Экспериментальное моделирование травмы спинного мозга у лабораторных крыс

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Одной из наиболее острых и социально значимых задач современной регенеративной медицины остается функциональное восстановление спинного мозга при структурных дефектах различного генеза, большинство из которых обусловлены травмой [1]. Травма спинного мозга (ТСМ) признается одной из основных причин инвалидности [2]. По данным ВОЗ, ежегодно до 500 000 человек получают повреждение спинного мозга [3]. Основными причинами ТСМ являются дорожно-транспортные происшествия (38%), падения (22.2%), спортивные травмы и несчастные случаи (22.5%) [4]. Клиническая картина ТСМ характеризуется дефицитом двигательной активности, нарушениями сенсорных и вегетативных функций, нейропатическими болями. Патогенез спинальной травмы обычно обременен плохим прогнозом, связанным с развитием паралича. Кроме того, некоторые заболевания могут вызывать или увеличивать риск повреждения спинного мозга [5]. Помимо прямых последствий ТСМ, связанных с потерей моторной, сенсорной и вегетативной функций, существует вероятность развития вторичных процессов, которые могут усугубить травму и привести к атрофии мышц, хроническим болям, инфекции мочевыводящих путей и пролежням [6, 7]. Современное понимание процессов стимулирования роста нервов и формирования комплекса иммунологических, воспалительных и рубцово-образовательных реакций, возникающих в ответ на ТСМ, привело к развитию ряда фармакологических методов лечения. В сочетании с различными клеточными и аддитивными технологиями эти методы дают надежду на то, что в скором времени большинство травм спинного мозга будут излечимы [8-11]. Испытание новых материалов и техник, способствующих регенерации спинного мозга на животных моделях, необходимый и важный этап доклинической разработки стратегии лечения травм спинного мозга. Одним из ключевых объектов биомоделирования спинальной травмы является крыса. Повреждения спинного мозга у крысы стали основной моделью, используемой для оценки стратегии экспериментального лечения ТСМ [4, 12]. В этом обзоре рассмотрены последние достижения в применении биодеградируемых многомерных материалов - скаффолдов, призванных обеспечить регенеративный рост аксонов по всей площади повреждения спинного мозга, создавая тем самым среду для его эндогенного восстановления. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ ТРАВМЫ СПИННОГО МОЗГА У ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС При выборе оптимальной животной модели для решения конкретных исследовательских задач необходимо учитывать множество факторов: вид, возраст, размер, пол животных, возможность применения методов визуализации и функциональной оценки их состояния. Начиная со второй половины прошлого века способы предотвращения последствий травмы спинного мозга стали предметом систематического исследования на различных животных, включая крыс, мышей, кошек, собак, минипигов [13-15]. Экспериментальные модели различаются типами травматических повреждений спинного мозга: контузионным, компрессионным, дистракционным, дислокационным, химическим, ишемическим и реперфузионным, а также различными видами лацерации. Из большого числа разработанных на крысах моделей ТСМ наибольшее распространение получили модели, приближенные к клинической практике закрытых травм: компрессионная, имитирующая сдавливание, и контузионная, имитирующая ушиб [16-18]. Средняя продолжительность эксперимента в большинстве исследований составляет около 2 месяцев. Основным критерием оценки адекватности модели является регистрация морфологических изменений (аксональной регенерации, миелинизации, васкуляризации, плотности глиального рубца, воспалительной реакции) гистологическими методами (изучают, как правило, поперечные и сагиттальные срезы в зоне повреждения и смежных с ней, с проксимальной и дистальной сторон, областях). В качестве вспомогательных критериев используют методы аппаратной диагностики с помощью МРТ и функциональную оценку посредством электромиограммы. Клиническую оценку осуществляют по рейтинговой шкале Бассо, Битти и Бреснахан (ВВВ-тест) при перемещении крысы в открытом пространстве клетки из плексигласа с использованием цифровых камер с регистрацией соматосенсорных потенциалов [19- 21], теста «Динамическая весовая нагрузка» (ДВН) [22], а также по поведенческим тестам. К недостаткам большинства экспериментальных моделей ТСМ у крыс относятся слабая контролируемость степени воздействия, а также глубокие деструктивные изменения серого и белого вещества спинного мозга, включающие комплекс патологических сдвигов, гибель нейронов и глиальных клеток, дегенерацию нервных волокон, демиелинизацию, активацию микроглии и макрофагов [23]. Все эти нарушения приводят к возникновению устойчивого функционального дефицита. Модели контузионного, компрессионного, тракционного, фотохимического, воспалительного, ишемического и реперфузионного повреждений используют преимущественно для исследования патофизиологии ТСМ, так как они воспроизводят возможные механизмы нанесения травмы и повреждения спинного мозга [15]. Представленные способы моделирования могли бы полноценно отразить клинико-морфологические сдвиги при ТСМ у человека, однако большинство этих моделей трудно воспроизвести, и они не могут быть использованы для изучения регенерации спинного мозга при структурных повреждениях. Доказано, что функциональный дефицит спинного мозга крысы обусловлен в основном несостоятельностью проводящих путей белого вещества [24]. Поэтому при рассмотрении патофизиологических процессов спинальной травмы уместны аналогии с процессами, происходящими при травме периферических отделов нервной системы. Зависимость способности восстановления иннервации применительно к периферическому нерву от степени повреждения была установлена и количественно охарактеризована (в виде трех- и пятибалльной шкалы) еще в середине прошлого столетия [25-28]. При легкой степени (нейропраксии) повреждения периферических нервов аксональная регенерация экспериментально доказана и, более того, находит подтверждение в клинической практике. Известно много примеров восстановления иннервации эффекторного участка у млекопитающих как посредством хирургических техник, так и самопроизвольно. Установлено, что между нейронами, клетками Шванна, макрофагами и окружающей средой возникают «клеточно-сигнальные» факторы, которые способствуют ремиелинизации, росту и, что примечательно, самонаведению регенерирующего аксона [29-32]. Восстановление проводимости происходит в несколько этапов, включающих миелинизацию, прорастание аксона, образование синаптических контактов и, наконец, восстановление функций эффектора [33]. Доказано, что регенерация аксонов происходит в рострокаудальном направлении, вдоль прежнего пролегания волокна со средней скоростью примерно 1-2 мм в день [34-38]. При повреждениях средней степени тяжести в месте травмы происходит разрушение миелиновой оболочки аксона, антероградная (распространяющаяся от места повреждения к периферическому сегменту) Валлерова дегенерация дистального участка нерва, идущего к эффектору, в то время как проксимальный участок нерва и само тело нейрона остаются незатронутыми, обуславливая, например, фантомные боли после ампутации конечности [39]. В тяжелых случаях возможно образование невромы и глиальных рубцов. В 30% общего числа клинических случаев, преимущественно в боковых канатиках белого вещества спинного мозга образуются «ипсилатеральные» кисты (сирингомиелия, кистозная дегенерация) [40]. Установлено, что на стадии формирования рубцового перерождения глия выполняет барьерную функцию, препятствуя распространению продуктов тканевого распада и медиаторов воспаления (преимущественно макрофагов), а также обуславливает поддержку архитектоники органов центральной нервной системы. Однако, формируясь, тканевая структура таких дефектов уплотняется и препятствует регенеративному прорастанию аксонов, обуславливая тот факт, что после повреждения, сопровождающегося демиелинизацией, аксоны центральной нервной системы взрослых млекопитающих самостоятельно не восстанавливаются [40-42]. Одно из направлений методологии хирургического лечения ТСМ в наиболее часто встречающейся и показанной к оперативному разрешению хронической ее форме (на стадии уже сформированных структурных дефектов) - создание благоприятных условий для роста аксонов в виде обеспечения «свободного» пространства в зоне структурного дефекта путем устранения механических преград (рубцов) по принципу их иссечения в пределах здоровых тканей. Эта идея положена в основу целого ряда исследований по хирургическому созданию структурного дефекта спинного мозга у крыс посредством его полного пересечения скальпелем [43-52], частичной резекции посредством микрохирургических ножниц [41, 53-57]. Частичное пересечение спинного мозга (гемисекция) позволяет сравнить поврежденные и здоровые волокна у одного и того же животного. Например, гемисекция может быть использована для изучения локомоторной функции и ее восстановления на различных уровнях спинного мозга, а также для сравнения неврологического дефицита при контр- и ипсилатеральных поражениях. Кроме того, частичное иссечение спинного мозга приводит к менее тяжелой травме, чем полное иссечение, что в значительной степени облегчает послеоперационный уход за животным [58]. Во многих исследованиях показано, что у крыс восстановление функции спинного мозга происходит в первые 3 недели после нанесения травмы [13, 59], что нельзя связывать только с компенсаторными возможностями и регенерацией поврежденных аксонов. Это также свидетельствует о том, что односторонняя травматизация спинного мозга приводит к обратимой дисфункции спинного мозга за счет того, что посттравматические изменения в ткани не распространяются на участки спинного мозга, противоположные месту повреждения [60]. Также необходимо учитывать, что не всегда удается оценить объем полученных повреждений. В таких случаях для повышения точности эксперимента ученые были вынуждены прибегнуть к методу соматосенсорных вызванных потенциалов [61]. Модель полного пересечения спинного мозга представляет собой диссоциацию между каудальным и ростральным сегментами спинного мозга и выгодна своей легкой воспроизводимостью. После пересечения спинного мозга возникает каскад сложных патофизиологических процессов, которые ингибируют потенциальную регенерацию аксонов и формируют глиальный рубец. Эта модель описана у различных животных, включая крыс, мышей, кошек, собак и приматов [62]. Таким образом, модель полного пересечения спинного мозга наиболее удобна ввиду возможностей тканевой инженерии [63]. В комплексном подходе к лечению ТСМ с использованием скаффолдов, которые также могут нести как целевые молекулы, так и клетки в поврежденный участок спинного мозга, мы можем использовать только модели частичной структурной травмы спинного мозга: они полезны как для оценки регенерации аксонов, так и для последующего функционального восстановления. В большинстве работ экспериментальную травму спинного мозга моделировали на уровне грудного отдела позвоночника [37, 47, 50-54, 57, 64, 65]. Как правило, у людей ТСМ встречаются на шейном уровне, особенно спортивные травмы или травмы, полученные в результате ДТП [48, 49, 55, 56]. В связи с этим последние исследования сосредоточены в основном на моделях травм шейного уровня. В этих моделях по сравнению с моделями травм грудного отдела спинного мозга развивается выраженный неврологический дефицит, что усложняет уход и наблюдение за животными в послеоперационном периоде и резко повышает летальность [66]. С меньшей частотой описаны модели ТСМ на позвонках поясничного уровня [67]. Однако неврологический дефицит, полученный при травме поясничного отдела спинного мозга, в значительной степени возникает в результате повреждения серого вещества, наиболее развитого в поясничном утолщении, нежели из-за повреждения белого вещества. Наблюдения показывают, что повреждение серого вещества может привести к значительному функциональному дефициту, включая параплегию, при отсутствии нарушения основных нисходящих путей. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СКАФФОЛДОВ ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ СПИННОГО МОЗГА Активное развитие аддитивных технологий стереолитографии и тканевой инженерии дало мощный толчок для разработки новых биосовместимых каркасных биодеградируемых трехмерных материалов, которые могут стимулировать регенерацию аксонов и их функциональное восстановление. Большая часть исследований в области ТСМ направлена на уменьшение вторичных повреждений и способствование тканевой регенерации [7]. Наибольшее распространение получает комбинированный подход к лечению ТСМ, объединяющий скаффолды, трансплантацию клеток и доставку биоактивных веществ [33, 68]. Основное требование, предъявляемое к скаффолдам, - биосовместимость, благодаря которой должна создаваться среда, способствующая росту ткани и ее васкуляризации, позволяющая аксонам регенерировать через трансплантат. Изучением биодеградируемых многомерных материалов скаффолдов занимался целый ряд научных коллективов [7, 49, 65, 69-78]. Изучались скаффолды в виде сот [47], нановолокон [49], губок [50]. При этом появлялось множество вопросов, связанных с биосовместимостью материала. Последние работы количественно доказывают, что имплантация скаффолдов в зону структурного дефекта спинного мозга способствует аксональной регенерации. Так, например, в одной из работ уже через месяц после имплантации скаффолда в виде микрофиламентов зарегистрировано появление двигательной функции, а через 2 месяца по завершении эксперимента в структуре скаффолда было достоверно зафиксировано присутствие ремиелинизированных нервных волокон. Их доля составляла 10-25% от общего количества проводящих путей [33]. Еще одним направлением в развитии скаффолдов стало создание каркасов с близкими к тканям глиифизическими свойствами - гидрогелей [54, 57]. Сродство физических свойств импланта и субстрата выявило 3-4-кратное увеличение интенсивности регенеративного роста аксонов в гидрогелях по сравнению с жесткими механическими каркасами [37]. Проведено изучение in vivo гидрогелей с внутрикапиллярной и пористой структурой. Как характерную особенность гидрогелей, авторы отмечали потерю линейности каналов имплантов в хроническом опыте [22]. Одной из прогрессивных технологий производства гидрогелевых имплантов является двухфотонная полимеризация. По мнению авторов, скаффолды, созданные посредством этого инновационного метода, минимизируют повреждения окружающих тканей и создают архитектурную поддержку объема окружающих тканей в посттравматический период, что предотвращает разрушение нейронных сетей в зоне образовавшегося дефекта [79, 80]. Параллельно обеспечению механической поддержки и определению направления роста аксонов ведутся работы по стимулированию регенеративных процессов биоактивными соединениями, присутствующими в каналах скаффолдов. Доказано, что синергизм микроокружения с нейротрофическими факторами способствует более эффективным регенеративным процессам в реабилитационном периоде структурной травмы спинного мозга [81]. В качестве таких ростовых факторов применяют стволовые клетки [7, 42, 44, 82-85], факторы роста нервных клеток [86-89] и даже локально доставляемые магнитные наночастицы [90]. Для направленного роста аксонов предложено использовать многоканальные скаффолды из полилактидкогликолида, содержащие шванновские клетки, полученные от новорожденных крысят [76]. Помещение подобных конструкций в рану спинного мозга взрослых крыс приводило к регенерации поврежденных аксонов спустя месяц после имплантации. Позже было показано, что если вместо шванновских клеток в каналы скаффолда помещать мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, то у крыс с ТСМ наблюдается аналогичный эффект регенерации поврежденных аксонов [83]. Отдельного внимания при разработке многоканальных биодеградируемых скаффолдов заслуживает вопрос об адекватности выбора диаметра каналов [48, 56]. Известно, что у крыс диаметр аксонов варьирует в диапазоне от 1 до 8 мкм с превалированием поперечного сечения 2-4 мкм [91, 92]. При создании структуры внутренних каналов скаффолда необходимо учитывать тот факт, что в процессе регенерации сначала формируется новая миелиновая оболочка, через которую позднее происходит прорастание аксона [93, 94]. Так, увеличение диаметров каналов альгинатного скаффолда на 50% (с 41 до 64 мкм) стимулировало регенеративную активность аксонов более чем в 2 раза [37]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данном обзоре изложены основные подходы и особенности моделирования ТСМ у лабораторных крыс, показана возможность применения биодеградируемых многомерных материалов скаффолдов для восстановления функций поврежденного спинного мозга. Однако каждая модель ТСМ должна быть усовершенствована и адаптирована к типу и форме нового исследуемого скаффолда. Соотношение между количественным восстановлением аксонов и поддержанием двигательной функции после травмы зависит от вида модели, материала и формы скаффолда. Обобщенные данные по основным экспериментальным моделям ТСМ у крыс представлены в таблице. Приведенные данные, к сожалению, не отражают весь спектр разработанных на сегодняшний день моделей ТСМ. Их количество постоянно растет. Достоинства и недостатки каждой модели следует рассматривать в контексте ее этиологического и патогенетического соответствия заболеванию человека. Адекватность модели служит определяющим критерием для оценки возможности экстраполирования полученных выводов на клиническую практику. Вопрос о том, в какой степени результаты, полученные на крысиных биомоделях, можно экстраполировать на организм человека, является одновременно и важнейшим, и сложнейшим при экспериментальном моделировании с использованием лабораторных животных [95, 96]. Вопрос об адекватности той или иной экспериментальной биомодели процессам, протекающим в организме человека, продолжает оставаться открытым для большинства животных моделей.

Об авторах

A. Н. Минаков

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: telegin@bibch.ru
Россия

A. С. Чернов

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: telegin@bibch.ru
Россия

Д. С. Асютин

Национальный научно-практический медицинский исследовательский центр нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: telegin@bibch.ru

Н. A. Коновалов

Национальный научно-практический медицинский исследовательский центр нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: telegin@bibch.ru
Россия

Г. Б. Телегин

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: telegin@bibch.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы