Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd2782010.32607/actanaturae.27820Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleStabilization of transaminases in aqueous-organic media by pyridoxal-5’-phosphate: a case study of transaminase from Desulfomonile tiedjeiСтабилизация трансаминаз в водно-органических средах пиридоксаль-5’-фосфатом на примере трансаминазы из Desulfomonile tiedjeiRudinaI. V.РудинаЮ. В.
Russian Federation

A.N. Bach Institute of Biochemistry

Институт биохимии имени А.Н. Баха

eubez@inbi.ras.ruBakunovaA. K.БакуноваА. К.
Russian Federation

A.N. Bach Institute of Biochemistry

Институт биохимии имени А.Н. Баха

eubez@inbi.ras.ruPopovV. O.ПоповВ. О.
Russian Federation

A.N. Bach Institute of Biochemistry; Department of Biology

Институт биохимии имени А.Н. Баха; биологический факультет

eubez@inbi.ras.ruBezsudnovaE. Yu.БезсудноваЕ. Ю.
Russian Federation

A.N. Bach Institute of Biochemistry

Институт биохимии имени А.Н. Баха

eubez@inbi.ras.ruResearch Center of Biotechnology of the Russian Academy of SciencesФедеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наукM. V. Lomonosov Moscow State UniversityМосковский государственный университет имени М.В. Ломоносова2204202618183901609202528012026Copyright ©; 2026, Rudina I.V., Bakunova A.K., Popov V.O., Bezsudnova E.Y.Copyright ©; 2026, Рудина Ю.В., Бакунова А.К., Попов В.О., Безсуднова Е.Ю.2026Rudina I.V., Bakunova A.K., Popov V.O., Bezsudnova E.Y.Рудина Ю.В., Бакунова А.К., Попов В.О., Безсуднова Е.Ю.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/27820

Pyridoxal-5’-phosphate (PLP)-dependent transaminases are highly efficient biocatalysts for the stereoselective synthesis of chiral amines, which are key building blocks in pharmaceuticals and chemical manufacturing. Fundamental research on enzymatic transamination includes the classical works of Alexander Braunstein, who discovered the transamination reaction; David Metzler, who studied the spectral properties of PLP-dependent enzymes; Esmond Snell, who investigated the kinetics of PLP-dependent enzymes; as well as studies by other Russian and international researchers. Despite extensive studies on PLP-dependent transaminases, their practical application remains limited. In addition to the unfavorable equilibrium of the transamination reaction and the narrow substrate specificity of transaminases, their stability under manufacturing conditions is a major constraint. Transaminase stability encompasses not only the structural integrity of the protein globule, but also the enzyme’s ability to retain the PLP cofactor. PLP dissociation leads to enzyme inactivation and termination of the reaction. Modern biocatalytic processes are predominantly designed for aqueous–organic media to increase the solubility of hydrophobic substrates to hundreds of grams per liter. Under these conditions, the stability of transaminases, as with other enzymes, decreases. In the context of these challenges, this work investigates the efficiency of PLP binding as a factor in stabilizing the active holoenzyme of the transaminase from Desulfomonile tiedjei in various aqueous–organic media. The study analyzes the transaminase stability and catalytic activity in the presence of methanol, DMSO, and Cyrene (up to 20% v/v), both in incubation mode and under reaction conditions. Particular attention is paid to the analysis of the effect of the amino acid substitution T199Q in the cofactor-binding region on the enzyme’s resistance to organic solvents. The present study contributes to addressing the practical problem of stabilizing transaminases in aqueous–organic media. The results also deepen our understanding of the molecular basis of the stability of PLP-dependent enzymes.

Пиридоксаль-5’-фосфат (PLP)-зависимые трансаминазы являются высокоэффективными биокатализаторами стереоселективного синтеза хиральных аминов – ключевых «строительных блоков» в фармацевтическом и химическом производствах. Фундаментальные исследования ферментативного трансаминирования включают классические работы Александра Браунштейна, открывшего реакцию переаминирования, Дэвида Метцлера, исследовавшего спектральные свойства пиридоксалевых ферментов, Эсмонда Снелла, изучавшего кинетику PLP-зависимых ферментов, и других российских и зарубежных ученых. Практическое применение PLP-зависимых трансаминаз ограничивается не только неблагоприятным равновесием реакции трансаминирования и узкой субстратной специфичностью, но и стабильностью трансаминаз в технологических условиях. Стабильность трансаминаз – это не только стабильность белковой глобулы, но и способность трансаминаз удерживать кофактор PLP, диссоциация которого приводит к инактивации фермента и остановке синтеза. Современные биокаталитические процессы разрабатываются преимущественно для водно-органических сред, чтобы повысить растворимость гидрофобных субстратов до концентраций в сотни г/л. В этих условиях стабильность трансаминаз, как и других ферментов, снижается. В контексте этих задач нами изучена эффективность связывания PLP в активном центре как фактора стабилизации холофермента трансаминазы из Desulfomonile tiedjei в разных водно-органических средах. Проанализирована стабильность и каталитическая активность трансаминазы в присутствии метанола, диметилсульфоксида и цирена (до 20% v/v) как в режиме инкубации, так и в реакционных условиях. Особое внимание уделено анализу влияния аминокислотной замены T199Q в области связывания кофактора на устойчивость фермента к действию органических растворителей. Проведенные исследования вносят вклад в решение прикладной задачи стабилизации трансаминаз в водно-органических средах. Полученные результаты углубляют понимание молекулярных основ стабильности PLP-зависимых ферментов.

transaminasesenzyme catalysisstabilityorganic solventsтрансаминазыферментативный катализстабильностьорганические растворителиRussian Science FoundationРоссийский научный фонд23-74-30004This work was supported by the Russian Science Foundation (project No. 23-74-30004).Работа поддержана Российским научным фондом, грант № 23-74-30004.Eliot AC, Kirsch JF. Pyridoxal phosphate enzymes: mechanistic, structural, and evolutionary considerations. Annu Rev Biochem. 2004;73(1):383-415. doi: 10.1146/annurev.biochem.73.011303.074021Braunstein AE. Amino group transfer. In: Boyer PD, ed. The Enzymes. 3rd ed. Academic Press; 1973;9:379-481. doi: 10.1016/S1874-6047(08)60122-5Braunstein AE. Amino group transfer. In: P.D. B, ed. The Enzymes. 3d ed. London: Acad. Press; 1973:379-481. doi: 10.1016/S1874-6047(08)60122-5Metzler DE, Ikawa M, Snell EE. A general mechanism for vitamin B6-catalyzed reactions. J Am Chem Soc. 1954;76(3):648-652. doi: 10.1021/ja01632a004Metzler CM, Metzler DE. Quantitative description of absorption spectra of a pyridoxal phosphate-dependent enzyme using lognormal distribution curves. Anal Biochem. 1987;166(2):313-327. doi: 10.1016/0003-2697(87)90580-XBraunstein AE, Shemyakin MM. Theory on amino acid metabolism processes catalyzed by pyridoxine enzymes. Biokhimiia. 1953;18(4):393-411. PMID: 13219089.Braunshtein AE, Shemiakin MM. Theory on amino acid metabolism processes catalyzed by pyridoxine enzymes. Biokhimia. 1953;18(4):393-411. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13219089.Borisov VV, Borisova SN, Kachalova GS, et al. Three-dimensional structure at 5 Å resolution of cytosolic aspartate transaminase from chicken heart. J Mol Biol. 1978;125(3):275-292. doi: 10.1016/0022-2836(78)90403-5Savile CK, Janey JM, Mundorff EC, et al. Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture. Science. 2010;329(5989):305-309. doi: 10.1126/science.1188934Savile CK, Janey JM, Mundorff EC, et al. Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture. Science (80-). 2010;329(5989):305-309. doi: 10.1126/science.1188934Guo F, Berglund P. Transaminase biocatalysis: optimization and application. Green Chem. 2017;19(2):333-360. doi: 10.1039/c6gc02328bLimanto J, Ashley ER, Yin J, et al. A highly efficient asymmetric synthesis of vernakalant. Org Lett. 2014;16(10):2716-2719. doi: 10.1021/ol501002aSlabu I, Galman JL, Lloyd RC, Turner NJ. Discovery, Engineering, and synthetic application of transaminase biocatalysts. ACS Catal. 2017;7(12):8263-8284. doi: 10.1021/acscatal.7b02686Yi D, Bayer T, Badenhorst CPS, et al. Recent trends in biocatalysis. Chem Soc Rev. 2021;50(14):8003-8049. doi: 10.1039/D0CS01575JDesai AA. Sitagliptin manufacture: a compelling tale of green chemistry, process intensification, and industrial asymmetric catalysis. Angew Chemie Int Ed Engl. 2011;50(9):1974-1976. doi: 10.1002/anie.201007051Desai AA. Sitagliptin manufacture: a compelling tale of green chemistry, process intensification, and industrial asymmetric catalysis. Angew Chemie Int Ed. 2011;50(9):1974-1976. doi: 10.1002/anie.201007051O’Connell A, Haarr MB, Ryan J, et al. Transaminase‐triggered cascades for the synthesis and dynamic kinetic resolution of chiral N‐heterocycles. Angew Chemie Int Ed Engl. 2025;64(21): e202422584. doi: 10.1002/anie.202422584O’Connell A, Haarr MB, Ryan J, et al. Transaminase‐triggered cascades for the synthesis and dynamic kinetic resolution of chiral N‐heterocycles. Angew Chemie Int Ed. 2025;64(21). doi: 10.1002/anie.202422584Ao YF, Pei S, Xiang C, et al. Structure‐ and data‐driven protein engineering of transaminases for improving activity and stereoselectivity. Angew Chemie Int Ed Engl. 2023;62(23):e202301660. doi: 10.1002/anie.202301660Ao Y, Pei S, Xiang C, et al. Structure‐ and data‐driven protein engineering of transaminases for improving activity and stereoselectivity. Angew Chemie Int Ed. 2023;62(23). doi: 10.1002/anie.202301660Ferrandi EE, Monti D. Amine transaminases in chiral amines synthesis: recent advances and challenges. World J Microbiol Biotechnol. 2017;34(1):13. doi: 10.1007/s11274-017-2395-2Ferrandi EE, Monti D. Amine transaminases in chiral amines synthesis: recent advances and challenges. World J Microbiol Biotechnol. 2018;34(1):13. doi: 10.1007/s11274-017-2395-2Wu S, Snajdrova R, Moore JC, Baldenius K, Bornscheuer UT. Biocatalysis: Enzymatic synthesis for industrial applications. Angew Chem Int Ed Engl. 2021;60(1):88-119. doi: 10.1002/anie.202006648Roura Padrosa D, Alaux R, Smith P, Dreveny I, López-Gallego F, Paradisi F. Enhancing PLP-binding capacity of class-III ω-transaminase by single residue substitution. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:282. doi: 10.3389/fbioe.2019.00282Padrosa DR, Alaux R, Smith P, Dreveny I, López-Gallego F, Paradisi F. Enhancing PLP-binding capacity of class-III ω-transaminase by single residue substitution. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7(October):1-13. doi: 10.3389/fbioe.2019.00282Börner T, Rämisch S, Reddem ER, et al. Explaining operational instability of amine transaminases: substrate-induced inactivation mechanism and influence of quaternary structure on enzyme–cofactor intermediate stability. ACS Catal. 2017;7(2):1259-1269. doi: 10.1021/acscatal.6b02100Bakunova AK, Isaikina TY, Popov VO, Bezsudnova EY. Asymmetric synthesis of enantiomerically pure aliphatic and aromatic D-amino acids catalyzed by transaminase from Haliscomenobacter hydrossis. Catalysts. 2022;12(12):1551. doi: 10.3390/catal12121551Bakunova AK, Rudina IV, Popov VO, Bezsudnova EY. Contribution of second-shell residues to PLP-dependent transaminase catalysis: a case study of D-amino acid transaminase from Desulfomonile tiedjei. Int J Mol Sci. 2025;26(17):8536. doi: 10.3390/ijms26178536Bakunova AK, Rudina I V., Popov VO, Bezsudnova EY. Contribution of second-shell residues to PLP-dependent transaminase catalysis: a case study of D-amino acid transaminase from Desulfomonile tiedjei. Int J Mol Sci. 2025;26(17):8536. doi: 10.3390/ijms26178536Sherwood J, De bruyn M, Constantinou A, et al. Dihydrolevoglucosenone (Cyrene) as a bio-based alternative for dipolar aprotic solvents. Chem Commun (Camb). 2014;50(68):9650-9652. doi: 10.1039/C4CC04133JSherwood J, De bruyn M, Constantinou A, et al. Dihydrolevoglucosenone (Cyrene) as a bio-based alternative for dipolar aprotic solvents. Chem Commun. 2014;50(68):9650-9652. doi: 10.1039/C4CC04133JDomínguez de María P. Biocatalysis and green solvents: trends, needs, and opportunities. In: Lozano P, ed. Biocatalysis in Green Solvents. Elsevier; 2022:511-527. doi: 10.1016/B978-0-323-91306-5.00013-3Domínguez de María P. Biocatalysis and green solvents: trends, needs, and opportunities. In: Biocatalysis in Green Solvents. Elsevier; 2022:511-527. doi: 10.1016/B978-0-323-91306-5.00013-3Polizzi KM, Bommarius AS, Broering JM, Chaparro-Riggers JF. Stability of biocatalysts. Curr Opin Chem Biol. 2007;11(2):220-225. doi: 10.1016/j.cbpa.2007.01.685Stepankova V, Bidmanova S, Koudelakova T, Prokop Z, Chaloupkova R, Damborsky J. Strategies for stabilization of enzymes in organic solvents. ACS Catal. 2013;3(12):2823-2836. doi: 10.1021/cs400684x