Роль урокиназной системы в многоуровневой регуляции ниш стволовых клеток

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В настоящее время стволовые клетки (СК) рассматриваются как важный регулятор клеточного гомеостаза и участник регенерации/репарации всех тканей организма. СК уже применяют в практической медицине, однако получение биомедицинских продуктов с определенными характеристиками остается нерешенной задачей в связи со сложными, не до конца изученными путями регуляции, определяющими их уникальные свойства. Регуляция функций СК в тканях осуществляется при участии определенного микроокружения, образующего специализированные структуры - «клеточные ниши» [1, 2]. Это микроокружение формируется на основе взаимодействий между стволовыми и соседними дифференцированными клетками, а также компонентами внеклеточного матрикса (ВКМ) за счет активации/ингибирования различных сигнальных путей (Notch, Wnt, TGF-β, Sonic Hedgehog и др.) посредством прямых межклеточных взаимодействий, высвобождения внеклеточных везикул и секреции факторов роста, цитокинов, хемокинов и различных протеаз [3]. Важным звеном этой сложной регуляции является урокиназная система, представленная активатором плазминогена урокиназного типа, или урокиназой (uPA), ее рецептором (uPAR/CD87) и двумя ингибиторами (PAI-1 и PAI-2). Уникальность этой системы заключается в наличии урокиназного рецептора, закрепленного на мембране клетки посредством гликозилфосфатидилинозитола, что позволяет ему быть подвижным в мембранном бислое и локально концентрировать протеолитическую активность урокиназы в направлении движения клетки. Запускаемый урокиназой каскад протеолитических реакций, включающих локальное образование плазмина и активацию матриксных металлопротеаз, способствует разрушению ВКМ на пути движущейся клетки, активации факторов роста и высвобождению факторов роста, секвестрированных в матриксе [4-7]. Однако помимо активации внеклеточного протеолиза большинство клеточных ответов, модулируемых урокиназной системой, требует трансмембранной сигнализации. Эта сигнализация опосредуется взаимодействием компонентов этой системы со множеством вне-/внутриклеточных белков и мембранных рецепторов, обеспечивающих передачу сигналов на внутриклеточные пути, регулирующие различные функции клетки. Компоненты урокиназной системы представлены в нишах стволовых клеток костного мозга [8], поперечно-полосатой мускулатуры [9], нейральных клеток [10], опухолевых клеток [11]. Они принимают участие в регуляции таких важных биологических процессов, как воспаление, ангиогенез, миогенез, ремоделирование белков внеклеточного матрикса, метастазирование и рост опухолей. В данном обзоре рассмотрены возможные пути участия урокиназной системы в регуляции фенотипа, клеточной подвижности, деления, программируемой клеточной гибели стволовых/прогениторных клеток, что является актуальным для разработки подходов для направленного воздействия на их свойства. УРОКИНАЗНАЯ СИСТЕМА: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ Урокиназа представляет собой внеклеточную сериновую протеазу с узкой субстратной специфичностью, принимающую участие в превращении плазминогена в плазмин. В организме человека урокиназа секретируется различными типами клеток - моноцитами/макрофагами [12, 13], опухолевыми клетками [14-16], фибробластами [17, 18], гладкомышечными [19, 20] и эндотелиальными клетками [21, 22]. Урокиназа состоит из 411 аминокислотных остатков (молекулярная масса 53 кДа) [23] и секретируется клетками в виде одноцепочечного белка (sc-uPA), состоящего из трех доменов: N-концевого «ростового» домена (РД), гомологичного по структуре эпидермальному фактору роста (аминокислоты 9-45), крингл-домена (КД, аминокислоты 45-134) и С-концевого протеолитического домена (ПД, аминокислоты 144-411) (рис. 1). Функция «ростового» домена заключается в высокоаффинном взаимодействии с рецептором урокиназы на поверхности клеток [24]. Протеолитический домен осуществляет превращение плазминогена в плазмин и активацию некоторых факторов роста и матриксных металлопротеаз [25]. Функция крингл-домена в настоящее время окончательно не выяснена, однако считается, что он принимает участие в стимуляции миграции клеток под действием урокиназы [26], стабилизирует взаимодействие урокиназы с рецептором [27], участвует в транспорте урокиназы в ядро [28]. Урокиназный рецептор uPAR/CD87 был впервые идентифицирован как рецептор к активатору плазминогена урокиназного типа на поверхности моноцитов человека [29]. uPAR обнаружен также на эндотелиальных клетках [30], нейтрофилах [31], гладкомышечных клетках [32], клетках трофобласта плаценты [33], а также на клетках различных опухолевых линий [34-37]. uPAR/CD87 сверхэкспрессируется клетками крови при воспалении [38, 39]. uPAR, принадлежащий к семейству Ly-6 [40], представляет собой одноцепочечный высокогликозилированный белок [41], закрепленный на мембране клетки посредством гликозилфосфатидилинозитола, ковалентно связанного с третьим, С-концевым, доменом рецептора [42]. uPAR имеет молекулярную массу 55-60 кДа и состоит из 313 аминокислотных остатков, образующих три структурно гомологичных домена [43]. Первый домен рецептора играет основную роль в связывании с урокиназой и взаимодействует с ее «ростовым» доменом. Методом кристаллографии показано, что при связывании с лигандом урокиназный рецептор приобретает более компактную форму, так как при его взаимодействии с урокиназой происходит сближение первого и третьего доменов рецептора. Одним из важных процессов, регулирующих функцию uPAR, является протеолитическое расщепление между первым и вторым доменами (рис. 2) такими протеазами, как плазмин, матриксные металлопротеазы и сама урокиназа [44, 45]. После расщепления uPAR теряет способность связывать урокиназу, но приобретает возможность регулировать миграцию клеток независимо от нее [46]. Как полноразмерная, так и расщепленные формы (c-uPAR) урокиназного рецептора могут удаляться с поверхности мембраны под действием протеаз или фосфолипазы С, специфичной к гликозилфосфатидилинозитолу [47-52]. При этом образуются «растворимые» формы рецептора - полноразмерная (su-uPAR) и расщепленная/урезанная (su-c-uPAR), которые циркулируют в плазме крови и служат маркерами некоторых воспалительных или иммунологических заболеваний. Важно отметить, что «растворимая» расщепленная/урезанная форма урокиназного рецептора является сильным хемоаттрактантом для клеток (нейтрофилов, моноцитов, макрофагов), экспрессирующих рецепторы к бактериальному пептиду N-формил-метиониллейцил-фенилаланину (fMLP) [53, 54]. Высокий уровень протеолитической активности урокиназы может оказаться губительным для клеток. В качестве механизмов, регулирующих уровень внеклеточного протеолиза, клетки синтезируют специфические белковые ингибиторы активаторов плазминогена - PAI-1, PAI-2, протеазный нексин-1 и инактиватор белка С [55-58]. Они относятся к группе аргинин-серпиновых ингибиторов. Суть их взаимодействия с ферментом заключается в имитации субстрата, что приводит к стабильному связыванию с двухцепочечной формой фермента путем образования ковалентного комплекса фермент-ингибитор в стехиометрии 1 : 1 и его инактивации [59]. Взаимодействие с одноцепочечной формой урокиназы не приводит к формированию ковалентного комплекса. PAI-1 представляет собой одноцепочечный гликопротеин массой около 45-50 кДа. После секреции PAI-1 быстро инактивируется в результате конформационных перестроек и становится неспособным связываться с урокиназой. Для активации ингибитора необходимо взаимодействие неактивной молекулы PAI-1 с физиологическими кофакторами - белком внеклеточного матрикса витронектином или гепарином [60]. Иммобилизованный на матриксе PAI-1, в отличие от его свободной формы, может долгое время оставаться активным [61]. Активная форма PAI-1 взаимодействует как со свободной урокиназой, так и со связанной со своим рецептором, ингибируя процессы внеклеточного протеолиза [62]. Одноцепочечная неактивная форма урокиназы, обладающая незначительной протеолитической активностью, также ингибируется PAI-1, но с гораздо меньшей скоростью [63]. Активность PAI-1 может регулироваться несколькими способами. Урокиназа способна расщеплять и инактивировать PAI-1 [64]. Кроме того, при связывании PAI-1 с uPA/uPAR образуется тройной комплекс, который немедленно интернализируется клетками [65, 66]. Этот процесс запускается при взаимодействии тройного комплекса с эндоцитирующими рецепторами семейства рецептора липопротеинов низкой плотности. В образовавшихся эндосомах урокиназа и PAI-1 деградируют в лизосомах, а uPAR и эндоцитирующий рецептор возвращаются на поверхность клетки, при этом инициируется внутриклеточная сигнализация и перестройка цитоскелета. Таким образом, помимо способности регулировать протеолитическую активность, PAI-1 вовлечен в регуляцию процессов миграции и адгезии клеток. Ингибитор урокиназы PAI-2 представляет собой одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 47 кДа [67]. Его способность ингибировать урокиназу намного меньше, чем у PAI-1. Так, константа связывания урокиназы, взаимодействующей с рецептором, с PAI-1 в 15 раз больше, чем с PAI-2 [63]. Долгое время считалось, что ингибирование урокиназы является основной функцией PAI-2. Однако оказалось, что только небольшое количество вновь синтезированного ингибитора секретируется в виде гликозилированного полипептида во внеклеточное пространство [68]. Основная часть остается внутри клеток и выполняет функцию защиты от апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли-α (TNF-α) [69, 70], а также регулирует уровень секреции интерферона-α/β [71]. Секретируемая форма PAI-2 участвует в регуляции процессов фибринолиза и перестройки тканей. Цитозольная форма PAI-2 играет важную роль во внутриклеточном протеолизе, вовлеченном в регуляцию процессов апоптоза и воспаления. УРОКИНАЗНАЯ СИСТЕМА И ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА Костный мозг содержит популяцию гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), способных к самообновлению и дифференцировке во все форменные элементы крови и некоторые клетки других типов. В костном мозге ГСК экспрессируют на своей поверхности uPAR и локализуются в «клеточных нишах», основу которых составляют остеобласты, эндотелиальные клетки и мезенхимальные стволовые клетки [72, 73]. Эти клетки являются малодифференцированными и характеризуются низким уровнем пролиферации/апоптоза за счет остановки клеточного цикла в фазе G0/G1. Однако у мышей, лишенных uPAR, ГСК активно вступают в клеточный цикл, дифференцируются и выходят в системный кровоток, что приводит к сокращению их пула и указывает на роль рецептора урокиназы в поддержании низкодифференцированного состояния ГСК [74]. Наряду с этим, uPAR определяет посттрансплантационную выживаемость ГСК и эффективность восстановления гемопоэза [74]. ГСК, полученные от трансгенных мышей uPAR-/-и трансплантированные спленэктомированным мышам дикого типа после радиационного облучения (9.5 Гр), имели сниженные показатели интеграции в костный мозг и выживаемости на протяжении 2 недель наблюдения в сравнении с ГСК мышей дикого типа. Одним из возможных молекулярных механизмов указанных эффектов может быть взаимодействие uPAR с интегринами, в частности с α4β1-интегрином, который регулирует миграцию и адгезию ГСК к фибронектину и VCAM-1 во время их хоуминга и приживления в костном мозге [74-78]. Известно, что функция интегрина α4β1 зависит от интактного uPAR, так как только интактный урокиназный рецептор взаимодействует с интегринами [79, 80]. Протеолитическое расщепление uPAR с удалением D1-домена снижает α4β1-опосредованную клеточную адгезию [81]. При отсутствии урокиназного рецептора у трансгенных мышей нарушается опосредованная интегрином α4β1 адгезия ГСК в костном мозге, что, вероятно, приводит к нарушению их интеграции в ткань костного мозга. Определенную роль в процессе высвобождения ГСК из костного мозга могут играть растворимые формы урокиназного рецептора (su-uPAR), уровень которых значительно возрастает в плазме крови во время мобилизации ГСК гранулоцитарно-колониестимулирующим фактором (G-CSF) [82, 83]. su-uPAR может способствовать миграции ГСК в кровоток как напрямую, так и косвенно, путем подавления активности рецептора CXCR4, отвечающего за удержание клеток в нише костного мозга. В экспериментах in vivo показано, что пептиды, разработанные на основе «расщепленной/урезанной» формы su-c-uPAR, способны индуцировать выход мышиных CD34+ ГСК из костномозговых депо в той же степени, что и G-CSF [82]. Таким образом, урокиназный рецептор обеспечивает как поддержание ГСК в состоянии покоя в нише костного мозга, так и регулирует их высвобождение из ниши, вероятно, посредством нескольких механизмов, включающих взаимодействие с интегринами и прямое хемотактическое действие. УРОКИНАЗНАЯ СИСТЕМА И ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ В основе патогенеза многих сердечно-сосудистых заболеваний лежит дисфункция и повреждение эндотелиального слоя сосудистой стенки, выполняющего важную роль в регуляции функционирования сердечно-сосудистой системы. Репарация эндотелиального слоя и постнатальный васкулогенез [84] обеспечиваются за счет циркулирующих эндотелиальных прогениторных клеток (ЭПК), высвобождающихся из костномозговых ниш. При повреждении сосуда активируются синтез и секреция широкого спектра цитокинов и хемокинов (VEGF, IGF2, MCP-1 IL-8, брадикинин, MIF, SDF-1 и др.), создающих градиент внутри сосудистой стенки и способствующих хоумингу ЭПК в область повреждения за счет механизмов адгезии и трансэндотелиальной миграции. Известно, что урокиназная система участвует в регуляции процессов ангио-артериогенеза при ишемии и воспалении [85-87], в частности, регулируя направленную миграцию ЭПК [88, 89], экспрессирующих высокие уровни uPA и uPAR [90]. Причем в отсутствие стимуляции рецептор урокиназы в ЭПК локализуется на липидных рафтах и отсутствует в кавеолах, но при стимуляции VEGF в них повышается экспрессия кавеолина-1 и uPAR, происходит сборка кавеол и интернализация в них uPAR [91]. Нарушение сборки кавеол в ЭПК путем обработки метил-бетациклодекстрином (β-MCD) или ингибированием кавеолина-1 не вызывает перераспределения uPAR на клеточной мембране, в то же время подавление экспрессии uPAR нарушает нормальную организацию кавеолы. Эти данные указывают на участие uPAR в организации сборки кавеолярных рафтов в ЭПК, что может определять поведение этих клеток в сосудистой стенке [92]. Так, инициирующим событием в миграции/дифференцировке ЭПК является стимуляция кавеолинзависимого фосфорилирования ERK1/2 под действием VEGF, а целостность кавеолы влияет на ангиогенные свойства ЭПК [93]. VEGF повышает экспрессию кавеолина-1 и uPAR в ЭПК и запускает перераспределение uPAR в кавеолах, что увеличивает инвазию ЭПК и способствует морфогенезу капилляров. Подавление экспрессии uPAR с помощью антисмысловых олигонуклеотидов нарушает образование кавеолы, подавляет инвазию ЭПК и капиллярогенез [93]. Таким образом, образование кавеолярного uPAR считается критическим шагом в реализации ангиогенных свойств ЭПК. Секреция uPA и предшественника матриксной металлопротеазы-2 (про-MMP-2) также возрастает в ЭПК при стимуляции VEGF или TNF-α [93], а ингибирование uPA или uPAR моноклональными антителами значительно уменьшает пролиферацию, миграцию и формирование этими клетками капилляроподобных структур in vitro [93, 94]. Недавно было показано, что определенная роль в регуляции миграции ЭПК принадлежит аутофагии [95], которая через сигнальный путь mTOR-P70S6K регулирует экспрессию uPA и матриксных металлопротеаз, осуществляющих протеолиз белков внеклеточного матрикса, необходимый для миграции ЭПК в зону повреждения. Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют о круциальной роли урокиназы и ее рецептора в обеспечении хоуминга в поврежденный сосуд и ангиогенных свойств циркулирующих эндотелиальных прогениторных клеток. УРОКИНАЗНАЯ СИСТЕМА И ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ ПОПЕРЕЧНО-ПОЛОСАТОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ Сателлитные клетки (СТК) формируют стабильный самообновляющийся пул в скелетных мышцах взрослого организма. Более четырех десятилетий назад с помощью электронной микроскопии было показано, что стволовые клетки поперечно-полосатой мышцы представляют собой одноядерные клетки, расположенные между сарколеммой мышечного волокна и базальной пластинкой, которая окружает это волокно [96]. Такое анатомическое расположение выступает в качестве основы «клеточной ниши», в которой сателлитные клетки могут поддерживаться в состоянии покоя или активироваться, делиться и дифференцироваться в ответ на внешние стимулы, связанные с ростом и восстановлением мышц. Активированные СТК вступают в деление и дают начало миогенным клеткам-предшественникам - скелетным миобластам [97]. Миобласты начинают экспрессировать миогенные транскрипционные факторы - MyoD, Myf5, MRF4, миогенин и другие мышечные белки, секретируют uPA, PAI-1 и экспонируют на поверхности uPAR, сливаясь, образуют «мышечные трубки» - будущие мышечные волокна [98, 99]. Урокиназная система вовлечена в регенерацию поперечно-полосатой мускулатуры путем регуляции функций СТК и скелетных миобластов. Показано, что для инициации миграции СТК, их дифференцировки и слияния с предсуществующими миотубами необходимо связывание uPA с рецептором. Блокирование этого связывания антителами ингибирует миграцию культивированных миобластов G8-1 и подавляет их способность к миогенной дифференцировке [100]. Последнее может быть обусловлено подавлением экспрессии миогенина и MyoD, наблюдаемом при блокировании связывания uPA c uPAR [101]. Процесс регенерации скелетных мышц регулируется балансом между uPA и PAI-1, который может влиять на этот процесс при помощи нескольких механизмов, включающих запуск внутриклеточной сигнализации при связывании урокиназы с рецептором [99] и модуляцию эффектов факторов роста, в частности, FGF-2 [102]. Наконец, uPA необходима для обеспечения процесса слияния миобластов, при котором ее экспрессия в этих клетках многократно возрастает. Антитела, блокирующие каталитическую активность uPA или взаимодействие uPA с uPAR, полностью ингибируют процесс слияния и образование мышечных трубок [103, 104]. Таким образом, uPA регулирует пролиферацию, миграцию и слияние миобластов. Механизмы, лежащие в основе этой регуляции, не могут быть объяснены только протеолитической функцией uPA и требуют дополнительных исследований. УРОКИНАЗНАЯ СИСТЕМА И МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обнаружены практически во всех органах и тканях. Вместе с белками внеклеточного матрикса МСК формируют микроокружение резидентных стволовых клеток в тканевых клеточных нишах [105]. Они регулируют репарацию тканей, модулируя свойства стволовых и иммунных клеток, их хоуминг, за счет секреции широкого спектра биологически активных факторов и высвобождения внеклеточных везикул, переносящих в клетки-реципиенты не только белковые факторы, но и регуляторные микроРНК [106]. Одним из важнейших свойств МСК является способность стимулировать ангиогенное поведение эндотелиальных клеток (ЭК) как посредством паракринных эффектов, так и через прямые контакты в составе сосудистой клеточной ниши [107, 108]. В большинстве тканей МСК располагаются в стенке сосудов в периэндотелиальном и супраадвентициальном компартментах [109]. Расположенные периэндотелиально МСК способны через поры в базальной мембране прямо взаимодействовать с эндотелиальными клетками, регулируя их функции посредством прямых контактов и секреторных механизмов. Определенная роль в этой регуляции принадлежит урокиназной системе. МСК, выделенные из костного мозга и жировой ткани, экспрессируют uPAR и секретируют uPA и PAI-1 [110, 111]. Однако в зависимости от тканевой принадлежности МСК их роль в ремоделировании ВКМ в процессе формирования сосудистой сети различна. В наших исследованиях и работах других научных групп показано, что МСК костного мозга и жировой ткани при сокультивировании с эндотелиальными клетками стимулируют формирование ими сосудоподобных структур за счет разных механизмов [111, 112]. МСК из костного мозга ремоделируют матрикс в процессе ангиогенеза через мембранно-связанные металлопротеазы, а МСК из жировой ткани (МСК ЖТ) - через активацию плазминогена урокиназой [111, 112]. Исследуя в модельных экспериментах in vitro роль урокиназной системы в обеспечении регуляторных эффектов МСК ЖТ на формирование сосудистой сети клетками эндотелия, мы показали, что для стимуляции формирования сосудистых структур ЭК в отсутствие экзогенного ВКМ необходимы прямые контакты с МСК, а также обнаружили значительное возрастание экспрессии рецептора урокиназы на поверхности ЭК при сокультивировании с МСК ЖТ. Последнее оказалось круциальным для стимулированного МСК ангиогенеза, так как ингибирующие uPAR антитела дозозависимо подавляли капиллярогенез [111]. Другие компоненты урокиназной системы также играли существенную роль в регуляции ангиогенного поведения клеток эндотелия мезенхимальными стволовыми клетками, так как ингибиторы компонентов урокиназной системы (амилорид, белок RAP - антагонист LRP) также подавляли ангиогенез, стимулированный МСК ЖТ [113]. Эти результаты позволяют предполагать, что в сосудистой клеточной нише урокиназная система играет важную роль в регуляции ангиогенного поведения эндотелиальных клеток. Кроме того, в процессе формирования сосудистой сети и особенно в процессе ее стабилизации важная роль принадлежит перицитам, которые рассматриваются как сосудистые МСК [114]. Урокиназная система регулирует направленную миграцию муральных клеток сосудов [115, 116] и МСК. В модельных экспериментах in vitro uPA повышала спонтанную миграцию МСК, индуцируя секрецию ими матриксной металлопротеазы 9, а также опосредовала миграцию на PDGF-BB, так как блокада взаимодействия uPA с антителами к uPAR полностью подавляла индуцированную PDGF-BB миграцию МСК [117]. Помимо этого, система uPA/uPAR абсолютно необходима для запуска внутриклеточной сигнализации при индукции миграции МСК костного мозга и жировой ткани PDGFAB [118], что свидетельствует о важной роли этой системы в регуляции направленного движения МСК, необходимого для их участия как в процессах роста сосудов, так и в других физиологических и патологических процессах [109]. Другой важный эффект активации урокиназной системы - регуляция дифференцировки МСК. Показано, что внутриклеточные сигналы, поступающие от uPAR, регулируют дифференцировку МСК в адипогенном направлении [119] путем активации пути PI3K/Akt и в остеогенном направлении [120] - через опосредованные NF-kB механизмы. Важным механизмом, регулирующим свойства клеток в тканевых нишах, является взаимодействие с белками внеклеточного матрикса. Синтезируя и ремоделируя матрикс посредством протеолитических механизмов, МСК способны регулировать поведение клеток в тканевой нише и собственные функции. Эти эффекты объясняются изменением плотности матрикса за счет его ремоделирования МСК, что имеет решающее значение для выбора направления дифференцировки [121]. Можно предполагать, что, ремоделируя внеклеточный матрикс в тканевых нишах, МСК могут регулировать дифференцировочные свойства резидентных стволовых клеток, и эта регуляция осуществляется сигналами, влияющими на экспрессию рецептора урокиназы в МСК [73]. Кроме того, МСК секретируют урокиназу, которая запускает протеолитический каскад на поверхности клеток, что способствует высвобождению факторов роста, секвестрированных в матриксе, окружающем клетки, и вносящих свой вклад в регуляцию функций как самих МСК, так и других клеток микроокружения. Таким образом, при помощи различных механизмов урокиназная система участвует в регуляции не только собственных функций МСК, но и других клеток микроокружения, что может рассматриваться в качестве перспективной мишени для воздействия на «клеточные ниши». УРОКИНАЗНАЯ СИСТЕМА И ОПУХОЛЕВЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ Проведенные в последние годы исследования показали, что в опухолевой ткани присутствует популяция опухолевых стволовых клеток (ОСК), которые отвечают за инициацию, распространение (метастазирование) и рецидивирование опухолевого процесса. Первоначально ОСК выявили в костном мозге при остром миелоидном лейкозе [122], а впоследствии и в большинстве солидных злокачественных опухолей яичников [123], предстательной железы [124], поджелудочной железы [125], толстого кишечника [126], головного мозга [127] и др. ОСК обладают основными свойствами стволовых клеток, устойчивостью к лучевой и химиотерапии, способностью в короткие сроки формировать основные популяции опухолевых клеток и восстанавливать клеточное микроокружение даже после проведенного лечения. Роль урокиназной системы в развитии и метастазировании опухолей исследуется в течение нескольких десятилетий, однако работ, посвященных именно стволовым клеткам опухоли, немного. Имеющиеся данные позволяют рассматривать урокиназную систему в качестве важного регулятора состояния и образования ОСК. Так, плазмидная сверхэкспрессия uPAR в линиях клеток MCF-7 и MDA-MB-468 рака молочной железы человека вызывала образование ОСК, имеющих характерный иммунофенотип CD24low/CD44high и содержащих маркеры «стволового фенотипа» - интегрин β1/CD29 и α6/CD49f [128]. Трансплантация суспензии таких клеток в жировую ткань молочной железы мышей SCID с иммунодефицитом приводила к выраженной интеграции трансплантата в ткани животного-реципиента и способствовала более высокой частоте формирования первичных опухолевых очагов больших размеров, чем при трансплантации клеток, трансфицированных контрольными «пустыми» плазмидами [128]. Это указывает на участие uPAR в формировании стволового фенотипа опухолевых клеток. Другой механизм регуляции пластичности ОСК при участии uPAR - активация эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). Результаты многочисленных исследований подтверждают, что запуск программы ЭМП в эпителиальных ОСК способствует приобретению ими промиграционного мезенхимального фенотипа, повышению экспрессии маркеров «стволового фенотипа», способствующих инициации опухолеобразования и метастазирования [129-131]. В условиях гипоксии uPAR способствует инициации ЭМП в культуре клеток рака молочной железы человека (MDA-MB-468), имеющих эпителиальный фенотип, за счет активации различных сигнальных механизмов, включая ERK1/2, PI3K/Akt, Src и Rac1 [132, 133]. Сохранение приобретенного мезенхимального фенотипа ОСК требует высокого уровня экспрессии uPAR и полностью обратимо при подавлении его экспрессии, ингибировании взаимодействия uPA-uPAR и блокировании сигнализации PI3K, Src и ERK1/2 [132, 133]. Сформированные ОСК, экспрессирующие uPAR, могут находиться в тканях в состоянии покоя (в фазе G0/G1) в течение длительного времени, и восстановление пролиферации/роста дормантного опухолевого очага может произойти через многие годы. Другой механизм участия урокиназной системы в развитии опухолей - прямая или опосредованная плазмином активация митогенов. Так, урокиназа активирует HGF, который секретируется фибробластами в виде одноцепочечного биологически неактивного предшественника и накапливается в межклеточном матриксе. При расщеплении HGF урокиназой образуется активный белковый гетеродимер [134] - митоген, активирующий пролиферацию многих клеток, включая ОСК. Другими промитогенными факторами, высвобождаемыми из матрикса и активируемыми с помощью урокиназы, являются FGF-2, VEGF189 и IGF-1 и TGF-β [135-138]. Активность uPA/uPAR в ОСК регулируется ингибиторами активаторов плазминогена - PAI-1/PAI-2 [139, 140]. Однако их действие на ОСК обусловлено не только способностью ингибировать активность урокиназы, но и возможностью взаимодействовать с витронектином, обеспечивающим «закрепление» клеток в опухолевых нишах. Связываясь с витронектином, PAI-1 предотвращает взаимодействие последнего с интегринами на поверхности ОСК и тем самым способствует выходу ОСК из опухолевых ниш, регулируя их адгезию и миграцию. Несколько лет назад мы нашли принципиально новый сигнальный путь, посредством которого урокиназа регулирует приобретение «стволового фенотипа» опухолевыми клетками и их устойчивость к действию цитотоксических агентов. В частности, мы впервые показали, что урокиназа транспортируется в ядро [28], где связывается с транскрипционными факторами (HOXA5, HHEX, Lhx-2), участвующими в регуляции «стволового фенотипа» и выживаемости опухолевых [141] и эндотелиальных [28] клеток. С помощью флуоресцентной иммуногистохимии мы выявили локализацию урокиназы в ядрах опухолевых клеток и эндотелиальных клеток, ассоциированных с опухолью [142]. Механизм транспорта uPA в ядро изучен не до конца, но мы показали, что крингл-домен урокиназы необходим для ее транспорта в ядро. В осуществлении транспортировки урокиназы в ядро участвует нуклеолин (Nuс1), который связывается с ее крингл-доменом [28]. Нуклеолин, несмотря на свою преимущественную локализацию в ядре и ядрышках, способен циркулировать между клеточной мембраной, цитоплазмой и ядром и связывать различные классы белков. В частности, он участвует в транспортировке ряда секретируемых белков, таких, как FGF-1, FGF-2, мидкин, ламинин [143]. Нуклеолин признан одной из перспективных мишеней для противоопухолевой терапии [144], а ингибирование транспорта урокиназы в ядро может быть одним из механизмов такого эффекта [28]. Наши данные свидетельствуют о том, что урокиназный рецептор тормозит транспорт урокиназы в ядро, задерживая ее на поверхности клетки (В. Степанова, неопубликованные данные). Мы предполагаем, что в опухолевых стволовых клетках, уровень урокиназы в которых значительно повышен [142], урокиназа транспортируется преимущественно в ядро, чему способствует удаление первого домена или полноразмерного урокиназного рецептора с поверхности опухолевых клеток под действием протеаз или фосфолипазы С, специфичной к гликозилфосфатидилинозитолу [47-52]. Дальнейшие исследования должны быть направлены на получение ответа на следующие вопросы: 1) какая форма урокиназного рецептора (полноразмерная или расщепленная между первым и вторым доменами) превалирует на поверхности опухолевых клеток, имеющих преимущественно «стволовой» фенотип; 2) повышена ли скорость удаления урокиназного рецептора с поверхности ОСК; 3) повышена ли аккумуляция урокиназы в ядрах клеток, имеющих преимущественно «стволовой» фенотип. Эти исследования позволят, на наш взгляд, расширить представления о роли урокиназной системы в регуляции функционирования опухолевых стволовых клеток и наметить мишени и способы влияния на их функции. РОЛЬ КОМПОНЕНТОВ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ СТВОЛОВЫХ/ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК СЕРДЦА Роль урокиназы в регуляции функций стволовых/прогениторных клеток сердца начали изучать только в самые последние годы. Показано, что эта система, как и в опухолевых стволовых клетках, может контролировать эпителиально-мезенхимальный переход [145, 146], в результате которого образуются мультипотентные прогениторные клетки эпикарда, представляющие собой один из подтипов резидентных прогениторных клеток сердца, участвующих в регенеративных процессах путем дифференцировки в клетки сосудов и миокарда, перкариной секреции ростовых факторов, цитокинов, экзосом [147-150]. Опубликованы лишь единичные работы, посвященные роли урокиназной системы в репаративных процессах в миокарде. Ранее мы показали, что экспрессия урокиназы значительно возрастает сразу после моделирования инфаркта у крыс, но через несколько дней опускается ниже исходного уровня в неповрежденном миокарде (неопубликованные данные). Это позволило предположить, что увеличение экспрессии урокиназы в сердце после инфаркта может стимулировать репаративные процессы за счет активации факторов роста. Для проверки этого предположения мы использовали Плазмидную экспрессию урокиназы в периинфарктной зоне сердца крысы, которая способствовала значительной стимуляции репаративных/регенеративных процессов в сердце: неоваскуляризации, уменьшению размера инфаркта и постинфарктного фиброза [151]. Эти результаты косвенно указывали на участие урокиназы в процессах постинфарктного восстановления сердца, однако, механизмы этого участия пока не идентифицированы. Как известно, основным триггером, запускающим процесс постинфарктного ремоделирования, является гибель кардиомиоцитов, которая сопровождается развитием асептической воспалительной реакции, перераспределением белков внеклеточного матрикса и привлечением стволовых/прогениторных клеток в зону повреждения. В этом процессе наряду с другими компонентами внеклеточного матрикса участвует витронектин. Однако, в отличие от большинства таких белков, синтезируемых клетками сердца, витронектин образуется, главным обазом, в печени, откуда попадает непосредственно в системный кровоток, а далее накапливается в зоне повреждения. Нами показано, что при практически полном отсутствии белка внеклеточного матрикса витронектина в неповрежденном миокарде его количество после инфаркта значительно увеличивается, а динамика накопления коррелирует с аккумуляцией в зоне инфаркта и периинфарктной зоне прогениторных клеток сердца (ПКС). Ранее с помощью иммуногистохимического окрашивания мы выявили, что на поверхности ПКС в миокарде присутствует урокиназный рецептор, который сохраняется при культивировании ПКС in vitro и может специфически связываться с витронектином [152, 153]. Причем ПКС, выделенные из миокарда мышей с нокаутом гена uPAR, значительно хуже адгезировали на витронектин, чем такие же клетки, полученные из сердца мышей дикого типа (ПКСWT). Кроме того, ингибирование урокиназного рецептора специфическими антителами на поверхности ПКСWT приводило к снижению их способности к адгезии и распластыванию на витронектиновом матриксе [152]. Это позволило нам предположить, что uPAR может выступать в качестве регулятора адгезионных свойств ПКС, что может быть определяющим фактором их накопления и интеграции в зоне повреждения. Взаимодействие uPAR и витронектина может быть как независимым от интегринов, так и быть следствием активации различных интегринов [154], тем самым модулируя выбор матрикса для взаимодействия [155-157]. Выяснение роли uPAR и других компонентов урокиназной системы в регуляции эпителиально-мезенхимального перехода клеток эпикарда и механизмов их участия в регуляции взаимодействия ПКС с различными белками внеклеточного матрикса, их миграции, а также пролиферативных и дифференцировочных свойств составляет предмет наших дальнейших исследований. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Стволовые клетки взрослого организма существуют в определенном микроокружении, контролирующем их способность к самообновлению, уровень пролиферации и дифференцировки, в так называемых «клеточных нишах». В «нишах» стволовые клетки находятся в тесной связи с коммитированными клетками-предшественниками, со стромальными клетками, белками внеклеточного матрикса, взаимодействие с которыми регулирует поддержание состояния покоя, оптимального метаболического профиля, низкодифференцированного состояния, а также процессы дифференцировки и выхода стволовых клеток из «ниши» после получения соответствующего стимула. Анализ результатов многочисленных исследований позволяет утверждать, что урокиназная система выполняет координирующую функцию, реализуя специфические сигналы, поступающие от компонентов внеклеточного матрикса и окружающих клеток (рис. 3). Основные ее компоненты (uPAR и uPA) широко представлены в клетках, образующих тканевые клеточные ниши, включая стволовые клетки и клетки микроокружения, а их подавление приводит в большинстве случаев к снижению пролиферации, переходу стволовых клеток в состояние покоя, индукции апоптоза, а также к ингибированию инвазии, миграции и дифференцировки. Ингибиторы активаторов плазминогена, поддерживая оптимальный уровень их активности, выполняют регуляторные функции в отношении стволовых/прогениторных клеток: ограничивают внеклеточный протеолиз, обеспечивают выполнение специализированных функций прогениторных клеток путем ингибирования активности uPA, а также поддержание уровня конкурентного взаимодействия витронектина с интегринами, uPAR и рециркуляцию uPAR на поверхности клеток. Влияние компонентов урокиназной системы на функции стволовых клеток обусловлено как дифференциальной регуляцией активности множества различных сигнальных молекул (рис. 4), так и прямым действием урокиназы в ядре, что может приводить к запуску уникальной программы «самоподдержания» стволовых клеток или, наоборот, приводить к ослаблению адгезии, «выходу» клеток из ниши и активации их миграции в зону повреждения (рис. 5). Главенствующую роль в этом процессе, по-видимому, играет рецептор урокиназы, входящий в состав большого сигнального комплекса, состоящего из множества белков как снаружи, так и внутри клетки, активация которого приводит к запуску внутриклеточной сигнализации. Возможно, именно состояние uPAR может быть эволюционно консервативным ключом, определяющим молекулярные черты и удержание стволовых клеток в составе «клеточной ниши». Этот феномен может реализоваться за счет протеолитического разрезания рецептора, что приводит к образованию «расщепленных/ урезанных» мембранно-связанных форм uPAR (cuPAR), а также растворимых форм урокиназного рецептора (su-uPAR). c-uPAR, лишенный D1-домена, не способен связывать лиганды (uPA и витронектин), а также взаимодействовать с интегринами и активировать соответствующие сигнальные механизмы. В дополнение к этому растворимая форма su-uPAR может конкурировать с мембранно-связанной формой uPAR за связывание с лигандами, тем самым ограничивая поступление сигналов в клетку, внеклеточный протеолиз и адгезию. Такая высокоточная система регуляции стволовых клеток в составе «клеточных ниш» открывает новые возможности для разработки подходов к высокоспецифичному воздействию на эту систему. Выяснение механизмов, поддерживающих баланс пролиферации/апоптоза, миграции и дифференцировки стволовых клеток, контролируемых компонентами урокиназной системы, представляет собой важную биологическую и медицинскую задачу, требующую скорейшего решения. Комбинированное таргетное воздействие, которое может включать в себя воздействие на систему uPA/PAI/uPAR в отдельности или в сочетании с воздействием на мишени упомянутой системы, может иметь большие шансы на успех в плане повышения терапевтического потенциала стволовых/прогениторных клеток или воздействия на опухолевые стволовые клетки при злокачественных новообразованиях.

Об авторах

K. В. Дергилев

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии МЗ РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: doctorkote@gmail.com
Россия

В. В. Степанова

Университет Пенсильвании

Email: doctorkote@gmail.com
США

И. Б. Белоглазова

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии МЗ РФ; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: doctorkote@gmail.com
Россия

З. И. Цоколаева

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии МЗ РФ

Email: doctorkote@gmail.com
Россия

Е. В. Парфенова

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии МЗ РФ; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: doctorkote@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы