрузки отмечено статистически значимое снижение количества вирусной РНК в легких мышей, обработанных Иммуномаксом, по сравнению с группой животных, не получавших лечение (рис. 3Д). Отмечена также тенденция к снижению вирусной нагрузки в группе, обработанной Poly (I : C) - агонистом TLR3. Эти данные получены в эксперименте с вирус-индуцированным обострением БА. Мы выявили также тенденцию к снижению вирусной нагрузки у мышей с РСВ-инфекцией, получавших исследуемый препарат (рис. 3Е). На рис. 4 представлены результаты выявления РСВ-специфической дифференцировки Th1- и Th2-клеток методом ELISPOT. В эксперименте с моделированием обострения БА на фоне РСВ-инфекции мы наблюдали значимое повышение РСВ-активированных CD4+ Т-клеток, секретирующих IFN-γ (Th1-клетки) (рис. 4А), и одновременно значительное снижение содержания CD4+ клеток, секретирующих IL-4 (Th2-клетки) (рис. 4Б) в селезенках мышей, обработанных Иммуномаксом. У мышей с РСВ-инфекцией, обработанных Иммуномаксом, выявлена тенденция к повышению содержания активированных CD4+ Т-клеток, секретирующих IFN-γ (Th1-клеток), при этом не обнаружено CD4+ клеток, секретирующих IL-4 (Th2-клетки) (данные не представлены). Таким образом, в ходе экспериментов in vitro и in vivo показано, что агонист TLR4 Иммуномакс способен реполяризовать Th2-ответ в противовирусный Th1. Эффект от применения Иммуномакса наблюдали на модели БА, осложненной РСВ-инфекцией, где у мышей изначально посредством сенсибилизации модельным аллергеном овальбумином формировали выраженный Th2-ответ. Главной концепцией в терапии аллергических заболеваний является инверсия иммунного Th2-ответа в сторону Th1. Этот подход особенно актуален при ОРВИ у пациентов с БА, так как многочисленные данные свидетельствуют от том, что пациенты с БА переносят ОРВИ в более тяжелой форме [9]. Это связывают с доминирующим Th2-ответом, который, возможно, вызван преобладанием в легких больных активированных М2 Мф [3]. В связи с этим, полученные нами данные свидетельствуют о том, что обработка Иммуномаксом, агонистом TLR4, оказывает влияние на фенотип легочных Мф, поляризуя иммунный ответ в сторону Th1, и поэтому обладает потенциалом для использования в качестве средства для профилактики РСВ-инфекции, в том числе на фоне аллергического типа иммунного ответа.

Об авторах

A. A. Никонова

Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России; Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: aa.nikonova@nrcii.ru
Россия

A. В. Пичугин

Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России

Email: aa.nikonova@nrcii.ru
Россия

M. M. Чулкина

Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России

Email: aa.nikonova@nrcii.ru
Остров Буве

E. С. Лебедева

Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России

Email: aa.nikonova@nrcii.ru

A. Р. Гайсина

Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России

Email: aa.nikonova@nrcii.ru
Россия

И. П. Шиловский

Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России

Email: aa.nikonova@nrcii.ru
Россия

Р. И. Атауллаханов

Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России

Email: aa.nikonova@nrcii.ru
Россия

M. Р. Хаитов

Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России

Email: aa.nikonova@nrcii.ru

Р. M. Хаитов

Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России

Email: aa.nikonova@nrcii.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы