Выделение, очистка и характеристика L,D-транспептидазы 2 Mycobacterium tuberculosis

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Туберкулез - опасное инфекционное заболевание, возбудителем которого является Mycobacterium tuberculosis. Число случаев туберкулеза с множе ственной и широкой лекарственной устойчивостью ежегодно возрастает [1]. Терапия туберкулеза за ключается в комбинированном применении четырех основных препаратов первого эшелона, в который входят: рифампицин - ингибитор ДНК-зависимой РНК-полимеразы; изониазид и пиразинамид - бло каторы синтеза миколовых кислот, необходимых для формирования клеточной стенки M. tuberculosis; этамбутол - ингибитор арабинозилтрансферазы, фермента, участвующего в синтезе арабиногалакта на. Лечение больных в активной фазе может длиться более 6 месяцев. В некоторых случаях M. tuberculosis может сохраняться в легких в так называемой стаци онарной фазе, когда рост бактерий замедлен, не на блюдается иммунного ответа и проявляется устой чивость к различным антибиотикам [2]. В этой связи большой интерес представляет поиск лекарственных средств, действующих на ранее не известные моле кулярные мишени, связанные с особенностями жиз недеятельности и структурной организацией возбу дителя туберкулеза. В последнее время понятными стали особенности формирования клеточной стенки ряда опасных патогенов, в том числе M. tuberculosis. В то время как у большинства бактерий главную роль в синтезе поперечных сшивок в пептидогли кане играют пенициллинсвязывающие ферменты D,D-транспептидазы, которые катализируют пере нос 3-го остатка мезо-диаминопимелиновой кислоты (m-DAP) или L-Lys на 4-й остаток D-Ala (4-3-сшив ки), образование большей части поперечных сшивок у M. tuberculosis осуществляют L,D-транспептидазы, катализирующие перенос 3-го остатка m-DAP на аналогичный остаток другой цепи пептидоглика на (3-3-сшивки) [3, 4], содержание которых в возбу дителе туберкулеза достигает 80%. Первоначально L,D-транспептидазы обнаружили у таких микроорганизмов, как Escherichia coli [5], Bacillus subtilis [6] и Enterococcus faecium [7], а о присутствии этих ферментов и их исключительной роли в формиро вании клеточной стенки у таких патогенов, как M. tuberculosis [8] и Helicobacter pylori [9], стало известно сравнительно недавно. Это открытие помогло понять причины низкой эффективности β-лактамных анти биотиков при туберкулезе и ряде других инфекци онных заболеваний: L,D-транспептидазы, в отличие от D,D-транспептидаз, не чувствительны к широко используемым пенициллинам и цефалоспоринам [10, 11]. Важность этих ферментов в функционировании микобактерий делает их одной из наиболее привле кательных мишеней для поиска ингибиторов с целью создания новых антибиотиков, обладающих противо туберкулезной активностью. L,D-транспептидазы относятся к классу амино ацилтрансфераз [КФ 2.3.2]. Они принадлежат к су персемейству белков с YkuD-доменами, название которому дала L,D-транспептидаза (YkuD-фермент) B. subtilis - первый фермент с известной кристалли ческой структурой [6]. Геном M. tuberculosis кодирует пять белков, содержащих домен, обладающий L,D транспептидазной активностью (участки Rv0116c, Rv0192, Rv0483, Rv1433 и Rv2518c) [11]. Наиболее активно экспрессируется L,D-транспептидаза вто рого типа (LdtMt2) [8], с которой связывают вы сокое содержание «неклассических» 3-3-сши вок в пептидогликане клеточной стенки патогена. Определены аминокислотные последовательности L,D-транспептидаз возбудителя туберкулеза, однако структуры установлены лишь у ферментов первого и второго типа (LdtMt1 и LdtMt2). Предшественник LdtMt2 состоит из 408 аминокислотных остатков, об разующих сигнальный пептид (Met1-Ala34) и цепь самого фермента (Cys35-Ala408), которую мож но разделить на три домена: два некаталитических IG-подобных домена А и В (остатки Ala55-Ser147 и Pro148-Gly250 соответственно), а также катали тический домен С (остатки Asp251-Ala408), облада ющий транспептидазной активностью. Ключевыми для катализа остатками LdtMt2 являются Cys354, His336 и Ser337, составляющие цепь переноса прото на [8]. Активный центр LdtMt2 не экспонирован непо средственно в раствор, а расположен под так называ емой «крышкой» Tyr298-Trp324 [12], формирующей три канала (A, B и C), по двум из которых (B и С) воз можна доставка субстрата в активный центр. Определена структура комплекса LdtMt2 с ди пептидным фрагментом (N-γ-D-глутамил-m-DAP) пептидогликана в активном центре фермента, PDB 3TUR [11], получены также структурные данные для ковалентных комплексов LdtMt2 с меропене мом и LdtMt1 с имипенемом [12, 13]. С использованием методов предстационарной кинетики изучена инактивация LdtMt1 различными β-лактамными соединениями, такими, как меропенем, имипенем, дорипенем и эртапенем [14]. Показано [15], что эф фективным ингибитором LdtMt могут быть не только карбапенемы, но и β-лактамный антибиотик пене мового ряда - фаропенем. Проведенное нами иссле дование взаимодействия фермента с тетрапептид ным фрагментом пептидогликана клеточной стенки, а также с известными β-лактамными ингибиторами при помощи методов молекулярного моделирова ния [16] позволило выявить особенности связыва ния N- и C-концевых фрагментов растущей цепи пептидогликана под действием LdtMt2 при обра зовании поперечных 3-3-сшивок и построить адек ватную полноатомную модель LdtMt2 для скринин га и оптимизации структуры ингибиторов (рис. 1). Особенность действия L,D-транспептидаз заключа ется в том, что эти ферменты связывают в активном центре две молекулы субстрата - одну в качестве ацильного донора, которая в дальнейшем образует промежуточный ацилфермент, другую - в качестве нуклеофила, которая после связывания с ацилфер ментом и переноса ацильной группы L-центра остат ка m-DAP одной цепи пептидогликана на аминогруп пу D-центра остатка m-DAP другой цепи формирует поперечную 3-3-сшивку пептидогликана клеточной стенки. Молекулярное моделирование показало, что связывание N-концевого фрагмента растущей цепи пептидогликана (ацильного донора), а также β-лактамных соединений, способных инактивиро вать фермент в результате образования стабильно го ацилфермента, происходит в канале С, в то время как C-концевой (нуклеофильный) фрагмент расту щей цепи связывается в канале В. Задача данной работы состояла в выделении, очистке и характеристике LdtMt2 из M. tuberculosis с целью получения препаратов фермента для экспериментального изучения ингибиторной способности соединений, отобранных в результате компьютерного скрининга. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Экспрессия LdtMt2 и LdtMt2_cut в E. coli, выделение и очистка Наряду с препаратом «полноразмерной» LdtMt2 при выполнении работы был также получен препа рат фермента, не содержащего в своей структуре домена А (мы назвали такой препарат LdtMt2_cut). Сравнительное изучение двух препаратов (LdtMt2 и LdtMt2_cut) могло помочь ответить на вопрос о влиянии домена А на каталитическую активность фермента. Для экспрессии фермента использова ли плазмиду pET-19b, несущую либо ген Rv2518c (LdtMt2), не содержащий участка, кодирующего сигнальный пептид (остатки Phe54-Ala408), либо ген Rv2518c_cut (LdtMt2_cut), в котором отсутствовал не только участок, кодирующий сигнальный пеп тид, но и домен А (остатки Pro148-Ala408). В обоих случаях на N-концах белка располагался концевой пептид, состоящий из 24 аминокислотных остатков: MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHM с декагисти диновым концевым фрагментом (His-tag). Колонии E. coli BL21(DE3) с трансформированной плазмидой pET-19b выращивали в среде LB в течение ночи. В дальнейшем переносили 100 мкл полученной куль туры в колбу с отбойниками со средой LB, содержа щей ампициллин (Amp) в концентрации 100 мкг/мл. Среду инкубировали при 37°С и 180 об/мин в течение 6-7 ч до достижения оптической плотности 0.6-0.8 при λ = 600 нм. Экспрессию фермента начинали, снижая тем пературу до 15°С и добавляя водный раствор CaCl2 до концентрации 2 мМ, изопропил-β-D-1 тиогалактопиранозид (IPTG) до концентрации 0.5 мМ и глицерин до 2% (по объему), и продолжали в течение 4, 24 и 48 ч. Все операции по выделению фермента проводили во льду, образцы центрифуги ровали при 4°С. Выделение проводили по стандарт ной методике использования колонок Protino Ni-TED 1000 (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co) для очистки белков, содержащих His-tag [17]. Клетки осаждали в центрифуге при 4000 об/мин и 4°С в течение 15 мин, сырую клеточную массу взвешивали, затем ресу спендировали в 3 мл LEW-буфера (50 мM NaH2PO4 pH 8.0, 0.3 М NaCl), добавляли лизоцим до концентрации 1 мг/мл, инкубировали в течение 30 мин и разруша ли под действием ультразвука в ледяной воде в те чение 10 мин. Полученный лизат центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин при 4°С, суперна тант фильтровали через 0.2-мкм фильтр и наносили на колонку Protino Ni-TED 1000, уравновешенную 2 мл LEW-буфера. Клеточные белки смывали двумя порциями (по 2 мл) LEW-буфера, LdtMt2 элюировали тремя порциями (по 1.5 мл) буфера для элюции (50 мM NaH2PO4, 0.3 М NaCl, 0.25 мМ имидазол, pH 8.0). Общую концентрацию белка и выход фермента кон тролировали на всех этапах очистки с использовани ем микробиуретового метода [18]. Определение концентрации SH-групп Свободные SH-группы титровали, используя реактив Эллмана 5,5’-дитиобис-2-нитробензойную кислоту (DTNB) в концентрации 10 мМ (4 мг/мл) в денату рирующем буфере (0.1 М Tрис-HCl, содержащем 6 М гуанидинхлорид, pH 8.0). В качестве модельно го соединения для построения калибровочной пря мой использовали N-ацетилцистеин (N-Ac-L-Cys). Готовили 0.2 мМ раствор N-Ac-L-Cys, в денатури рующий буфер добавляли 7 мкл реактива Эллмана в концентрации 10 мМ (4 мг/мл) и 5-55 мкл раствора N-Ac-L-Cys (2-22 мкM), чтобы общий объем смеси составлял 500 мкл. Полученную смесь инкубировали в течение 5 мин и определяли поглощение при 412 нм. Концентрацию SH-групп рассчитывали, используя значение коэффициента экстинкции образующейся 2-нитро-5-тиобензойной кислоты при 412 нм и pH 8.0, равное 14150 М-1см-1 [19]. Таким же образом титровали свободные SH группы в препаратах LdtMt2 и LdtMt2_cut. Образец объемом 62-125 мкл с известной концентрацией фер мента добавляли в денатурирующий буфер с 7 мкл реактива Эллмана, чтобы конечный объем смеси составлял 500 мкл, инкубировали в течение 5 мин и определяли поглощение при 412 нм. Концентрацию SH-групп в ферменте рассчитывали аналогично N-Ac-L-Cys. Определение активности LdtMt2 и LdtMt2_cut с использованием нитроцефина В настоящее время низкомолекулярные аналоги фрагмента клеточной стенки, которые могли быть удобными субстратами для определения активности фермента, не известны, поэтому активность LdtMt2 и его кинетику принято изучать с использованием хромогенного субстрата нитроцефина (рис. 2) [11]. Активность ферментных препаратов по отношению к нитроцефину определяли по величине абсорбции продукта гидролиза β-лактамного кольца при 486 нм в 0.02 M буфере HEPES рН 7.5 в присутствии 0.1 M KCl. Значение коэффициента экстинкции продукта принимали равным 20500 М-1см-1 [11]. Культивирование в восстанавливающих условиях для предотвращения инактивации фермента Проведенные нами опыты по выделению и очист ке LdtMt2 показали, что для получения активных препаратов фермента необходимо использовать восстанавливающие условия, которые препятству ют окислению каталитического остатка цистеина. С этой целью при культивировании продуцента за 3 ч до окончания экспрессии в среду добавляли дити отреитол (DTT) до концентрации 6 мМ. Выделение фермента также проводили в присутствии DTT. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В процессе получения препаратов LdtMt2 и LdtMt2_ cut для выявления оптимальных условий по вы ходу целевого фермента проводили экспрессию в течение различных промежутков времени: 4, 24 и 48 ч. В табл. 1 представлены результаты вы деления и очистки препаратов LdtMt2 и LdtMt2_ cut. Оптимальным для препаративного выделения и очистки препаратов было культивирование в те чение 24 ч: при сравнении с культивированием в те чение 48 ч имеется не только выигрыш во времени, но и более высокий выход очищенного фермента по белку. С помощью ПААГ-электрофореза пока зано, что посторонние белки не связываются на Ni-TED-колонках, а полученные препара ты по молекулярной массе соответствуют LdtMt2 40.9 кДа (Ala55-Ala408 + His-tag) и LdtMt2_cut 31.3 кДа (Pro148-Ala408 + His-tag) и обладают вы сокой степенью чистоты (рис. 3). В то же время ак тивность препарата LdtMt2, выделенного без добав ления восстанавливающих агентов, по отношению к нитроцефину была существенно ниже ожидаемой. Как показано ранее [11], каталитический остаток цистеина Cys354 способен подвергаться окислению, что может приводить к необратимой инактивации LdtMt2. Когда для предотвращения окисления ката литического остатка цистеина культивирование кле ток E. coli, а также выделение фермента проводили в восстанавливающих условиях с добавлением в сре ду дитиотреитола (DTT), выход белка существенно не изменился и составил 1.8 ± 0.2 мг с 50 мл культу ральной среды, однако каталитическая активность фермента оказалась существенно выше. Cтепень окисления SH-групп в препаратах LdtMt2 и LdtMt2_ cut, полученных при культивировании и выделении фермента в невосстанавливающих и восстанавли вающих условиях, оценивали с использованием ти трования SH-групп по методу Эллмана. Полученные результаты представлены в табл. 2. Добавление DTT в культуральную среду и выделение фермента в вос станавливающих условиях позволило предотвратить окисление каталитического Cys354 и получить пре парат LdtMt2 с почти в 2 раза более высокой удель ной активностью. Стоит также отметить, что очищенные препараты фермента были достаточно стабильными при хране нии (4°С, pH 7.5, 20 мМ HEPES, 0.1 М KCl) и практи чески не теряли активности в течение месяца. Этот факт в значительной степени способствует использо ванию полученных ферментных препаратов для из учения их каталитических свойств и тестирования потенциальных ингибиторов. Важной частью работы было получение ответа на вопрос о влиянии домена А на каталитическую ак тивность фермента. Сравнение активностей LdtMt2 и LdtMt2_cut показало, что после удаления домена А удельная активность препарата полноразмерно го фермента снижается более чем на порядок (см. табл. 3). Значения KM и Vmax реакции гидролиза ни троцефина, катализируемого LdtMt2 и LdtMt2_cut, определяли при анализе зависимости начальных скоростей от концентраций субстрата в интервале 5-160 мкМ (рис. 4). При определении значений ка талитических констант ферментативной реакции и расчете концентрации активных центров фермен та в препаратах LdtMt2 и LdtMt2_cut учитывали концентрацию свободных SH-групп. Падение актив ности полноразмерного фермента при удалении до мена А в основном обусловлено снижением катали тической константы, которая при переходе от LdtMt2 к LdtMt2_cut в реакции превращения нитроцефина снижается от 0.98 ± 0.05 c-1 до 0.08 ± 0.03 c-1, в то вре мя как значение константы Михаэлиса ухудшается незначительно - от 85 ± 7 до 102 ± 10 мкМ соответ ственно. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенная оптимизация условий экспрессии и очистки LdtMt2 показала, что наиболее про дуктивным путем получения активных фермент ных препаратов является культивирование клеток E. coli в течение 24 ч в среде LB в присутствии 0.2 мМ IPTG, 2 мМ CaCl2 и своевременное добавление вос станавливающих агентов (DTT) для предотвраще ния окисления каталитического Cys354. Получен высокоочищенный препарат LdtMt2 M. tuberculosis, не теряющий активности как минимум в течение месяца при хранении в буферном растворе 20 мМ HEPES, pH 7.5 при 4°С, который можно использовать для экспериментального изучения потенциальных ингибиторов фермента, отобранных в результате компьютерного скрининга. Охарактеризованы био химические и кинетические свойства препаратов полноразмерной LdtMt2 и LdtMt2_cut без домена А. Показано, что при удалении домена А, непосред ственно не связанного с каталитическим доменом С, активность полноразмерного фермента существенно снижается (более чем на порядок), в основном из-за снижения каталитической константы превращения нитроцефина. Взаимодействие между доменами и их роль в проявлении функциональных свойств полно размерного фермента требует дальнейшего изучения.

Об авторах

С. M. Балдин

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

T. A. Щербакова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

В. K. Швядас

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Автор, ответственный за переписку.
Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы