Структура FAB-фрагментов антител к фуллерену C₆₀: структурные детерминанты связывания фуллерена

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Проблема иммунного распознавания - один из клю чевых вопросов современной биохимии, важ ный как для понимания биологических процессов, так и для создания новых лекарственных препара тов и конструирования вакцин. За последние годы получено большое количество теоретических и экс периментальных данных, способствующих понима нию структурно-функциональных закономерностей иммунного взаимодействия [1-5]. Одним из эффек тивных средств изучения комплекса антитело-анти ген является рентгеноструктурный анализ, успешно применяемый для изучения взаимодействия антител с различными высокомолекулярными антигенами (белками, полисахаридами и др.) и низкомолекуляр ными водорастворимыми гаптенами [6-9]. На сегодняшний день круг потенциальных мишеней иммунного распознавания существенно расширился, в том числе благодаря частицам со структурно вы рожденной поверхностью. К таким частицам относят ся техногенные наночастицы, объемы производства и применения которых в различных областях науки и технологий интенсивно растут [10]. Возможность варьировать физико-химические параметры нано частиц открывает широкие горизонты для синтеза наночастиц с заданными свойствами, которые мо гут использоваться в таких областях биомедицины, как направленная доставка лекарственных средств, диагностика заболеваний и имиджинг органов и тка ней [11-13]. Использование этих нестандартных объ ектов в медицине и биотехнологии делает важным изучение особенностей иммунного ответа на техноген ные наночастицы, попадающие в организм. К антигенам, взаимодействие с которыми не укла дывается в рамки стандартных закономерностей им мунной реакции, относятся фуллерены - наночасти цы, состоящие исключительно из атомов углерода и обладающие уникальной геометрией и свойства ми [14]. Ряд исследований показывает возможность получения специфических антител к фуллеренам и предоставляет данные о комплексах антитело- фуллерен [15-18]. Изучению структуры сайта иммунного связы вания фуллерена со специфическими антителами посвящена лишь одна работа [15]. Методами рент геноструктурного анализа и компьютерного моде лирования показано, что специфический сайт свя зывания молекул фуллерена представляет собой сферическую полость размером 7 Å, образованную кластером гидрофобных аминокислот. Однако в смо делированной структуре комплекса фуллерена с Fab-фрагментом антитела [15] во взаимодействие с фуллереном вовлечены гидрофобные остатки за пределами CDR. Задача настоящего исследования состояла в из учении структуры Fab-фрагмента антител против фуллерена С60 методом рентгеноструктурного ана лиза и в моделировании строения комплекса анти тело-фуллерен. С этой целью использованы Fab фрагменты полученных ранее моноклональных антител к фуллерену С60 (FabC60) [18]. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы Растворимое производное С60 - фуллеренаминока проновая кислота (С60(H)3(NH(CH2)5COONa)3 × 10 H2O, SolC60) с чистотой 98% - приобретено у «Интелфарм» (Россия). Меченные пероксидазой хрена козьи анти тела против λ-цепей IgG мыши приобретены у Bethyl Laboratories Inc. (США), 3,3´,5,5´-тетраметилбензи дин (TMБ) и Тритон X-100 - у Sigma-Aldrich (США). Остальные реагенты имели аналитическую степень чистоты. Для иммуноферментного анализа (ИФА) использованы микропланшеты Costar 9018 фирмы Corning (США). Получение Fab-фрагментов моноклональных антител мыши Использовали Fab-фрагменты (FabC60) клона В1 мо ноклональных антител мыши (Ful B1, IgG2a lambda), полученных нами ранее [18]. Антитела B1 очищали из асцитной жидкости одностадийной аффинной хро матографией на G-сефарозе и диализовали в тече ние ночи против 200 мМ натрий-фосфатного буфера, pH 7.4, содержавшего 2 мМ EDТА и 10 мМ цистеин. Для получения Fab-фрагментов антител B1 кристал лический папаин (Sigma, США) растворяли в том же буфере, смешивали с антителами в пропорции 1 : 100 и инкубировали смесь в течение 4 ч при 37°C и легком покачивании. Реакцию останавливали добавлением йодоуксусной кислоты до конечной концентрации 10 мМ. Для удаления Fc-фрагментов реакционную смесь наносили на колонку с белок-A-сефарозой, проскок собирали и диализовали против натрий фосфатного буфера. Концентрацию FabC60 опреде ляли спектрофотометрически при 280 нм, используя коэффициент E280 (1 мг/мл) = 1.4. Чистоту образцов контролировали методом электрофореза по Лэммли в 12% полиакриламидном геле без добавления β-меркаптоэтанола. Характеристика Fab-фрагментов моноклональных антител мыши Непрямой ИФА. Конъюгат C60-тиреоглобулин (5 мкг/мл) в 50 мМ калий-фосфатном буфере, pH 7.4, содержавшем 100 мМ NaCl (ФБ), добавляли в лун ки микропланшета и инкубировали в течение 16 ч при 4oC. Микропланшет отмывали 4 раза ФБ, содер жавшим 0.05% Тритона X-100 (ФБТ). Затем в лунки микропланшета добавляли серию разведений анти тела B1 и его Fab-фрагмента и инкубировали в те чение 1 ч при 37oC. После четырехкратной отмывки ФБТ в лунки добавляли меченные пероксидазой хре на козьи антитела против λ-цепей IgG мыши в разве дении 1:10 000 и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Микропланшет отмывали 4 раза ФБТ и измеряли пероксидазную активность иммунных комплексов. Для этого в лунки вносили субстратную смесь, содер жавшую 0.42 мМ TMБ и 1.8 мМ Н2О2 в 0.1 М цитрат ном буфере, pH 4.0, и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Ферментативную ре акцию останавливали, добавляя в лунки 1 М H2SO4. Оптическую плотность продукта окисления измеряли при 450 нм, используя микропланшетный фотометр Zenyth 3100 (Anthos Labtec Instruments, Австрия). Конкурентный ИФА SolC60. Конъюгат C60 - соевый ингибитор трипсина (С60-СИТ) (1 мкг/мл) в ФБ до бавляли в лунки микропланшета и инкубировали в течение 16 ч при 4oC. Микропланшет промыва ли 4 раза ФБТ и вносили в лунки растворы SolC60 (от 5 мкг/мл до 0.1 нг/мл) и FabC60 (5 мкг/мл), ин кубировали в течение 90 мин при 37oC. После четы рехкратной отмывки ФБТ в лунки микропланшета добавляли меченные пероксидазой хрена козьи анти тела против λ-цепей IgG мыши в разведении 1:10 000 и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. После отмыв ки микропланшета измеряли пероксидазную актив ность полученных комплексов как описано выше. Зависимость оптической плотности от концентра ции антигена аппроксимировали с помощью програм мы Origin 7.5 (OriginLab, США), используя четырех параметрическую сигмоидную функцию: , где A1 - максимальная величина оптической плотно сти, A2 - минимальная величина оптической плотно сти, p - наклон калибровочной кривой, x0 - концен трация антигена, приводящая к 50% ингибированию связывания антителом. Кристаллизация Для кристаллизации использовали два препара та белка: раствор FabC60 (7 мг/мл) в 50 мM буфере HEPES, pH 7.0, и раствор комплекса FabC60 с SolC60, полученный смешиванием 100 мкл раствора FabC60 (0.16 мМ или 7 мг/мл) с 20 мкл 1 мМ водного раствора SolC60. Поиск условий кристаллизации проводили ме тодом диффузии пара в варианте с висячей каплей при 298 К. В качестве противорастворов использо вали наборы кристаллизационных растворов Index HR2-134 и Crystal Screen HR2-110/112 фирмы Hampton Research (США). Капли состояли из рав ных объемов (1 мкл) раствора белка и противорас твора. Кристаллы FabC60, пригодные для рентгено структурного анализа, получены с использованием противораствора, содержавшего 25% полиэтилен гликоль 3350, 0.2 M (NH4)2SO4, 0.1 M бис-Трис, pH 6.5. Образование кристаллов наблюдалось на третий день, в течение недели кристаллы вырастали до раз меров 200×200×50 мкм. Сбор дифракционных данных и решение структуры Набор дифракционных данных с кристалла FabC60 собирали на пучке K4.4e (станция «Белок» Курчатовского источника синхротронного излуче ния, Москва, Россия) на длине волны 0.98 Å при 100 К в токе азота. Перед сбором данных кристаллы вы мачивали в противорастворе, дополнительно содер жавшем 20% глицерина, и замораживали в жидком азоте. Набор дифракционных данных обрабатывали программой XDS [19]. Кристаллографические рас четы проводили с использованием комплекта про грамм CCP4 [20]. Структуру FabC60 решали методом молекулярного замещения программой BALBES [21]. В качестве модели для молекулярного замещения ис пользовали структуру антител из Protein Data Bank (код pdbid 1MFB) [22]. Уточнение структуры прово дили с использованием программы REFMAC5 [23]. Визуальную коррекцию модели проводили вручную с использованием COOT [24]. Иллюстрации подго тавливали с использованием программного пакета PyMOL [25]. Структуру депонировали в Protein Data Bank (PDB, код pdbid 6H3H). Докинг малых молекул Докинг и подготовку структур рецептора и лиганда выполняли с использованием программы Autodock Vina [26]. Файл с координатами C60 скачивали из ChemSpider (www.chemspider.com). Рецептор определяли как трехмерную сеть со стороной, равной 22.5 Å, и с центром в точке (13.95; -9.51; 38.74). Каждое измерение сети содержало 60 точек. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика Fab-фрагментов моноклональных антител мыши FabC60, использованные в настоящей работе, получе ны расщеплением полноразмерных анти-С60-антител B1 папаином и очищены до гомогенного состояния, что подтверждено данными электрофореза в 12% по лиакриламидном геле в невосстанавливающих усло виях (рис. 1A). Иммунохимическая реакционная способность FabC60 изучена методом непрямого ИФА (рис. 1Б). По данным ИФА реакционная способность получен ных FabC60 примерно в 80 раз ниже по сравнению с полноразмерными антителами. Антигенсвязывающую способность FabC60 изуча ли с помощью конкурентного ИФА. В данном форма те анализа конъюгат C60-белок, иммобилизованный на твердой фазе, и водорастворимое производное фуллерена, SolC60, конкурентно взаимодействовали с Fab-фрагментами антител. Специфичность взаи модействия подтверждали в экспериментах, где в ка честве контроля использовали Fab-фрагменты моно клональных антител к другому антигену (Х-вирусу картофеля), а также иммобилизованный на твердой фазе конъюгат белка с другим гаптеном (пестици дом атразином) (рис. 1В). Как видно из полученных данных, FabC60 не взаимодействует с адсорбирован ным конъюгатом атразин-СИТ (кривая 3 на рис. 1В). Кроме того, иммобилизованный конъюгат C60-СИТ не связывается с неспецифическими антителами (кривая 2 на рис. 1В). Кривая 1 на рис. 1В свиде тельствует о наличии эффекта конкуренции между свободным SolC60 и иммобилизованным конъюгатом C60-СИТ за антигенсвязывающие участки FabC60. Таким образом, полученные результаты подтверж дают специфическую природу иммунного взаимо действия Fab-фрагментов антител B1 и производного фуллерена С60. Структура FabC60 Кристаллизация комплекса FabC60 с SolC60 привела к образованию кристаллов свободной формы FabC60. Структуры FabC60, полученные без SolC60 и в ее присутствии, были одинаковыми, и в дальнейшем мы рассматриваем только структуру, полученную при кристаллизации свободной формы FabC60. Структура FabC60 была решена методом рент геноструктурного анализа с разрешением 1.9 Å. Статистика собранных дифракционных данных представлена в таблице. В независимой части эле ментарной ячейки располагаются две молекулы FabC60, которые совмещаются по координатам 2717 эквивалентных атомов со среднеквадратичным от клонением 1.0 Å. Эти же молекулы совмещаются по координатам атомов вариабельного домена со среднеквадратичным отклонением 0.4 Å. Две молеку лы независимой части элементарной ячейки отлича ются конформацией C-концов и межмолекулярными контактами (см. ниже). FabC60 имеет характерную для Fab-фрагментов двухдоменную структуру, состоящую из тяжелой (H) и легкой (L) λ-цепей, и линейные размеры 45×50×100 Å (рис. 2A). Вариабельный домен тяжелой цепи (VH) включает остатки 1-119, а вариабельный домен лег кой цепи (VL) - остатки 1-108. Константный домен тяжелой цепи (CH) включает остатки 123-222, кон стантный домен легкой цепи (CL) - остатки 115-215. В электронной плотности уточнены все аминокислот ные остатки легких цепей. Остатки 135-139, распо ложенные в петле между доменами VH и CH, разупо рядочены и не локализованы на картах электронной плотности. Гипервариабельные участки (CDR) определены следующим образом: L1 (Arg23-Asn36), L2 (Gly51- Ala57), L3 (Ala91-Val99), H1 (Gly26-His35), H2 (Tyr50-Glu59) и H3 (Gly99-Trp109) [27, 28] (рис. 2Б). Аминокислотные остатки этих участков формиру ют антигенсвязывающий карман с размерами 9×7 Å и глубиной 5 Å (диаметр сферы C60 = 7 Å). Из-за наличия у фуллерена сопряженной системы π-π связей мы ожидали, что CDR будет содержать остатки, склонные к π-π-стэкинг-взаимодействиям. Действительно, поверхность антигенсвязывающе го кармана частично образована расположенными в CDR гидрофобными ароматическими остатка ми Tyr50 (H2), Tyr101 (H3), Tyr34 (L1), Trp93 (L3) и Trp98 (L3). Боковая группа Tyr101 из петли Asp100- Tyr101 в CDR H3 плохо видна на картах электрон ной плотности; B-факторы у атомов боковой группы Tyr101 (54 Å2) выше, чем у атомов Tyr101 основной цепи (28 Å2). Это различие в величине B-факторов свидетельствует о подвижности боковой группы Tyr101 и может быть связано с локализацией Tyr101 на поверхности белка. Подвижный Tyr101 может выполнять функцию «крышки» кармана, затрудняя вход С60 в антигенсвязывающий карман и снижая тем самым аффинность взаимодействия антитело-анти ген (рис. 2Б). На поверхности антигенсвязывающего сайта об наружены остатки Thr33 и His35 из CDR H1, спо собные образовывать водородные связи, которые могут быть вовлечены в связывание фуллерена [15]. Однако в полученной нами структуре свободной формы FabC60 остатки Thr33 и His35 двух молекул FabC60 независимой части элементарной ячейки об разуют водородные связи с C-концевыми остатка ми H- и L-цепей симметрично упакованных молекул FabC60 (рис. 3А,Б). В первой молекуле FabC60 анти генсвязывающий карман занят С-концевым пепти дом Ala219-Ser222 H-цепи симметричной молекулы. Карбоксильная группа Ser222 симметрично-связан ной молекулы FabC60 образует две водородные связи с Thr33 и His35. Во второй молекуле FabC60 антигенсвязывающий карман занят С-концевым пептидом Asp213-Ser215 L-цепи другой симметрично-свя занной молекулы FabC60. В этом случае водородные связи C-концевого остатка Ser215 с остатками Thr33 и His35 опосредованы молекулами воды. Вероятнее всего, связывание в антигенсвязывающем сайте FabC60 одного из С-концов другой молекулы не имеет отношения к биологической роли и является артефактом кристаллической упаковки. Однако мы пред полагаем, что подобная кристаллическая упаковка, стабилизированная дополнительными водородными связями, препятствует связыванию антигена и яв ляется одной из причин, не позволивших нам закри сталлизовать комплекс FabC60 и SolC60. Степень гомологии первичной структуры FabC60 и ранее описанных антител к фуллерену (анти-C60 Fab, pdbid 1emt) [15] довольно высока и составля ет 76 и 40% по H- и L-цепям соответственно. FabC60 содержит легкую λ-цепь, в то время как анти-C60 Fab - легкую κ-цепь. Структуры этих антител от личаются взаимным расположением V- и C-доменов, поэтому сравнительный анализ этих двух структур затруднен. При совмещении структур по коорди натам VH домена r.m.s.d. составляет 0.4 Å (рис. 4A). Антигенсвязывающие карманы этих антител отли чаются по составу и строению, максимальные отли чия наблюдаются в укладке L-цепи и петли CDR H3 (рис. 4Б). Петля H3 анти-C60 Fab [15] на семь остатков короче петли Н3 FabC60 (11 остатков). Докинг C60 в FabC60 и анализ связывания C60 с FabC60 Поскольку нам не удалось получить структу ру комплекса С60 с FabC60, мы выполнили докинг C60 в антигенсвязывающем кармане FabC60, чтобы определить структурные особенности связывания фуллерена с антителами [26]. Известно, что связы вание антигена сопровождается конформационными изменениями в гипервариабельных участках [29, 30]. Максимальные структурные перестройки наблюда ются в петле CDR H3, которая имеет наибольшую подвижность и наиболее трудна для моделирования среди всех петель антигенсвязывающего региона [31]. Для понимания возможного влияния петли CDR H3 на связывание антигена мы сравнили две модели комплекса С60 с нативной формой FabC60 (Комплекс I) и модифицированной формой FabC60 с удаленными остатками Asp100 и Tyr101 из CDR H3 (Комплекс II) (рис. 5). В комплексе I молекула C60 связывается на поверх ности антигенсвязывающего сайта и образует π-π стэкинг с остатками: Tyr50 (CDR H2), Tyr101 (CDR H3) и Trp93 (CDR L3). При связывании фуллерена площадь его доступной растворителю поверхности снижается на 40%. Энергия связывания, рассчитан ная с использованием программы Autodock Vina, со ставила -7 ккал×моль-1, что соответствует констан те диссоциации (Kd) комплекса, равной 7.4 × 10-6 М. Экспериментально определенная Kd комплекса С60 и полноразмерных антител B1 к фуллерену состави ла 1.1 × 10-7 М [18]. С учетом 80-кратного снижения аффинности взаимодействия С60 с FabC60, Kd ком плекса С60 и FabC60 оценивается величиной 9 × 10-6 М, что хорошо коррелирует с величиной, рассчитанной для модели комплекса С60 с нативной формой FabC60, полученной докингом. Удаление остатков Asp100 и Tyr101 приводит к тому, что в комплексе II молекула С60 глубже вхо дит в антигенсвязывающую полость и связывается на расстоянии около 4 Å от положения C60 в комплексе I (рис. 5). Энергия связывания, рассчитанная с ис пользованием программы Autodock Vina, растет с -7 до -12 ккал×моль-1, что соответствует снижению ве личины Kd комплекса с 7.4 × 10-6 до 1.6 × 10-9 М. Рост аффинности в отсутствие Asp100 и Tyr101 объясня ется образованием дополнительных (помимо ранее упомянутых) π-π-взаимодействий с His35 H-цепи и Tyr34 L-цепи, а также снижением площади доступ ной растворителю гидрофобной поверхности C60 с 60 до 40% от исходной. Таким образом, остатки Asp100 и Tyr101 из CDR H3 могут играть ключевую роль в снижении аффинности взаимодействия фуллерена C60 с соответствующими антителами. В уже упомянутой работе [15] также не удалось получить кристаллическую структуру комплек са Fab-фрагментов (pdbid 1emt) с C60, и структура комплекса была смоделирована с использованием программы INSIGHT 2 по методике, отличной от ис пользованной в нашей работе: молекулу C60 вручную помещали в полость вариабельного домена между H- и L-цепями, после чего энергия системы миними зировалась [15]. В связывание C60 в полученной мо дели вовлечены остатки Tyr36, Gln89, Phe96 и Phe98 L-цепи и Asn35, Trp47 и Trp106 H-цепи, связывание сопровождалось уменьшением на 90% площади до ступной растворителю гидрофобной поверхности фуллерена [15]. Единственными экспериментально установлен ными структурами, по которым возможно проверить правильность выводов о движущих силах образова ния комплекса антитело-фуллерен, являются струк туры комплекса C60 с синтетическим белком (pdbid 5hkn, 5hkr, 5et3) [32]. Фуллерен C60 в этих комплек сах связан в гидрофобном кармане. При связывании доступная растворителю гидрофобная поверхность C60 уменьшается на ~90% и образуется π-π-стэкинг взаимодействие с остатком Tyr9. Проведенный нами дополнительный анализ структур позволил обна ружить не упомянутое в работе [32] еще одно π-π взаимодействие C60 с пептидной связью Leu19-Ala20. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, результаты, полученные при моде лировании строения комплексов С60 с FabC60, согласу ются с экспериментальными данными [32]. Основной вклад в энергию связывания фуллерена с белками вносят гидрофобные и π-π-стэкинг-взаимодействия. Подвижный фрагмент петли в гипервариабельном участке H3 затрудняет доступ C60 к антигенсвязы вающему сайту, что объясняет низкую аффинность изучаемых антител (Kd около 10-7 М). Остатки Thr33 и His35 в антигенсвязывающем кармане, которые в растворе могут быть вовлечены в связывание фуллерена, в условиях кристалли зации образуют водородные связи с С-концевыми остатками симметрично расположенной молекулы FabC60, стабилизируя кристаллическую упаковку свободной формы FabC60 и препятствуя кристалли зации комплекса С60 с FabC60.

Об авторах

E. M. Осипов

Институт биохимии им. А. Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: vpopov@inbi.ras.ru
Россия

O. Д. Гендриксон

Институт биохимии им. А. Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: vpopov@inbi.ras.ru
Россия

T. В. Тихонова

Институт биохимии им. А. Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: vpopov@inbi.ras.ru
Россия

A. В. Жердев

Институт биохимии им. А. Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: vpopov@inbi.ras.ru
Россия

O. Н. Солопова

Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения

Email: vpopov@inbi.ras.ru
Россия

П. Г. Свешников

Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения

Email: vpopov@inbi.ras.ru
Россия

Б. Б. Дзантиев

Институт биохимии им. А. Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: vpopov@inbi.ras.ru
Россия

В. O. Попов

Институт биохимии им. А. Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: vpopov@inbi.ras.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы