Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd2758310.32607/actanaturae.27583Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleThe generation and characterization of a mouse embryonic stem cell line with Psmb9 immunoproteasome gene knockoutПолучение и характеристика линии эмбриональных стволовых клеток мыши с нокаутом гена иммунопротеасомы Psmb9KrigerD. V.КригерД. В.
Russian Federation
daryamalikova@gmail.comPodenkovaU. I.ПоденковаУ. И.
Russian Federation
daryamalikova@gmail.comKuzminA. A.КузьминА. А.
Russian Federation
daryamalikova@gmail.coAksenovN. D.АксеновН. Д.
Russian Federation
daryamalikova@gmail.comKropachevaA. V.КропачеваА. В.
Russian Federation
daryamalikova@gmail.comZinovyevaA. S.ЗиновьеваА. С.
Russian Federation
daryamalikova@gmail.comSeleninaA. V.СеленинаА. В.
Russian Federation
daryamalikova@gmail.comTomilinA. N.ТомилинА. Н.
Russian Federation
daryamalikova@gmail.comTsimokhaA. S.ЦимохаА. С.
Russian Federation
atsimokha@incras.ruInstitute of Cytology, Russian Academy of SciencesИнститут цитологии РАН1410202517377870612202415052025Copyright ©; 2025, Kriger D.V., Podenkova U.I., Kuzmin A.A., Aksenov N.D., Kropacheva A.V., Zinovyeva A.S., Selenina A.V., Tomilin A.N., Tsimokha A.S.Copyright ©; 2025, Кригер Д.В., Поденкова У.И., Кузьмин А.А., Аксенов Н.Д., Кропачева А.В., Зиновьева А.С., Селенина А.В., Томилин А.Н., Цимоха А.С.2025Kriger D.V., Podenkova U.I., Kuzmin A.A., Aksenov N.D., Kropacheva A.V., Zinovyeva A.S., Selenina A.V., Tomilin A.N., Tsimokha A.S.Кригер Д.В., Поденкова У.И., Кузьмин А.А., Аксенов Н.Д., Кропачева А.В., Зиновьева А.С., Селенина А.В., Томилин А.Н., Цимоха А.С.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/27583

Immunoproteasomes, a unique type of proteasome complex, play a critical role in antigen presentation and cellular homeostasis. Unlike the constitutive 20S proteasome, the catalytic subunits β1, β2, and β5 in the immunoproteasome are replaced by inducible isoforms: β1i (LMP2), β2i (MECL-1), and β5i (LMP7). The expression of the genes encoding these subunits (Psmb9, Psmb10, and Psmb8) is activated by cytokines, primarily interferon-γ (IFNγ). Although it has been demonstrated more and more convincingly that immunoproteasomes are expressed in embryonic stem cells (ESCs), their involvement in maintaining pluripotency, promoting self-renewal, and regulating differentiation processes remains unexplored. This study implemented CRISPR/Cas9 technology to generate a Psmb9 gene knockout (Psmb9KO) mouse ESC line. The resulting cells exhibited a normal karyotype and morphology, maintained normal proliferation rates, and retained the capacity to form teratomas containing derivatives of all three germ layers. However, the differentiation induced by retinoic acid (RA) and IFNγ caused an accumulation of Mecl-1 precursors in Psmb9KO cells, suggesting modifications in immunoproteasome assembly. Furthermore, an increase in the caspase-like activity of immunoproteasomes was detected, suggesting the integration of a constitutive β1-subunit into the complex in place of Lmp2. The findings underscore the adaptability of the ubiquitin-proteasome system in maintaining cellular proteostasis by compensatory mechanisms that counteract the lack of Lmp2. The Psmb9KO line can serve as a valuable model for examining the function of immunoproteasomes in proteostasis regulation during early mammalian embryogenesis differentiation.

Иммунопротеасомы – специализированные протеасомные комплексы, играющие ключевую роль в презентации антигенов и регуляции клеточного гомеостаза. В отличие от конститутивной 20S протеасомы, каталитические субъединицы β1, β2 и β5 в иммунопротеасоме заменяются на индуцибельные изоформы: β1i (Lmp2), β2i (Mecl-1) и β5i (Lmp7). Экспрессия генов этих субъединиц (Psmb9, Psmb10 и Psmb8) активируется под действием цитокинов, главным образом интерферона-γ. Накапливаются данные, свидетельствующие об экспрессии иммунопротеасом в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК), однако их роль в поддержании плюрипотентности, процессах самообновления и дифференцировки не изучена. С использованием технологии CRISPR/Cas9 нами создана линия эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши с нокаутом гена Psmb9 (Psmb9KO). Клетки этой линии имеют нормальный кариотип, морфологию, пролиферативную активность и способность к образованию тератом, включающих производные всех трех зародышевых листков. Однако при дифференцировке под действием ретиноевой кислоты и интерферона-γ в клетках Psmb9KO накапливаются предшественники Mecl-1, что указывает на изменения в сборке иммунопротеасом. Кроме того, выявлено увеличение каспаза-подобной активности иммунопротеасом, что свидетельствует о включении конститутивной β1-субъединицы в состав комплекса вместо Lmp2. Показана пластичность убиквитин-протеасомной системы в поддержании протеостаза клетки за счет механизмов, компенсирующих отсутствие Lmp2. Линия Psmb9KO представляет собой удобную модель для изучения роли иммунопротеасом в регуляции протеостаза в дифференцировке на ранних этапах эмбриогенеза млекопитающих.

Psmb9Lmp2immunoproteasomemouse ESCsdifferentiationPsmb9Lmp2иммунопротеасомаэмбриональные стволовые клетки мышидифференцировкаRussian Science FoundationРоссийский научный фонд22-14-00390Ministry of Science and Higher Education of the Russian FederationМинистерство науки и высшего образования Российской Федерации075-15-2021-1075Jang H.H. // J. Cancer Prev. 2018. V. 23. № 4. P. 153–161. doi: 10.15430/JCP.2018.23.4.153.Abi Habib J., Lesenfants J., Vigneron N., van den Eynde B.J. // Cells. 2022. V. 11. № 3. P. 421. doi: 10.3390/cells11030421.Zhang H., Zhou C., Mohammad Z., Zhao J. // bioRxiv. 2024. doi: 10.1101/2024.08.08.607236.Budenholzer L., Cheng C.L., Li Y., Hochstrasser M. // J. Mol. Biol. 2017. V. 429. № 22. P. 3500–3524. doi: 10.1016/j.jmb.2017.05.027.Aki M., Shimbara N., Takashina M., Akiyama K., Kagawa S., Tamura T., Tanahashi N., Yoshimura T., Tanaka K., Ichihara A. // J. Biochem. 1994. V. 115. № 2. P. 257–269. doi: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a124327.Boes B., Hengel H., Ruppert T., Multhaup G., Koszinowski U.H., Kloetzel P.M. // J. Exp. Med. 1994. V. 179. № 3. P. 901–909. doi: 10.1084/jem.179.3.901.Strehl B., Seifert U., Kruger E., Heink S., Kuckelkorn U., Kloetzel P.M. // Immunol. Rev. 2005. V. 207. № 1. P. 19–30. doi: 10.1111/j.0105-2896.2005.00308.x.McCarthy M.K., Weinberg J.B. // Front. Microbiol. 2015. V. 6. № 1. P. 21. doi: 10.3389/fmicb.2015.00021.Chen B., Zhu H., Yang B., Cao J. // Acta Pharm. Sin. B. 2023. V. 13. № 5. P. 1976–1989. doi: 10.1016/j.apsb.2022.11.005.Chen B., Zhu H., Yang B., Cao J. // Acta. Pharm. Sin. B. 2023. V. 13. № 5. P. 1976–1989. doi: 10.1016/j.apsb.2022.11.005.Seifert U., Bialy L.P., Ebstein F., Bech-Otschir D., Voigt A., Schroter F., Prozorovski T., Lange N., Steffen J., Rieger M., et al. // Cell. 2010. V. 142. № 4. P. 613–624. doi: 10.1016/j.cell.2010.07.036.Basler M., Groettrup M. // Cells. 2021. V. 10. № 11. P. 1–18. doi: 10.3390/cells10113216.Atkinson S.P., Collin J., Irina N., Anyfantis G., Kyung B.K., Lako M., Armstrong L. // Stem Cells. 2012. V. 30. № 7. P. 1373–1384. doi: 10.1002/stem.1113.Hernebring M., Fredriksson A., Liljevald M., Cvijovic M., Norrman K., Wiseman J., Semb H., Nystrom T. // Sci. Rep. 2013. V. 3. № 1. P. 1381. doi: 10.1038/srep01381.Hernebring M., Brolen G., Aguilaniu H., Semb H., Nystrom T. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. № 20. P. 7700–7705. doi: 10.1073/pnas.0510944103.Kriger D., Podenkova U.I., Bakhmet E.I., Potapenko E., Ivanova E., Tomilin A.N., Tsimokha A.S. // Cells. 2024. V. 13. № 16. P. 1–13. doi: 10.3390/cells13161362.Podenkova U.I., Kriger D.V., Kuznetsov A.V., Kuzmin A.A., Koltunova L.A., Yevreiskaya A., Aksenov N.D., Fokin N.P., Selenina A.V., Tomilin A.N. // Cell Tissue Biol. 2025. V. 19. № 2. P. 130–140. doi: 10.1134/S1990519X24600741.Bakhmet E.I., Ponomartsev S.V., Dyban P.A., Nazarov I.B., Kuzmin A.A., Aksenov N.D., Potapenko E., Gordeev M.N., Tomilin A.N. // Cell Tissue Biol. 2020. V. 14. № 6. P. 413–418. doi: 10.1134/S1990519X20060036.Gordeev M.N., Zinovyeva A.S., Petrenko E.E., Lomert E.V., Aksenov N.D., Tomilin A.N., Bakhmet E.I. // Acta Naturae. 2024. V. 16. № 4. P. 12–22. doi: 10.32607/actanaturae.27510.Kriger D., Novitskaya K., Vasileva G., Lomert E., Aksenov N.D., Barlev N.A., Tentler D. // Biol. Direct. 2022. V. 17. № 1. P. 1–13. doi: 10.1186/s13062-022-00354-6.Kulichkova V.A., Artamonova T.O., Zaykova J.J., Ermolaeva J.B., Khodorkovskii M.A., Barlev N.A., Tomilin A.N., Tsimokha A.S. // Mol. Biotechnol. 2015. V. 57. № 1. P. 36–44. doi: 10.1007/s12033-014-9799-0.Chen X., Mao Y., Guo Y., Xiao D., Lin Z., Huang Y., Liu Y.C., Zhang X., Wang Y. // J. Transl. Med. 2023. V. 21. № 1. P. 1–16. doi: 10.1186/s12967-023-04071-0.Cui Z., Hwang S.M., Gomes A.V. // Mol. Cell. Biol. 2014. V. 34. № 1. P. 96–109. doi: 10.1128/MCB.00622-13.Hensley S.E., Zanker D., Dolan B.P., David A., Hickman H.D., Embry A.C., Skon C.N., Grebe K.M., Griffin T.A., Chen W., et al. // J. Immunol. 2010. V. 184. № 8. P. 4115–4122. doi: 10.4049/jimmunol.0903003.Sibille C., Gould K.G., Willard-Gallo K., Thomson S., Rivett A.J., Powis S., Butcher G.W., De Baetselier P. // Curr. Biol. 1995. V. 5. № 8. P. 923–930. doi: 10.1016/s0960-9822(95)00182-5.van Kaer L., Ashton-Rickardt P.G., Eichelberger M., Gaczynska M., Nagashima K., Rock K.L., Goldberg A.L., Doherty P.C., Tonegawa S. // Immunity. 1994. V. 1. № 7. P. 533–541. doi: 10.1016/1074-7613(94)90043-4.Chen W., Norbury C.C., Cho Y., Yewdell J.W., Bennink J.R. // J. Exp. Med. 2001. V. 193. № 11. P. 1319–1326. doi: 10.1084/jem.193.11.1319.Kim M., Serwa R.A., Samluk L., Suppanz I., Kodron A., Stepkowski T.M., Elancheliyan P., Tsegaye B., Oeljeklaus S., Wasilewski M., et al. // Nat. Commun. 2023. V. 14. № 1. P. 1–23. doi: 10.1038/s41467-023-39642-8.Guo Y., Wang S., Li L., Zhang H., Chen X., Huang Z., Liu Y. // Mol. Neurobiol. 2024. V. 61. № 1. P. 28–41. doi: 10.1007/s12035-023-03564-9.Choi J.H., Jo H.S., Lim S., Kim H.T., Lee K.W., Moon K.H., Ha T., Kwak S.S., Kim Y., Lee E.J., et al. // Nat. Commun. 2018. V. 9. № 1. P. 1–16. doi: 10.1038/s41467-018-04774-9.Brown M.G., Driscoll J., Monaco J.J. // Nature. 1991. V. 353. № 6342. P. 355–357. doi: 10.1038/353355a0.Bedzhov I., Zernicka-Goetz M. // Cell. 2014. V. 156. № 5. P. 1032–1044. doi: 10.1016/j.cell.2014.01.023.Shahbazi M.N., Scialdone A., Skorupska N., Weberling A., Recher G., Zhu M., Jedrusik A., Devito L.G., Noli L., Macaulay I.C., et al. // Nature. 2017. V. 552. № 7684. P. 239–243. doi: 10.1038/nature24675.Gordeev M.N., Bakhmet E.I., Tomilin A.N. // Rus. J. Devel. Biol. 2021. V. 52. № 6. P. 429–440. doi: 10.31857/s0475145021060057.Kim I.S., Wu J., Rahme G.J., Battaglia S., Dixit A., Gaskell E., Chen H., Pinello L., Bernstein B.E. // Cell Rep. 2020. V. 33. № 1. P. 1–15. doi: 10.1016/j.celrep.2020.108222.Mohammed H., Hernando-Herraez I., Savino A., Scialdone A., Macaulay I., Mulas C., Chandra T., Voet T., Dean W., Nichols J., et al. // Cell. Rep. 2017. V. 20. № 5. P. 1215–1228. doi: 10.1016/j.celrep.2017.07.009.Kojima Y., Tam O.H., Tam P.P. // Semin. Cell. Dev. Biol. 2014. V. 34. № 1. P. 65–75. doi: 10.1016/j.semcdb.2014.06.010.Snow M.H.L. // Development. 1977. V. 42. № 1. P. 293–303. doi: 10.1242/dev.42.1.293.Heink S., Ludwig D., Kloetzel P.M., Kruger E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. № 26. P. 9241–9246. doi: 10.1073/pnas.0501711102.