Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd2751010.32607/actanaturae.27510Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleEmbryonic Stem Cell Differentiation to Definitive Endoderm As a Model of Heterogeneity Onset During Germ Layer SpecificationДифференцировка эмбриональных стволовых клеток в направлении дефинитивной энтодермы как модель возникновения гетерогенности во время спецификации зародышевых листковGordeevM. N.ГордеевМ. Н.
Russian Federation

Pluripotency Dynamics Group, Laboratory of the Molecular Biology of Stem Cells, Institute of Evolution

Группа динамики плюрипотентности, лаборатория молекулярной биологии стволовых клеток, Институт эволюции

a.tomilin@incras.ruZinovyevaA. S.ЗиновьеваА. С.
Russian Federation

Pluripotency Dynamics Group, Laboratory of the Molecular Biology of Stem Cells

Группа динамики плюрипотентности, лаборатория молекулярной биологии стволовых клеток

a.tomilin@incras.ruPetrenkoE. E.ПетренкоЕ. Е.
Russian Federation

Pluripotency Dynamics Group, Laboratory of the Molecular Biology of Stem Cells, Faculty of Biology

Группа динамики плюрипотентности, лаборатория молекулярной биологии стволовых клеток, факультет биологии

a.tomilin@incras.ruLomertE. V.ЛомертЕ. В.
Russian Federation

Laboratory of Molecular Medicine

лаборатория молекулярной медицины

a.tomilin@incras.ruAksenovN. D.АксеновН. Д.
Russian Federation

Department of Intracellular Signaling and Transport

отдел внутриклеточного сигналинга и транспорта

a.tomilin@incras.ruTomilinA. N.ТомилинА. Н.
Russian Federation

Laboratory of the Molecular Biology of Stem Cells

лаборатория молекулярной биологии стволовых клеток

a.tomilin@incras.ruBakhmetE. I.БахметЕ. И.
Russian Federation

Pluripotency Dynamics Group, Laboratory of the Molecular Biology of Stem Cells

Группа динамики плюрипотентности, лаборатория молекулярной биологии стволовых клеток

e.bakhmet@incras.ruInstitute of Cytology, Russian Academy of SciencesИнститут цитологии РАНUniversity of HaifaУниверситет ХайфыTechnion – Israel Institute of TechnologyТехнион – Институт Технологий Израиля0912202416462722908202423102024Copyright ©; 2024, Gordeev M.N., Zinovyeva A.S., Petrenko E.E., Lomert E.V., Aksenov N.D., Tomilin A.N., Bakhmet E.I.Copyright ©; 2024, Gordeev M., Zinovyeva A., Petrenko E., Lomert E., Aksenov N., Tomilin A., Bakhmet E.2024Gordeev M.N., Zinovyeva A.S., Petrenko E.E., Lomert E.V., Aksenov N.D., Tomilin A.N., Bakhmet E.I.Gordeev M., Zinovyeva A., Petrenko E., Lomert E., Aksenov N., Tomilin A., Bakhmet E.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/27510

Embryonic stem cells (ESCs) hold great promise for regenerative medicine thanks to their ability to self-renew and differentiate into somatic cells and the germline. ESCs correspond to pluripotent epiblast — the tissue from which the following three germ layers originate during embryonic gastrulation: the ectoderm, mesoderm, and endoderm. Importantly, ESCs can be induced to differentiate toward various cell types by varying culture conditions, which can be exploited for in vitro modeling of developmental processes such as gastrulation. The classical model of gastrulation postulates that mesoderm and endoderm specification is made possible through the FGF-, BMP-, Wnt-, and Nodal-signaling gradients. Hence, it can be expected that one of these signals should direct ESC differentiation towards specific germ layers. However, ESC specification appears to be more complicated, and the same signal can be interpreted differently depending on the readout. In this research, using chemically defined culture conditions, homogeneous naïve ESCs as a starting cell population, and the Foxa2 gene-driven EGFP reporter tool, we established a robust model of definitive endoderm (DE) specification. This in vitro model features formative pluripotency as an intermediate state acquired by the epiblast in vivo shortly after implantation. Despite the initially homogeneous state of the cells in the model and high Activin concentration during endodermal specification, there remains a cell subpopulation that does not reach the endodermal state. This simple model developed by us can be used to study the origins of cellular heterogeneity during germ layer specification.

Использование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в регенеративной медицине крайне перспективно благодаря их способности к самообновлению и дифференцировке как в соматические клетки, так и в половые клетки. ЭСК соответствуют плюрипотентному эпибласту – ткани, которая дает начало трем зародышевым листкам (эктодерме, мезодерме и энтодерме) в ходе гаструляции. Важно отметить, что ЭСК можно дифференцировать в различные клеточные типы, изменяя условия культивирования, что может быть использовано для моделирования гаструляции in vitro. Классическая модель гаструляции предполагает, что спецификация мезодермы и энтодермы обеспечивается градиентом сигналов FGF, BMP, Wnt и Nodal. Логично предположить, что каждый из этих сигналов должен направлять дифференцировку ЭСК в производные определенного зародышевого листка. Однако, по-видимому, спецификация ЭСК организована сложнее, а один и тот же сигнал может быть интерпретирован клетками по-разному. Используя культуральные среды с полностью определенным химическим составом, однородную популяцию «наивных» ЭСК в качестве исходной клеточной линии, а также репортерную систему Foxa2-EGFP, мы создали надежную модель развития дефинитивной энтодермы (ДЭ). Эта модель in vitro воспроизводит состояние «формативной» плюрипотентности как промежуточной стадии, которую проходит эпибласт сразу после имплантации in vivo. Несмотря на изначально однородное состояние популяции и высокую концентрацию активина во время энтодермальной дифференцировки, остается субпопуляция клеток, которая не дифференцируется в энтодерму. Разработанная нами модель может быть использована для исследования возникновения клеточной неоднородности во время гаструляции.

pluripotencyspecificationdifferentiationembryonic stem cellsESCsCRISPR/Cas9gastrulationendodermFoxa2плюрипотентностьспецификациядифференцировкаэмбриональные стволовые клеткиЭСКCRISPR/Cas9гаструляцияэнтодермаFoxa2Russian Science FoundationРоссийский научный фонд23-75-10096Martin G.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. № 12. P. 7634–7638.Evans M.J., Kaufman M.H. // Nature. 1981. V. 292. № 5819. P. 154–156.Takahashi K., Yamanaka S. // Cell. 2006. V. 126. № 4. P. 663–676.Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. // Cell. 2007. V. 131. № 5. P. 861–872.Boroviak T., Loos R., Bertone P., Smith A., Nichols J. // Nat. Cell. Biol. 2014. V. 16. № 6. P. 516–528.Plusa B., Hadjantonakis A.K. // Nat. Cell. Biol. 2014. V. 16. № 6. P. 502–504.Schrode N., Xenopoulos P., Piliszek A., Frankenberg S., Plusa B., Hadjantonakis A.K. // Genesis. 2013. V. 51. № 4. P. 219–233.Tarkowski A.K. // Nature. 1959. V. 24. № 184. P. 1286–1287.Tam P.P., Loebel D.A. // Nat. Rev. Genet. 2007. V. 8. № 5. P. 368–381.Baker C.L., Pera M.F. // Cell. Stem Cell. 2018. V. 22. № 1. P. 25–34.Arnold S.J., Robertson E.J. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009. V. 10. № 2. P. 91–103.Conlon F.L., Lyons K.M., Takaesu N., Barth K.S., Kispert A., Herrmann B., Robertson E.J. // Development. 1994. V. 120. № 7. P. 1919–1928.Mishina Y., Suzuki A., Ueno N., Behringer R.R. // Genes Dev. 1995. V. 9. № 15. P. 3027–3037.Liu P., Wakamiya M., Shea M.J., Albrecht U., Behringer R.R., Bradley A. // Nat. Genet. 1999. V. 22. № 4. P. 361–365.Lu C.C., Robertson E.J. // Dev. Biol. 2004. V. 273. № 1. P. 149–159.Gattiglio M., Protzek M., Schroter C. // Biol. Open. 2023. V. 12. № 8. bio059941.Nowotschin S., Hadjantonakis A.K., Campbell K. // Development. 2019. V. 146. № 11. dev150920.Shahbazi M.N., Zernicka-Goetz M. // Nat. Cell Biol. 2018. V. 20. № 8. P. 878–887.Vincent S.D., Dunn N.R., Hayashi S., Norris D.P., Robertson E.J. // Genes Dev. 2003. V. 17. № 13. P. 1646–1662.D’Amour K.A., Agulnick A.D., Eliazer S., Kelly O.G., Kroon E., Baetge E.E. // Nat. Biotechnol. 2005. V. 23. № 12. P. 1534–1541.Si-Tayeb K., Noto F.K., Nagaoka M., Li J., Battle M.A., Duris C., North P.E., Dalton S., Duncan S.A. // Hepatology. 2010. V. 51. № 1. P. 297–305.Kaestner K.H. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2010. V. 20. № 5. P. 527–532.Ang S.L., Rossant J. // Cell. 1994. V. 78. № 4. P. 561–574.Fu S., Fei Q., Jiang H., Chuai S., Shi S., Xiong W., Jiang L., Lu C., Atadja P., Li E., et al. // PLoS One. 2011. V. 6. № 11. P. e27965.Wang P., Rodriguez R.T., Wang J., Ghodasara A., Kim S.K. // Cell Stem Cell. 2011. V. 8. № 3. P. 335–346.Arnold S.J., Hofmann U.K., Bikoff E.K., Robertson E.J. // Development. 2008. V. 135. № 3. P. 501–511.Dufort D., Schwartz L., Harpal K., Rossant J. // Development. 1998. V. 125. № 16. P. 3015–3025.Loh K.M., Lim B., Ang L.T. // Physiol. Rev. 2015. V. 95. № 1. P. 245–295.Malleshaiah M., Padi M., Rue P., Quackenbush J., Martinez-Arias A., Gunawardena J. // Cell Rep. 2016. V. 14. № 5. P. 1181–1194.Thomson M., Liu S.J., Zou L.N., Smith Z., Meissner A., Ramanathan S. // Cell. 2011. V. 145. № 6. P. 875–889.Valcourt J.R., Huang R.E., Kundu S., Venkatasubramanian D., Kingston R.E., Ramanathan S. // Cell Repts. 2021. V. 37. № 6. P. 109990.Koch F., Scholze M., Wittler L., Schifferl D., Sudheer S., Grote P., Timmermann B., Macura K., Herrmann B.G. // Dev Cell. 2017. V. 42. № 5. P. 514–526.Xu R.H., Sampsell-Barron T.L., Gu F., Root S., Peck R.M., Pan G., Yu J., Antosiewicz-Bourget J., Tian S., Stewart R., et al. // Cell Stem Cell. 2008. V. 3. № 2. P. 196–206.Vallier L., Mendjan S., Brown S., Chng Z., Teo A., Smithers L.E., Trotter M.W., Cho C.H., Martinez A., Rugg-Gunn P., et al. // Development. 2009. V. 136. № 8. P. 1339–1349.Teo A.K., Arnold S.J., Trotter M.W., Brown S., Ang L.T., Chng Z., Robertson E.J., Dunn N.R., Vallier L. // Genes Dev. 2011. V. 25. № 3. P. 238–250.Ying Q.-L., Wray J., Nichols J., Batlle-Morera L., Doble B., Woodgett J., Cohen P., Smith A. // Nature. 2008. V. 453. № 7194. P. 519–523.Choi J., Huebner A.J., Clement K., Walsh R.M., Savol A., Lin K., Gu H., Di Stefano B., Brumbaugh J., Kim S.Y., et al. // Nature. 2017. V. 548. № 7666. P. 219–223.Yagi M., Kishigami S., Tanaka A., Semi K., Mizutani E., Wakayama S., Wakayama T., Yamamoto T., Yamada Y. // Nature. 2017. V. 548. № 7666. P. 224–227.Hayashi K., Ohta H., Kurimoto K., Aramaki S., Saitou M. // Cell. 2011. V. 146. № 4. P. 519–532.Buecker C., Srinivasan R., Wu Z., Calo E., Acampora D., Faial T., Simeone A., Tan M., Swigut T., Wysocka J. // Cell Stem Cell. 2014. V. 14. № 6. P. 838–853.Kinoshita M., Smith A. // Development, Growth & Differentiation. 2018. V. 60. № 1. P. 44–52.Morgani S., Nichols J., Hadjantonakis A.K. // BMC Dev. Biol. 2017. V. 17. № 1. P. 7.Kinoshita M., Barber M., Mansfield W., Cui Y., Spindlow D., Stirparo G.G., Dietmann S., Nichols J., Smith A. // Cell Stem Cell. 2020. V. 28. № 3. P. 453–471.Yu L., Wei Y., Sun H.X., Mahdi A.K., Pinzon Arteaga C.A., Sakurai M., Schmitz D.A., Zheng C., Ballard E.D., Li J., et al. // Cell Stem Cell. 2020. V. 28. № 3. P. 550–567.Wang X., Xiang Y., Yu Y., Wang R., Zhang Y., Xu Q., Sun H., Zhao Z.A., Jiang X., Wang X., et al. // Cell Res. 2021. V. 31. № 5. P. 526–541.Pera M.F., Rossant J. // Cell Stem Cell. 2021. V. 28. № 11. P. 1896–1906.Turing A.M. // Bull. Math. Biol. 1990. V. 52. № 1–2. P. 153–197; discussion 119–152.Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A., Ran F.A., Konermann S., Agarwala V., Li Y., Fine E.J., Wu X., Shalem O., et al. // Nat. Biotechnol. 2013. V. 31. № 9. P. 827–832.Ponomartsev S.V., Sinenko S.A., Skvortsova E.V., Liskovykh M.A., Voropaev I.N., Savina M.M., Kuzmin A.A., Kuzmina E.Y., Kondrashkina A.M., Larionov V., et al. // Cells. 2020. V. 9. № 4. Р. 879.Shi Y., Kirwan P., Livesey F.J. // Nat. Protoc. 2012. V. 7. № 10. P. 1836–1846.Morgani S.M., Metzger J.J., Nichols J., Siggia E.D., Hadjantonakis A.K. // Elife. 2018. V. 7. e32839.Warmflash A., Sorre B., Etoc F., Siggia E.D., Brivanlou A.H. // Nat. Methods. 2014. V. 11. № 8. P. 847–854.Bardot E., Calderon D., Santoriello F., Han S., Cheung K., Jadhav B., Burtscher I., Artap S., Jain R., Epstein J., et al. // Nat. Commun. 2017. V. 8. P. 14428.Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Tweedie S., Smith A. // Cell. 2003. V. 113. № 5. P. 643–655.Hart A.H., Hartley L., Ibrahim M., Robb L. // Dev. Dyn. 2004. V. 230. № 1. P. 187–198.Hoffman J.A., Wu C.I., Merrill B.J. // Development. 2013. V. 140. № 8. P. 1665–1675.Aubert J., Stavridis M.P., Tweedie S., O’Reilly M., Vierlinger K., Li M., Ghazal P., Pratt T., Mason J.O., Roy D., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. Suppl 1. P. 11836–11841.Sladitschek H.L., Neveu P.A. // Mol. Syst. Biol. 2019. V. 15. № 12. P. e9043.Fehling H.J., Lacaud G., Kubo A., Kenned y M., Robertson S., Keller G., Kouskoff V. // Development. 2003. V. 130. № 17. P. 4217–4227.Tewary M., Ostblom J., Prochazka L., Zulueta-Coarasa T., Shakiba N., Fernandez-Gonzalez R., Zandstra P.W. // Development. 2017. V. 144. № 23. P. 4298–4312.Aguilera-Castrejon A., Oldak B., Shani T., Ghanem N., Itzkovich C., Slomovich S., Tarazi S., Bayerl J., Chugaeva V., Ayyash M., et al. // Nature. 2021. V. 593. № 7857. P. 119–124.Amadei G., Lau K.Y.C., De Jonghe J., Gantner C.W., Sozen B., Chan C., Zhu M., Kyprianou C., Hollfelder F., Zernicka-Goetz M. // Dev. Cell. 2021. V. 56. № 3. P. 366–382.e9.Liu X., Tan J.P., Schroder J., Aberkane A., Ouyang J.F., Mohenska M., Lim S.M., Sun Y.B.Y., Chen J., Sun G., et al. // Nature. 2021. V. 591. № 7851. P. 627–632.Rossant J., Tam P.P.L. // Stem Cell Reports. 2021. V. 16. № 5. P. 1031–1038.Yu L., Wei Y., Duan J., Schmitz D.A., Sakurai M., Wang L., Wang K., Zhao S., Hon G.C., Wu J. // Nature. 2021. V. 591. № 7851. P. 620–626.van den Brink S.C., van Oudenaarden A. // Trends Cell Biol. 2021. V. 31. № 9. P. 747–759.Amadei G., Handford C.E., Qiu C., De Jonghe J., Greenfeld H., Tran M., Martin B.K., Chen D.Y., Aguilera-Castrejon A., Hanna J.H., et al. // Nature. 2022. V. 610. № 7930. P. 143–153.Tarazi S., Aguilera-Castrejon A., Joubran C., Ghanem N., Ashouokhi S., Roncato F., Wildschutz E., Haddad M., Oldak B., Gomez-Cesar E., et al. // Cell. 2022. V. 185. № 18. P. 3290–3306 e25.Niwa H., Miyazaki J.-I., Smith A.G. // Nat. Genet. 2000. V. 24. № 4. P. 372–376.Masui S., Nakatake Y., Toyooka Y., Shimosato D., Yagi R., Takahashi K., Okochi H., Okuda A., Matoba R., Sharov A.A., et al. // Nat. Cell Biol. 2007. V. 9. № 6. P. 625–635.Ivanova N., Dobrin R., Lu R., Kotenko I., Levorse J., DeCoste C., Schafer X., Lun Y., Lemischka I.R. // Nature. 2006. V. 442. № 7102. P. 533–538.Wang Z., Oron E., Nelson B., Razis S., Ivanova N. // Cell Stem Cell. 2012. V. 10. № 4. P. 440–454.Surmacz B., Fox H., Gutteridge A., Fish P., Lubitz S., Whiting P. // Stem Cells. 2012. V. 30. № 9. P. 1875–1884.Tristan C.A., Ormanoglu P., Slamecka J., Malley C., Chu P.-H., Jovanovic V.M., Gedik Y., Jethmalani Y., Bonney C., Barnaeva E., et al. // Stem Cell Repts. 2021. V. 16. № 12. P. 3076–3092.Brons I.G., Smithers L.E., Trotter M.W., Rugg-Gunn P., Sun B., Chuva de Sousa Lopes S.M., Howlett S.K., Clarkson A., Ahrlund-Richter L., Pedersen R.A., et al. // Nature. 2007. V. 448. № 7150. P. 191–195.Tesar P.J., Chenoweth J.G., Brook F.A., Davies T.J., Evans E.P., Mack D.L., Gardner R.L., McKay R.D. // Nature. 2007. V. 448. № 7150. P. 196–199.Nakaki F., Hayashi K., Ohta H., Kurimoto K., Yabuta Y., Saitou M. // Nature. 2013. V. 501. № 7466. P. 222–226.Kojima Y., Kaufman-Francis K., Studdert J.B., Steiner K.A., Power M.D., Loebel D.A., Jones V., Hor A., de Alencastro G., Logan G.J., et al. // Cell Stem Cell. 2014. V. 14. № 1. P. 107–120.Morgani S.M., Hadjantonakis A.K. // Curr. Top. Dev. Biol. 2020. V. 137. P. 391–431.Nakamura T., Mine N., Nakaguchi E., Mochizuki A., Yamamoto M., Yashiro K., Meno C., Hamada H. // Dev. Cell. 2006. V. 11. № 4. P. 495–504.Shen M.M. // Development. 2007. V. 134. № 6. P. 1023–1034.Kondo S., Miura T. // Science. 2010. V. 329. № 5999. P. 1616–1620.