Адаптация вируса болезни Ньюкасла к клеточным линиям с целью повышения онколитических свойств

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Виротерапия - это экспериментальный метод таргетной терапии злокачественных заболева ний с использованием онколитических вирусов, в том числе вируса болезни Ньюкасла (ВБН) (се мейство Paramyxoviridae, род Avulavirus) для се лективного уничтожения опухолевых клеток [1]. Онколитические вирусы избирательно инфицируют опухолевые клетки и используют их активирован ный синтетический аппарат для репликации, что вы зывает цитотоксическое действие (ЦТД) и приводит к гибели клеток [2]. Нормальные здоровые клетки остаются при этом неповрежденными за счет разви тия раннего противовирусного интерферонового от вета, который предотвращает репликацию вирусного генома [3]. Вирус болезни Ньюкасла привлек к себе внимание в качестве потенциального онколитическо го вируса в середине XX века и на сегодняшний день зарекомендовал себя как безопасный и эффективный противоопухолевый агент [4]. Штаммы ВБН для виротерапевтических иссле дований делят на литические и нелитические на ос новании свойств F-белка [5]. И литические, и нели тические штаммы могут действовать как мощные противораковые агенты. Преимущество литических штаммов обусловлено созданием инфекционного по томства за счет множественных циклов реплика ции и распространении цитотоксического эффекта в опухолевой ткани. Нелитические штаммы выпол няют только один цикл репликации. Потомство не литических штаммов содержит неактивные вариан ты F-белка, а противоопухолевые эффекты связаны преимущественно со стимуляцией иммунного отве та [6]. Значительная часть исследований в области ви ротерапии посвящена созданию рекомбинантных штаммов для усиления противоопухолевых свойств вирусов. Однако разработка вирусных конструкций сопряжена с необходимостью контроля биологиче ских свойств полученного вируса, его тропности, эли минации возможного инсерционного мутагенеза и ре комбинаций, связанных с восстановлением свойств изначально патогенных для человека вирусов [7, 8]. Природный онколитический потенциал штаммов ВБН, выделенных от диких птиц, позволяет исполь зовать их для виротерапии без сложных модифика ций генома. Различные лентогенные (низкопатоген ные) и мезогенные (средней патогенности) штаммы ВБН изучали с 1960-х годов in vitro и in vivo, а так же в клинических исследованиях на онкологических больных [9]. Несмотря на популярность генно-инженерных методов, применяемых при разработке вирусных конструкций для виротерапии, природные немо дифицированные штаммы также могут выступать мощным противоопухолевым агентом. Отмечено, что природные штаммы ВБН, в число которых вхо дят и хорошо изученные и участвовавшие в клини ческих испытаниях штаммы 73-T, MTH-68, PV701 и NDV-HUJ [10], проявляют высокую онколитиче скую активность. Все эти штаммы объединяет при надлежность к литическому типу вируса, который напрямую убивает клетки. Кроме того, вирулентные мезогенные штаммы способны индуцировать в опу холевых клетках более мощный апоптотический от вет, в отличие от апатогенных и низковирулентных штаммов [11, 12]. Нерекомбинантный, природный аттенуированный штамм PV701, полученный от мезогенного штамма MK107 (Gaithersburg, США) [13], обладает противо опухолевой активностью на широком спектре опухо лей эпителиального, нейроэктодермального и мезен химального происхождения [10]. Другой литический штамм MTH-68/H, происходящий от природного штамма Hertfordshire (Herts’33), оказывает цитоток сический эффект на различных опухолевых клетках человека [10], а системное или локорегиональное вве дение вируса приводит к частичной, а в некоторых случаях полной регрессии первичных и метастатиче ских опухолей [14, 15]. Адаптированный природный штамм 73-T вызывает образование синцития и ги бель широкого ряда злокачественных клеток in vitro и in vivo [16, 17]. При этом природные мезогенные штаммы, оказывающие цитотоксическое действие на злокачественные клетки, безопасны для нормаль ных клеток человека [12, 16-18]. Изучение механизма противоопухолевого цитоток сического действия вирусных изолятов привело к по явлению предположения о возможности получения штамма с еще более выраженными литическими свой ствами в ходе адаптации вируса к культуре клеток [19]. В процессе адаптации вирусов могут возникать варианты, способные к более эффективному размно жению в клетках-хозяевах, чем вирус дикого типа. С одной стороны, есть опасение, что при увеличении инфекционности вируса к адаптированным клеткам будет происходить снижение его вирулентности [20, 21], что, вероятно, может отрицательно сказаться на онколитических свойствах. С другой стороны, адап тация вируса к конкретной клеточной линии может приводить к усилению цитотоксического потенциала адаптированного вируса на этих клетках [22]. Так, полученный методом серийных (n = 38) пасса жей на клетках асцитной карциномы Эрлиха штамм на основе природного MD20Z (США, 1945) проверили на модели in vivo. Общая недельная выживаемость мышей c асцитными опухолями после терапии ви русом поздних пассажей увеличивалась с 0 до 63.6%, при этом вирус активно реплицировался в опухоле вых клетках и вызывал цитотоксический эффект быстрее, чем природный штамм [23]. Cassel W.A. и Garrett R.E. в своих исследованиях подтвердили усиление онколитического эффекта после адапта ции вируса ВБН 379-SI, полученного из природного штамма MD20Z методом серийных (n = 73) пассажей на клетках асцитной карциномы Эрлиха in vitro и за тем 13 пассажей in vivo [24]. В дальнейшем в США был проведен ряд успешных клинических испыта ний аллогенных и аутологических вакцин на основе штамма ВБН 73-T при метастатической меланоме [25]. Таким образом, учитывая данные, подтвержда ющие успешную адаптацию природных штаммов с усиленным противоопухолевым эффектом при по следовательном пассировании, мы изучили адапта цию природных штаммов ВБН различного патоти па на линиях опухолевых клеток человека с целью проверки эффективности цитотоксических свойств, полученных при пассировании штаммов. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Культуры клеточных линий и штаммы вируса болезни Ньюкасла В работе использованы перевиваемые клеточные культуры: Vero - линия клеток эпителия почки африканской зеленой мартышки, HCT116 - линия клеток колоректального рака (Государственный на учный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская обл.); HeLa - линия клеток рака шейки матки (НИИ клинической и экспериментальной лимфологии, Новосибирск); MCF7 - линия клеток аденокарциномы молоч ной железы (Институт цитологии РАН, Санкт- Петербург); A549 - линия клеток немелкоклеточного рака легкого (Клиника иммунопатологии Научно исследовательского института фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск). Для культивирования клеток Vero и опухолевых культур использовали ростовую среду ДМЕМ, со держащую 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 50 ед/мл гентамицина. Клетки культивировали в культуральных флаконах (25 см2) в стандартных условиях (при 37°С в атмосфере с 5% содержанием CO2). Штаммы вируса болезни Ньюкасла В работе использовали четыре штамма ВБН: два ви рулентных мезогенных штамма ВБН, выделенных на территории РФ от сизых голубей - NDV/Altai/ pigeon/770/2011 [26] и NDV/Altai/pigeon/777/2010 [27], и два лентогенных штамма - NDV/mallard/ Amur/264/2009 и NDV/teal/Novosibirsk_ region/320/2010, выделенных от кряквы и чирка свистунка соответственно. Подготовка штаммов вируса болезни Ньюкасла Штаммы вируса были наработаны в аллантоисной жидкости 10-дневных развивающихся куриных эмбрионов. Наличие вируса подтверждали в реак ции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами петуха и определяли титр гемагглютинина каждого штамма вируса по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ [28]. Титрование вируса болезни Ньюкасла в культуре клеток Vero (ТЦД50) Титрование вируса болезни Ньюкасла на чувстви тельной к цитопатическому действию ВБН культуре клеток Vero проводили согласно [29]. Клеточную су спензию рассевали в ростовой среде на 96-луночные планшеты в концентрации 30000 клеток на лунку и культивировали в стандартных условиях. Суточный монослой клеток отмывали раствором Хенкса и вносили 10-кратные разведения вируса на поддерживающей среде Игла-MEM с добавлени ем 1% ФБС. Планшеты инкубировали в стандарт ных условиях в течение 1 ч для адсорбции вируса, затем меняли вируссодержащую жидкость (ВСЖ) на поддерживающую среду. Ежедневно под микро скопом контролировали состояние монослоя клеток на наличие ЦТД. Окончательный учет титрования проводили на 4-е сутки. Инфекционный титр вируса для культуры клеток Vero рассчитывали по мето ду Кербера в модификации Ашмарина и выражали в lgTЦД50/мл [30]. Последовательные пассирования штаммов ВБН на перевиваемой клеточной линии Vero и опухолевых клеточных линиях человека Подготовку клеточной культуры и инфицирова ние 10-кратными разведениями вируса проводили так же, как при методе титрования. На 4-е сутки по сле инфицирования подсчитывали инфекционный титр и собирали ВСЖ крайних разведений. После чего проводили следующий пассаж с инфицирова нием клеток Vero собранным крайним разведением с использованием того же метода. Таким образом проводили 11 пассажей и рассчитывали инфекцион ный титр каждого пассажа. Оценка жизнеспособности клеточных линий после инфицирования штаммами ВБН колориметрическим методом (MTT-тест) Жизнеспособность клеток всех опухолевых линий че ловека определяли с помощью MTT-теста на 4-е сут ки после инфицирования штаммами вируса. Суточный монослой опухолевых клеток на 96-луночном план шете отмывали раствором Хенкса и инкубировали с вирусами (титр 8 ГАЕ на 10000 клеток) в течение 1 ч в стандартных условиях. Далее клетки промывали раствором Хенкса и инкубировали в 200 мкл поддер живающей среды в течение 4 суток в стандартных ус ловиях. Контрольные опухолевые клетки без вируса инкубировали в поддерживающей среде. На 4-е сутки клетки отмывали раствором Хенкса. Рабочий раствор MTT массовой концентрации 5 мг/ мл на основе поддерживающей среды добавляли в объеме 100 мкл в лунку и инкубировали в течение 4 ч в стандартных условиях. Далее меняли раствор МТТ на ДМСО (150 мкл на лунку) и инкубировали в течение 1 ч в темноте при комнатной температу ре. Оптическую плотность измеряли при длине вол ны 540 и 630 нм на микропланшетном фотометре Lonza Biotek ELX808 Absorbance Microplate Reader (США). Жизнеспособность клеток оценивали по со отношению относительной доли живых и контроль ных клеток, не обработанных вирусом, по формуле: (V540 - V630)/(K540 - K630) × 100%, где V - показатели зараженных вирусом лунок, а K - показатели кон трольных лунок. Инфицирование клеток опухолевых линий человека мезогенными штаммами ВБН для оценки репликативной активности вируса на разных опухолевых клетках Репликативную активность штаммов ВБН на разных опухолевых клеточных линиях оценивали методом титрования на клетках HCT116, HeLa, A549, MCF7 после инфицирования штаммами ВБН. Клетки опухолевых линий человека и контроль ную культуру клеток Vero высевали в ростовой среде в культуральные флаконы (25 см2) и культивировали в стандартных условиях. Суточный монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса и инкубиро вали с вирусами в объеме 1 мл (титр 8 ГАЕ на 10000 клеток) с адсорбцией в течение 45 мин в стандарт ных условиях. Затем дважды промывали раствором Хенкса и добавляли свежую поддерживающую сре ду в объеме 10 мл и инкубировали в стандартных ус ловиях. На 3, 6, 24, 48, 72 ч после заражения клеток штаммами ВБН инфекционный титр культуральной среды определяли титрованием в соответствующих опухолевых и модельной клеточной культуре обще принятым методом. Статистический анализ данных Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0. На осно вании t-критерия по таблице Стьюдента определяли вероятность различия сравниваемых средних вели чин. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Штаммы вируса болезни Ньюкасла были наработа ны в аллантоисной жидкости 10-дневных развива ющихся куриных эмбрионов. Присутствие вируса в аллантоисной жидкости подтверждено в реакции РГА с эритроцитами петуха, инфекционный титр ви руса определен на клеточной линии Vero (табл. 1). Показан высокий титр мезогенных штаммов, выде ленных от сизых голубей, в реакции РГА и при ти тровании на клетках Vero. На следующем этапе использовали две возможных системы повышения противоопухолевых свойств ви руса болезни Ньюкасла. Первая система заключа лась в пассировании штаммов ВБН на перевиваемой чувствительной клеточной линии Vero с адаптацией вируса к данной линии и последующей проверкой жизнеспособности опухолевых клеточных линий по сле инфицирования адаптированными штаммами ВБН. Клетки Vero не синтезируют ИФНα и ИФНβ, что позволяет вирусу болезни Ньюкасла беспрепят ственно размножаться с высвобождением нового ви русного потомства и формировать ЦТД. Вторая система заключается в адаптации штам мов к опухолевым линиям с оценкой динамики изме нения жизнеспособности опухолевых клеток при ин фицировании адаптированными штаммами вируса на поздних пассажах. Согласно первой схеме, за 11 пассажей на клеточ ной линии Vero мезогенные штаммы NDV/Altai/ pigeon/770/2011 и NDV/Altai/pigeon/777/2010, титр которых изначально был на несколько порядков выше, чем у лентогенных штаммов, и составлял 6.7 lgТЦД50/мл после первого пассажа, повысился до 7.5 и 7.7 lgТЦД50/мл соответственно (табл. 2, рис. 1). Не удалось достичь значения титра лентогенных штаммов NDV/mallard/Amur/264/2009 и NDV/teal/ Novosibirsk_region/320/2010, схожего с титром мезо генных штаммов на поздних пассажах, несмотря на то, что титры выросли с 3.6 до 5.0 lgТЦД50/мл и с 3.6 до 4.3 lgТЦД50/мл соответственно. Вероятно, на способность вируса эффективно реплицироваться в клеточной культуре с образованием ЦТД влияет не только на личие «вирулентной» последовательности в сайте рас щепления F-белка, но и принадлежность к патотипу, напрямую связанная с цитолитической способностью, так как все исследуемые штаммы содержат «виру лентную» последовательность сайта, но только NDV/ Altai/pigeon/770/2011 и NDV/Altai/pigeon/777/2010 относятся к мезогенному типу [26, 27]. В процессе адаптации к клеточной линии Vero титр всех исследуемых штаммов вируса увеличивался и после 7-8-го пассажей не изменялся. Помимо уве личения инфекционного титра при постановке ТЦД50 отмечено нарастание морфологических изменений клеточного монослоя в культуре. При инфицировании мезогенными штаммами вируса на 1-3-м пассажах на Vero на 2-3-й день культивирования в клеточной культуре наблюдается цитотоксическое действие вируса с образованием областей с округлившимися погибшими клетками, которые открепляются от по верхности культурального планшета с распростра нением ЦТД на весь монослой к 4-м суткам. На по следующих 5-11-ти пассажах помимо погибших округлившихся клеток, стандартного проявления цитотоксического действия вируса, в процессе вирус ной репликации в клеточном монослое на 3-4-е сутки образуются тяжи клеточных агломератов. К 7-10-му пассажу на 2-3-и сутки появляются структуры, по хожие на синцитий, характерные для ЦТД при ин фицировании парамиксовирусами (рис. 2). При этом, несмотря на различие в проявлении ЦТД на разных пассажах, максимальное поражение монослоя состав ляло примерно до 90% независимо от пассажа, а де структивные изменения были наиболее выражены, как правило, на 4-е сутки после инфицирования. Образование синцития, что характерно для куль тивирования разных представителей семейства па рамиксовирусов, отмечено только в единичных слу чаях: штамма NDV/Altai/pigeon/770/2011 на 7-м пассаже на клетках Vero (рис. 2В) и штамма NDV/ mallard/Amur/264/2009 на 10-м пассаже на 2-е и 3-и сутки соответственно, но не наблюдалось при пер вичном пассировании вируса на клетках Vero. Не отмечено морфологических изменений моно слоя в процессе пассирования лентогенных штам мов NDV/mallard/Amur/264/2009 и NDV/teal/ Novosibirsk_region/320/2010, кроме одного случая образования синцития в монослое. Адаптированные мезогенные штаммы NDV/ Altai/pigeon/770/2011, NDV/Altai/pigeon/777/2010 и лентогенный штамм NDV/mallard/Amur/264/2009 на 10-м пассаже использовали для сравнительной оценки противоопухолевых свойств на перевиваемых линиях опухолевых клеток - HCT116, HeLa, A549, MCF7. Множественность инфицирования опухолевых клеточных линий составила 8 ГАЕ/10000 клеток. Выживаемость клеточных линий после инфициро вания оценивали в MTT-тесте на 4-е сутки (рис. 3). Сравнение жизнеспособности линий опухолевых клеток, инфицированных штаммами вируса 1-го и 10-го пассажей на линии клеток Vero, не выяви ло значительного увеличения противоопухолевой активности ВБН, за исключением клеточной линии HCT116, жизнеспособность клеток которой снизи лась на 5.0 и 9.9% после инфицирования NDV/Altai/ pigeon/770/2011 и NDV/Altai/pigeon/777/2010 в 10-м пассаже на Vero соответственно. На следующем этапе работы штаммы адаптиро вали на каждой опухолевой линии, чтобы проверить увеличится ли их противоопухолевый потенциал при адаптации на конкретной опухолевой линии. Определена динамика репликативной активности мезогенных штаммов на всех опухолевых клеточных линиях, в том числе на линии клеток Vero в качестве положительного контроля (рис. 4). Титрование ВСЖ, собранной на 3, 6, 24, 48 и 72 ч, штамма NDV/Altai/ pigeon/770/2011 показало динамику роста титра вируса - наибольший титр на 3-и сутки получен на кле точной культуре Vero, наименьший - на клеточной линии HCT116. Схожие данные получены для штам ма NDV/Altai/pigeon/777/2010, а наименьший титр получен на клеточных линиях HCT116 и MCF7. Штаммы NDV/Altai/pigeon/770/2011 и NDV/ Altai/pigeon/777/2010 сходны по своим параметрам и репликативной активности, поэтому для дальней шей работы по адаптации вируса к клеточным опухо левым линиям с целью повышения онколитического потенциала был выбран один штамм - NDV/Altai/ pigeon/770/2011. Этот штамм пассировали на опухо левых клеточных линиях до 11-го пассажа как опи сано выше (табл. 3, рис. 5). Увеличение титра наблюдали при пассировании вируса (пассажи 1-11) на клетках: HCT116 - на 1.9 lgТЦД50/мл, HeLa - на 0.6 lgТЦД50/мл, A549 - на 0.9 lgТЦД50/мл, MCF7 - на 0.6 lgТЦД50/мл. Однако только в случае клеточной линии HCT116 можно го ворить о нарастании титра почти на 2 порядка в ре зультате адаптации штаммов. Жизнеспособность клеточных опухолевых линий после инфицирования штаммами 10-го пассажа, наработанными на опу холевых клетках HCT116, HeLa и A549 снизилась на 1.6, 4.1 и 6.0% соответственно, а в случае клеток MCF7 повысилась на 0.8% (рис. 6). Возможно, для адаптации на опухолевых клетках необходима другая методика, включающая культи вирование в более высоких пассажах или пассирова ние в аллантоисной жидкости развивающихся кури ных эмбрионов и в комбинации in vitro. Таким образом, прямая взаимосвязь между ди намикой наработки вируса в опухолевых клеточ ных линиях и эффективностью противоопухолево го действия путем прямого онколизиса этих клеток, вероятно, отсутствует, что может подтверждать существование различий в чувствительности каж дой конкретной клеточной линии к онколитическо му действию вируса. Так, удалось добиться сниже ния жизнеспособности клеток HCT116 на 5 и 10% после их инфицирования штаммами NDV/Altai/ pigeon/770/2011 и NDV/Altai/pigeon/777/2010, ко торые пассировали на перевиваемой культуре кле ток Vero. Возможно, клеточная линия HCT116 более чувствительна к инфицированию адаптированными штаммами и для усиления эффекта необходимо бо лее длительное пассирование штаммов, возможно, в комбинации с пассированием в аллантоисной жид кости развивающихся куриных эмбрионов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Адаптация вируса может служить способом повы шения инфекционного титра для последующего ис пользования вируса в качестве противоопухолевого агента с более выраженными онколитическими свой ствами. Чувствительная культура клеток Vero может использоваться для наработки природных штаммов ВБН. Адаптация штаммов ВБН на клеточной культуре Vero (11 пассажей) приводит к статистически зна чимому повышению титра вируса независимо от его вирулентности и уровня начального титра: средний инфекционный титр повысился на 0.8 и 1.1 lgТЦД50/ мл у мезогенных штаммов и на 0.7 и 1.4 lgТЦД50/мл у лентогенных. Снижение жизнеспособности опухолевых клеток, чувствительных к ВБН в 1-м пассаже, после инфици рования адаптированным на этих линиях штаммом NDV/Altai/pigeon/770/2011 в 11-м пассаже и невос приимчивость резистентной линии MCF7 как к ВБН в 1-м пассаже, так и к ВБН в 11-м пассаже на MCF7, свидетельствуют о возможности повышения онколи тических свойств путем адаптации штаммов и необ ходимостью оптимизации пассирования.

Об авторах

K. С. Юрченко

Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: xenia7yurchenko@gmail.com
Россия

И. Цзин

Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Email: xenia7yurchenko@gmail.com
Россия

A. M. Шестопалов

Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины

Email: xenia7yurchenko@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы