Термодинамические параметры взаимодействия эндонуклеазы VIII с поврежденной ДНК

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Эндонуклеаза VIII (Endo VIII, или Nei) - одна из ос новных ДНК-гликозилаз Escherichia coli, удаляющих широкий набор окисленных или восстановленных пи римидиновых оснований [1, 2]. Продуктами окисле ния/восстановления пиримидиновых оснований ДНК являются тимингликоль, 5,6-дигидротимин, 5,6-ди гидроурацил, мочевина, 5-формилурацил, 5-оксиме тилурацил, 5-гидроксицитозин, 5-гидроксиурацил, урацилгликоль и др. Endo VIII катализирует гидро лиз N-гликозидной связи поврежденного основания (N-гликозилазная активность) и последующие ре акции β-элиминирования 3’- и 5’-фосфатных групп апуринового/апиримидинового сайта (АР-лиазная активность), приводящие к образованию одноцепо чечного разрыва в ДНК (рис. 1) [3, 4]. Анализ рентгеноструктурных данных свободного фермента и его комплекса с ДНК показал, что вза имодействие Endo VIII с ДНК приводит к конфор мационным изменениям как в молекуле белка, так и в молекуле субстрата [5, 6]. В фермент-суб стратном комплексе происходит изгибание рибозо фосфатного остова ДНК примерно на 45°, повреж денное основание выворачивается из ДНК-спирали и располагается в активном центре фермента, а в об разовавшуюся полость встраиваются аминокислот ные остатки Gln69, Leu70 и Tyr71 (рис. 2). Такие из менения структуры взаимодействующих молекул приводят к образованию специфических контактов, результатом которых является высокоэффективное узнавание и связывание поврежденных участков ДНК. Ранее методом «остановленного потока» с реги страцией изменения интенсивности флуоресценции остатков триптофана [7], входящих в состав фермен та, и ряда флуоресцентных аналогов гетероцикличе ских оснований в ДНК [8], расположенных с 5′-сто роны или напротив поврежденного нуклеотида, был проведен кинетический анализ конформационных изменений в Endo VIII и ДНК-субстрате в ходе их взаимодействия. В дальнейшем [9] для уточнения природы последовательных стадий связывания ДНК мы использовали стратегию сайт-направленного му тагенеза. Совокупность кинетических данных, харак теризующих конформационные изменения фермента и ДНК-субстратов, а также результатов мутационно го анализ позволила предложить молекулярно-ки нетический механизм узнавания повреждения фер ментом Endo VIII (схема 1). Стадия 1 соответствует быстрому первоначальному связыванию ДНК и об разованию неспецифического комплекса фермент субстратного комплекса, в котором N- и С-домены фермента переходят в закрытое положение. На этой стадии остаток Leu70 вклинивается в ДНК-дуплекс, что является ключевым моментом узнавания по врежденного участка ДНК. Стадия 2 включает из гибание двойной спирали в месте поврежденно го основания, выворачивание 5,6-дигидроурацила из дуплекса и встраивание остатка Tyr71 в ДНК спираль, необходимое для стабилизации вывернутой конформации поврежденного основания. На стадии 3 происходит подстройка конформации активного центра для достижения каталитически-компетент ного состояния. Остаток Tyr71 также принимает участие в стадии 3. На этой стадии образуются контакты между Phe121 и рибозо-фосфатным остовом ДНК. Формирование каталитического комплекса приво дит к гидролизу N-гликозидной связи и последую щей реакции β-элиминирования 3′- и 5′-фосфатных групп (стадия 4). Завершает ферментативный цикл диссоциация комплекса фермент-продукт (стадия 5). Для подтверждения кинетического механизма (схема 1) и уточнения природы отдельных стадий мы определили термодинамические параметры бы стропротекающих стадий процесса взаимодействия Endo VIII с ДНК и специфического узнавания повреж денного нуклеотида, основываясь на кинетических па раметрах, получаемых при разных температурах. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Олигодезоксирибонуклеотиды Олигонуклеотиды очищали с помощью ВЭЖХ на ио нообменной колонке (PRP-X500 Hamilton Company 3.9×300 мм, размер частиц 12-30 мкм) и последую щей обращенно-фазовой хроматографии (Nucleoprep 100-20 C18 10×250 мм, Macherey-Nagel, Германия). Чистоту олигонуклеотидов проверяли с помощью денатурирующего электрофореза в 20% полиакри ламидном геле (ПААГ). Концентрацию олигонукле отидов определяли по оптической плотности раство ров на длине волны 260 нм в электронных спектрах поглощения и коэффициентов молярной экстинкции, рассчитанных в приближении метода «ближайших соседей» [10]. В качестве ДНК-субстратов использовали 17-звенные ДНК-дуплексы (табл. 1), содержащие в комплементарной цепи напротив специфического сайта вместо остатка цитозина флуорофор 1,3-диаза- 2-оксофеноксазин (tCO). Специфическим сайтом слу жил остаток 5,6-дигидроуридина, выступающий в качестве поврежденного основания, и F-сайт, который является аналогом промежуточного продукта ферментативной реакции - апуринового/апирими динового сайта (АР-сайта). В качестве неповрежден ной ДНК использовали дуплекс, не содержащий мо дифицированных нуклеотидов. Эндонуклеаза VIII Endo VIII выделена из линии клеток E. coli Rosetta II (DE3), трансформированных плазмидой pET-24b, не сущей ген фермента. Культуру клеток E. coli Rosetta II (DE3) наращивали в среде LB (1 л), содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при температуре 37°С до оп тической плотности 0.6-0.7 при длине волны 600 нм. После этого температуру понижали до 30°С, транс крипцию индуцировали добавлением изопропил-β- D-тиогалактопиранозида до 0.2 мМ. После индукции культуру клеток инкубировали в течение 8 ч. Затем клетки осаждали центрифугированием (10 мин, 12000 об/мин), и готовили суспензию клеток в 30 мл буферного раствора (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8, 40 мМ NaCl). Клетки лизировали при помощи френч пресса (French Press Cell, Thermo Fisher Scientific, США). Все последующие процедуры проводили при 4°С. Лизат клеток центрифугировали (40 мин при 30 000 об/мин), супернатант наносили на колон ку I (Q-Sepharose Fast Flow, Amersham Biosciences, Швеция) и промывали буферным раствором (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8, 40 мМ NaCl). Фракции, со держащие белок, собирали и наносили на колон ку II (HiTrap-Heparin™, Amersham Biosciences, Швеция). Хроматографию проводили в линейном градиенте 40 → 1500 мМ NaCl, оптическую плотность раствора регистрировали при длине волны 280 нм. Степень чистоты белка определяли с помощью гель электрофореза. Фракции, содержащие белок Endo VIII, диализовали в буфере 20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.5, 1 мМ EDТА, 1 мМ дитиотреит, 250 мМ NaCl, 50% глицерин и хранили при -20°С. Концентрацию фермента рассчитывали из значения оптической плотности белка на длине волны 280 нм и коэффици ента молярной экстинкции 32680 М-1×см-1 [11]. Кинетические исследования методом «остановленного потока» Кинетические кривые регистрировали по изменению интенсивности флуоресценции tCO на спектрометре остановленной струи SX.20 (Applied Photophysics, Великобритания). Длина волны возбуждения флуо ресценции tCO составляла 360 нм. Регистрацию флу оресценции проводили на длинах волн более 395 нм (Schott filter GG 395). Мертвое время прибора состав ляло 1.4 мс, максимальное время регистрации сигна ла - 500 с. Все эксперименты выполнены в буферном растворе 50 мМ Tрис-HCl, pH 7.5, 50 мМ KCl, 1 мМ дитиотреит, 1 мМ EDТА, 7% глицерин при темпера турах от 5 до 25°С. Каждую кинетическую кривую усредняли, как минимум, по трем эксперименталь ным кривым. Анализ кинетических кривых Для расчета констант скорости конформационных переходов получали набор кинетических кривых для разных концентраций фермента при разных температурах. Интенсивность флуоресценции tCO регистрировали в условиях, близких к «одному обо роту фермента», т.е. при концентрациях фермента и субстрата одного порядка. Для определения мини мальной кинетической схемы, описывающей взаимо действие фермента с субстратом, и расчета констант скорости всех элементарных реакций, соответствую щих данной схеме, использовали программу DynaFit (BioKin, США) [12]. Количественную обработку ре зультатов проводили путем оптимизации значе ний параметров, входящих в кинетические схемы, как описано ранее [13-16]. Используя полученные значения констант ско рости прямых и обратных реакций для отдельных обратимых стадий, рассчитывали константы равно весия Ki этих стадий (Ki = ki/k-i, где i - номер стадии) для разных температур. Стандартные термодинами ческие параметры i-й равновесной стадии опреде ляли с помощью уравнения Вант-Гоффа (1) [17, 18] как описано ранее [19-23]. Анализ температурной зависимости констан ты скорости химической реакции kcat по уравнению Эйринга (2) позволил рассчитать стандартную эн тальпию активации (ΔHo,‡) и стандартную энтропию активации (ΔSo,‡), соответствующих образованию переходного состояния [17]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Взаимодействие Endo VIII с неповрежденным ДНК-дуплексом G-DNA На рис. 3А представлены кинетические кривые для процесса взаимодействия Endo VIII с ДНК дуплексом G-DNA, содержащим остаток гуанина напротив флуорофорной группы tCO, полученные путем регистрации изменений интенсивности флуо ресценции tCO в ходе реакции. На кинетических кри вых можно выделить одну фазу роста интенсивности флуоресценции, которая выходит на плато. При уве личении температуры выход на плато данного из менения сдвигается с ~30 мс при 5 до ~20 мс при 25°С (рис. 3Б). Полученные кинетические кривые удовлет ворительно описываются одностадийной равновес ной кинетической схемой 2. Константы скорости, ха рактеризующие эту стадию, представлены в табл. 2. Схема 2. Кинетический механизм взаимодействия Endo VIII с неповрежденным ДНК-дуплексом , где E - фермент Endo VIII, G - ДНК-дуплекс, содержа щий остаток гуанина напротив флуорофорной группы tCO, E•G - комплекс Endo VIII c ДНК-дуплексом, k1 и k-1 - константы скорости прямой и обратной реакций. Взаимодействие Endo VIII с аналогом АР-сайта F-DNA Взаимодействие Endo VIII c AP-сайтом в ДНК изуче но с использованием ДНК-дуплекса, содержащего не расщепляемый аналог АР-сайта (производное тетра гидрофурана F) и флуорофорную группу tCO напротив повреждения в комплементарной цепи (рис. 4). На ки нетических кривых, представленных на рис. 4, можно выделить две фазы роста интенсивности флуорес ценции tCO. Первая фаза роста происходит в том же временном диапазоне (до ~ 20 мс), как и в случае взаимодействия с неповрежденным G-DNA. По видимому, в начальный момент времени в структуре ДНК-дуплексов, содержащих и G-, и F-сайт, проис ходит одно и то же конформационное превращение, вызванное связыванием с Endo VIII. Однако в случае F-лиганда имеется вторая стадия роста интенсивно сти флуоресценции tCO, которая завершается к 1-й секунде при всех температурах (рис. 4). Кроме того, изменения на кинетических кривых взаимодействия F-содержащего ДНК-дуплекса с Endo VIII имеют большую амплитуду, чем в случае G-DNA, что может говорить как о большей эффективности образова ния комплекса между ферментом и ДНК, так и о бо лее значительных конформационных перестройках в структуре ДНК-дуплекса, содержащего F-сайт. В результате обработки полученных данных определена минимальная кинетическая схема ре акции, включающая две обратимые стадии образо вания фермент-субстратного комплекса (схема 3). Рассчитанные константы скорости реакций и кон станты равновесия приведены в табл. 3. Схема 3. Кинетический механизм взаимодействия Endo VIII с F-DNA , где E - фермент Endo VIII, F - ДНК-дуплекс, содер жащий F-сайт напротив флуорофорной группы tCO, (E•F)i - комплексы Endo VIII c F-DNA, ki и k-i - константы скорости прямых и обратных реакции каждой стадии. Взаимодействие Endo VIII с DHU-DNA На рис. 5А представлены кинетические кривые, полученные при взаимодействии Endo VIII с ДНК субстратом, содержащим 5,6-дигидроуридин (DHUDNA). Они имеют более сложный вид, чем в случае G-DNA и F-DNA. Во всех концентрационных сери ях, полученных при разных температурах (5-25°С), можно выделить сходные изменения интенсивности флуоресценции tCO (рис. 5Б). Анализ кинетических кривых, полученных при 5-15°С, показал, что на начальном участке (до 10 мс) происходит быстрый рост интенсивности флуоресценции tCO (фаза 1). При увеличении тем пературы это изменение интенсивности флуорес ценции практически пропадает. Вслед за 1-й фа зой роста можно выделить дальнейшее увеличение флуоресцентного сигнала при всех температурах. Длительность 2-й фазы роста снижалась с ростом температуры от ~300 мс при 5°С до ~80 мс при 25°С. Известно, что при связывании Endo VIII с ДНК происходит нарушение структуры двойной спира ли ДНК, выворачивание поврежденного нуклеотида и встраивание нескольких аминокислотных остатков фермента в двойную цепь ДНК [6]. Endo VIII форми рует обширную сеть контактов с ДНК, но при узна вании поврежденного нуклеотида наиболее значимы контакты, образуемые аминокислотными остатками триады Gln69-Leu70-Tyr71. На всех полученных кривых можно выделить фазу падения интенсивности флуоресценции tCO (фаза 3). Эта фаза имеет выраженную зависи мость от температуры. Так, при 5°С фаза падения интенсивности флуоресценции tCO длится до 10 с, а при 25°С лишь до 1 с. Такое изменение соответ ствует еще одной стадии, протекающей при образо вании фермент-субстратного комплекса. Поскольку снижение интенсивности флуоресценции tCO ука зывает на изменение микроокружения данной флу орофорной группы, можно предположить, что в этот момент времени происходит подстройка конфор маций фермента и ДНК для образования катали тически компетентного фермент-субстратного комплекса. Вслед за падением интенсивности флуоресценции tCO наблюдается увеличение флуоресцентного сиг нала (фаза 4), сопровождающееся выходом на плато (фаза 5). Скорее всего, 4-я фаза изменения интенсив ности флуоресценции отражает каталитические ста дии ферментативного процесса, а 5-я - диссоциацию комплекса фермента с продуктом реакции. Таким образом, в кинетических кривых взаимо действия эндонуклеазы VIII с ДНК-субстратом, со держащим остаток 5,6-дигидроуридина, выявлены пять фаз изменения интенсивности флуоресценции tCO. Минимальная кинетическая схема, описываю щая кинетические кривые, включает три обратимые стадии, ведущие к образованию фермент-субстрат ного комплекса, одну необратимую стадию, которую можно соотнести со стадией каталитической реак ции, и одну обратимую стадию диссоциации ком плекса фермент-продукт (схема 1). Рассчитанные значения констант скорости отдельных стадий и кон стант равновесия приведены в табл. 4. Термодинамические параметры взаимодействия Endo VIII с ДНК-субстратами Константы скорости отдельных стадий взаимо действия Endo VIII со всеми ДНК-субстратами при разных температурах использовали для расче та констант равновесия этих стадий (Ki). Константы равновесия отдельных стадий использовали для по лучения зависимости ln(Ki) от 1/T (уравнение Вант- Гоффа (1)) (рис. 6). Также получена зависимость ln(kcat/Т) от 1/Т (уравнение Эйринга (2)), характе ризующая необратимую каталитическую стадию в случае DHU-субстрата. Все зависимости имели линейный вид и позволили рассчитать изменения энтальпии и энтропии для обратимых стадий (ΔHi o и ΔSi o) и образования переходного состояния катали тической стадии (ΔHo,‡ и ΔSo,‡) (табл. 5). При анализе термодинамических параметров взаимодействия Endo VIII с ДНК-субстратами уда лось выделить некоторые общие особенности. Так, первичное связывание всех использованных ДНК субстратов с ферментом сопровождается небольшим уменьшением энтальпии и повышением энтропии. Это приводит к отрицательному значению изменения энергии Гиббса ΔGo 1 для первой стадии образования фермент-субстратного комплекса. При этом вели чина ΔGo 1,298 имеет близкое значение (от -7.0 до -7.4 ккал/моль) как для поврежденной, так и неповрежденной ДНК, что указывает на выгодное в энергети ческом плане взаимодействие фермента с ДНК. Величины термодинамических параметров первой стадии, полученные для G-DNA, F-DNA и DHU-DNA, свидетельствуют о том, что начальная стадия взаимодействия (до 10 мс) Endo VIII со всеми ДНК-дуплексами представляет собой один и тот же процесс. На стадии первичного связывания не обра зуются специфические контакты с поврежденным нуклеотидом. Узнавание поврежденного нуклеоти да происходит позднее - при его выворачивании из спирали ДНК и внедрении в спираль аминокислотных остатков «триады» Gln69-Leu70-Tyr71. Тем не менее, установлено [9], что Endo VIII использу ет Leu70 в качестве «сенсора» повреждений, и его интеркаляция в структуру дуплекса происходит на ранних этапах специфического фермент-суб стратного взаимодействия. Поэтому можно предпо ложить, что рост интенсивности флуоресценции tCO на начальном участке всех кинетических кривых отражает локальные конформационные измене ния ДНК-дуплекса при вклинивании остатка Leu70 в двойную спираль. Термодинамический анализ второй стадии свя зывания Endo VIII с ДНК-дуплексами, зарегистри рованной в случае F- и DHU-содержащих дуплек сов, выявил различие в протекании этой стадии. Положительное значение ΔGо 2,298 в случае F-DNA говорит о невыгодности этого процесса, который, по видимому, не протекает при низких температурах. В случае DHU-содержащего субстрата вторая ста дия образования фермент-субстратного комплек са является энергетически нейтральной, значение ΔGо 2,298 составляет -0.65 ккал/моль. У обоих ДНК дуплексов эта стадия сопровождается увеличени ем ΔHo и ΔSo. Согласно полученным ранее данным, на этой стадии происходит изгибание дуплекса, которое должно сопровождаться выворачиванием поврежденного нуклеотида в активный центр фер мента и полным встраиванием всех остатков триады Gln69-Leu70-Tyr71 в двойную спираль ДНК [8]. На третьей стадии взаимодействия Endo VIII с DHU-субстратом, которая предшествует катали тической реакции, происходит окончательная под стройка структуры активного центра для осущест вления каталитической стадии. Значительный рост энтропии на этой стадии, скорее всего, связан с де сольватацией полярных групп в области контак та фермент-ДНК, а также вытеснением молекул воды из бороздок ДНК-субстрата. Положительная величина изменения энтальпии ΔНо свидетельству ет о затратах энергии для создания каталитически активной конформации. Затем следует необратимая каталитическая стадия (стадия 4), в ходе которой гидролизуется N-гликозидная связь с поврежден ным основанием и в сахарофосфатном остове ДНК с 3′- и 5′-стороны от поврежденного нуклеотида об разуется разрыв. Каталитическая стадия протекает с большими затратами энергии, на что указывают положительные значения ΔGo,‡ 298 = 18.0 ккал/моль и ΔHo,‡ = 14.4 ккал/моль. Последняя стадия взаимо действия Endo VIII с DHU-содержащим субстра том - диссоциация комплекса фермента с продук том. Необходимо отметить, что ΔGо 298 (-6.2 ккал/моль) этой стадии имеет близкое значение с ΔGо 298 первич ного связывания ДНК (от -7.0 до -7.4 ккал/моль). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Для всех использованных в работе ДНК-субстратов ДНК-гликозилазы Endo VIII зарегистрированы из менения интенсивности флуоресценции 1,3-диаза-2 оксофеноксазина tCO в составе пары X:tCO (X = G, F, DHU). Показано, что первая фаза роста интенсивности флуоресценции tCO присутствует на кинетических кривых, полученных со всеми использованными суб стратами. Согласно полученным термодинамическим параметрам, эта стадия отражает одну и ту же ста дию первичного связывания Endo VIII с ДНК. По дан ным [7-9], эта стадия представляет собой закрытие доменов фермента и попытку встраивания Leu70 в двойную спираль ДНК. Вторая фаза роста интен сивности флуоресценции зарегистрирована только в случае ДНК-дуплексов, несущих поврежденный нуклеотид F или DHU. Это изменение соответству ет стадии образования второго фермент-субстратно го комплекса. Вероятно, на этой стадии происходит выворачивание поврежденного нуклеотида в актив ный центр Endo VIII и встраивание аминокислотных остатков фермента Endo VIII в двойную спираль ДНК. У DHU-DNA эта стадия продолжается вплоть до 1 с. Интересно отметить, что при этом происходит рост и энтальпии, и энтропии, однако изменение энергии Гиббса ΔGo i,298 на этой стадии близко к нулю (0.8 и -0.65 ккал/моль для F-DNA и DHU-DNA соответственно). Следовательно, энергетические затраты на изменение структуры молекул фермента и ДНК-субстрата ком пенсируются за счет роста энтропии системы. На ки нетических кривых (рис. 5), полученных для DHU содержащего дуплекса, видно, что за двумя фазами роста интенсивности флуоресценции tCO следует фаза падения, отражающая образование третьего фермент субстратного комплекса. На этой стадии осущест вляется окончательная проверка строения повреж денного нуклеотида и формирование каталитически активного комплекса. Интенсивность флуоресценции tCO при этом становится минимальной, что говорит о формировании наиболее гидрофобного окруже нии флуорофорной группы. Кроме того, эта стадия сопровождается ростом энтропии, свидетельству ющим, вероятно, о вытеснении молекул воды из об ласти контакта фермент-субстрат и, следовательно, компактизации фермент-субстратного комплекса. Значения термодинамических параметров быстро протекающих стадий процесса взаимодействия Endo VIII c ДНК согласуются с ранее полученными дан ными о механизме узнавания и превращения специфического сайта ферментом [7-9]. Относительные из менения термодинамических параметров отдельных быстропротекающих стадий ферментативного про цесса, катализируемого ДНК-гликозилазой Endo VIII, согласуются с величинами, полученными нами ранее для других ДНК-гликозилаз Fpg [19], hOGG1 [20] и Nth [22].

Об авторах

O. A. Кладова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: fedorova@niboch.nsc.ru
Россия

Н. A. Кузнецов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: nikita.kuznetsov@niboch.nsc.ru
Россия

O. С. Федорова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: fedorova@niboch.nsc.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы