Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1187810.32607/actanaturae.11878Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleCreation of Recombinant Biocontrol Agents by Genetic Programming of YeastГенетическое программирование дрожжей для создания рекомбинантных агентов биоконтроляPipiyaSofiya O.ПипияСофия Онисеевна
Russian Federation
pipiyasofiya@ibch.ruMirzoevaNisso Z.МирзоеваНиссо Зафаровна
Russian Federation
pipiyasofiya@ibch.ruBaranovaMargarita N.БарановаМаргарита Николаевна
Russian Federation
pipiyasofiya@ibch.ruEliseevIgor E.ЕлисеевИгорь Евгеньевич
Russian Federation
pipiyasofiya@ibch.ruMokrushinaYuliana A.МокрушинаЮлиана Анатольевна
Russian Federation
pipiyasofiya@ibch.ruShamovaOlga V.ШамоваОльга Валерьевна
Russian Federation
pipiyasofiya@ibch.ruGabibovAlexander G.ГабибовАлександр Габибович
Russian Federation
pipiyasofiya@ibch.ruSmirnovIvan V.СмирновИван Витальевич
Russian Federation
pipiyasofiya@ibch.ruTerekhovStanislav S.ТереховСтанислав Сергеевич
Russian Federation
pipiyasofiya@ibch.ruInstitute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov, Russian Academy of SciencesИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАНLomonosov Moscow State University M.V. LomonosovМосковский государственный университет им. М.В. ЛомоносоваInstitute of Experimental MedicineИнститут экспериментальной медициныFederal State Budgetary Institution “National Medical Research Center of Endocrinology” of the Ministry of Health of the Russian FederationНациональный медицинский исследовательский центр эндокринологии Министерства здравоохранения Российской Федерации0305202315174801412202206032023Copyright ©; 2023, Pipiya S.O., Mirzoeva N.Z., Baranova M.N., Eliseev I.E., Mokrushina Y.A., Shamova O.V., Gabibov A.G., Smirnov I.V., Terekhov S.S.Copyright ©; 2023, Пипия С.О., Мирзоева Н.З., Баранова М.Н., Елисеев И.Е., Мокрушина Ю.А., Шамова О.В., Габибов А.Г., Смирнов И.В., Терехов С.С.2023Pipiya S.O., Mirzoeva N.Z., Baranova M.N., Eliseev I.E., Mokrushina Y.A., Shamova O.V., Gabibov A.G., Smirnov I.V., Terekhov S.S.Пипия С.О., Мирзоева Н.З., Баранова М.Н., Елисеев И.Е., Мокрушина Ю.А., Шамова О.В., Габибов А.Г., Смирнов И.В., Терехов С.С.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/11878

Bacterial infections caused by antibiotic-resistant pathogens pose an extremely serious and elusive problem in healthcare. The discovery and targeted creation of new antibiotics are today among the most important public health issues. Antibiotics based on antimicrobial peptides (AMPs) are of particular interest due to their genetically encoded nature. A distinct advantage of most AMPs is their direct mechanism of action that is mediated by their membranolytic properties. The low rate of emergence of antibiotic resistance associated with the killing mechanism of action of AMPs attracts heightened attention to this field. Recombinant technologies enable the creation of genetically programmable AMP producers for large-scale generation of recombinant AMPs (rAMPs) or the creation of rAMP-producing biocontrol agents. The methylotrophic yeast Pichia pastoris was genetically modified for the secreted production of rAMP. Constitutive expression of the sequence encoding the mature AMP protegrin-1 provided the yeast strain that effectively inhibits the growth of target gram-positive and gram-negative bacteria. An antimicrobial effect was also observed in the microculture when a yeast rAMP producer and a reporter bacterium were co-encapsulated in droplets of microfluidic double emulsion. The heterologous production of rAMPs opens up new avenues for creating effective biocontrol agents and screening antimicrobial activity using ultrahigh-throughput technologies.

Бактериальные инфекции, возбудители которых обладают множественной лекарственной устойчивостью, представляют серьезную проблему современной медицины, поэтому поиск и создание новых антибиотиков считаются одной из важнейших задач здравоохранения. Особый интерес вызывают антибиотики на основе антимикробных пептидов (АМП) ввиду своей генетически-кодируемой природы. Отдельным преимуществом большинства АМП является прямой механизм их действия, обусловленный мембранолитическими свойствами. Низкая скорость формирования антибиотикорезистентности, связанная с механизмом действия АМП, делает перспективными разработки в данной области. Рекомбинантные технологии позволяют получать генетически программируемые продуценты АМП для масштабной наработки рекомбинантных АМП (рАМП), а также направленного создания агентов биоконтроля. В данной работе метилотрофные дрожжи Pichia pastoris были генетически модифицированы для секретируемой продукции рАМП. Показано, что конститутивная экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей зрелый АМП протегрин-1, позволяет получить штамм дрожжей, эффективно ингибирующий рост грамположительных и грамотрицательных бактерий-мишеней. Антимикробный эффект наблюдался также на уровне микрокультуры при коинкапсуляции дрожжевого продуцента и репортерной бактерии в каплях микрофлюидной двойной эмульсии. Полученные результаты показывают перспективность использования разработанной системы гетерологической продукции АМП для создания эффективных агентов биоконтроля, а также скрининга антимикробной активности с применением ультравысокопроизводительных технологий.

Antimicrobial peptides (AMPs)yeast Pichia pastorisheterologous expressionprotegrin-1 (PG-1)microfluidic compartmentalizationemulsion microcultivationантимикробные пептиды (АМП)дрожжи Pichia pastorisгетерологическая экспрессияпротегрин-1 (PG-1)микрофлюидная компартментализацияэмульсионное микрокультивированиеРНФRussian Science Foundation21-14-00357Murray C.J.L., Ikuta K.S., Sharara F., Swetschinski L., Robles Aguilar G., Gray A., Han C., Bisignano C., Rao P., Wool E., et al. // Lancet. 2022. V. 399. № 10325. P. 629–655.Chahine E.B., Dougherty J.A., Thornby K.-A., Guirguis E.H. // Ann. Pharmacother. 2022. V. 56. № 4. P. 441–462.Oliveira D.M.P.D., Forde B.M., Kidd T.J., Harris P.N.A., Schembri M.A., Beatson S.A., Paterson D.L., Walker M.J. // Clin. Microbiol. Rev. 2020. V. 33. № 3. Р. e00181–00119.Lin Q., Deslouches B., Montelaro R.C., Di Y.P. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2018. V. 52. № 5. Р. 667–672.Mookherjee N., Anderson M.A., Haagsman H.P., Davidson D.J. // Nat. Rev. Drug Discov. 2020. V. 19. № 5. Р. 311–332.Mahlapuu M., Håkansson J., Ringstad L., Björn C. // Front. Cell. Infect. Microbiol. 2016. V. 6. № 194. Р. 1–20.Spohn R., Daruka L., Lázár V., Martins A., Vidovics F., Grézal G., Méhi O., Kintses B., Számel M., Jangir P.K., et al. // Nat. Commun. 2019. V. 10. № 1. P. 4538.Assoni L., Milani B., Carvalho M.R., Nepomuceno L.N., Waz N.T., Guerra M.E.S., Converso T.R., Darrieux M. // Front. Microbiol. 2020. V. 11. № 593215. Р. 1–20.Zhu Y., Hao W., Wang X., Ouyang J., Deng X., Yu H., Wang Y. // Med. Res. Rev. 2022. V. 42. № 4. P. 1377–1422.Koo H.B., Seo J. // Pept. Sci. 2019. V. 111. № 5. P. e24122.Moretta A., Scieuzo C., Petrone A.M., Salvia R., Manniello M.D., Franco A., Lucchetti D., Vassallo A., Vogel H., Sgambato A., et al. // Front. Cell. Infect. Microbiol. 2021. V. 11. № 668632. P. 1–26.Tucker A.T., Leonard S.P., DuBois C.D., Knauf G.A., Cunningham A.L., Wilke C.O., Trent M.S., Davies B.W. // Cell. 2018. V. 172. № 3. P. 618–628.e613.Popa C., Shi X., Ruiz T., Ferrer P., Coca M. // Front. Microbiol. 2019. V. 10. № 1472. P. 1–13.Chen X., Li J., Sun H., Li S., Chen T., Liu G., Dyson P. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 1. 14543.Chen X., Li J., Sun H., Li S., Chen T., Liu G., Dyson P. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 1. P. 14543.Stenberg J.A., Sundh I., Becher P.G., Björkman C., Dubey M., Egan P.A., Friberg H., Gil J.F., Jensen D.F., Jonsson M., et al. // J. Pest Sci. 2021. V. 94. № 3. P. 665–676.Pipiya S.O., Mokrushina Y.A., Gabibov A.G., Smirnov I.V., Terekhov S.S. // Antibiotics. 2020. V. 9. № 9. P. 527.Huang Y., Gao L., Lin M., Yu T. // Postharvest. Biol. Technol. 2021. V. 171. № 11. Р. 1298.Baranova M.N., Babikova P.A., Kudzhaev A.M., Mokrushina Y.A., Belozerova O.A., Yunin M.A., Kovalchuk S., Gabibov A.G., Smirnov I.V., Terekhov S.S. // Antibiotics. 2021. V. 10. № 10. P. 1161.Wu S., Letchworth G.J. // BioTechniques. 2004. V. 36. № 1. P. 152–154.Terekhov S.S., Smirnov I.V., Stepanova A.V., Bobik T.V., Mokrushina Y.A., Ponomarenko N.A., Belogurov A.A., Rubtsova M.P., Kartseva O.V., Gomzikova M.O., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017. V. 114. № 10. P. 2550–2555.Edwards I.A., Elliott A.G., Kavanagh A.M., Zuegg J., Blaskovich M.A.T., Cooper M.A. // ACS Infect. Dis. 2016. V. 2. № 6. P. 442–450.Orlov D.S., Shamova O.V., Eliseev I.E., Zharkova M.S., Chakchir O.B., Antcheva N., Zachariev S., Panteleev P.V., Kokryakov V.N., Ovchinnikova T.V., et al. // Mar. Drugs..2019. V. 17. № 6. P. 376.Orlov D.S., Shamova O.V., Eliseev I.E., Zharkova M.S., Chakchir O.B., Antcheva N., Zachariev S., Panteleev P.V., Kokryakov V.N., Ovchinnikova T.V., et al. // Mar. Drugs. 2019. V. 17. № 6. P. 376.Park C., Cho J., Lee J., Lee D.G. // Biotechnol. Lett. 2011. V. 33. № 1. P. 185–189.Manzo G., Ferguson P.M., Hind C.K., Clifford M., Gustilo V.B., Ali H., Bansal S.S., Bui T.T., Drake A.F., Atkinson R.A., et al. // Sci. Rep. 2019. V. 9. № 1. P. 10934.Manzo G., Hind C.K., Ferguson P.M., Amison R.T., Hodgson-Casson A.C., Ciazynska K.A., Weller B.J., Clarke M., Lam C., Man R.C.H., et al. // Commun. Biol. 2020. V. 3. № 1. P. 697/Manzo G., Hind C.K., Ferguson P.M., Amison R.T., Hodgson-Casson A.C., Ciazynska K.A., Weller B.J., Clarke M., Lam C., Man R.C.H., et al. // Commun. Biol. 2020. V. 3. № 1. P. 697.Dosler S., Karaaslan E., Alev Gerceker A. // J. Chemother. 2016. V. 28. № 2. P. 95–103.Akbari R., Hakemi-Vala M., Pashaie F., Bevalian P., Hashemi A., Pooshang Bagheri K. // Microb. Drug Resist. 2018. V. 25. № 2. P. 193–202.Jang W.S., Kim C.H., Kim K.N., Park S.Y., Lee J.H., Son S.M., Lee I.H. // Antimicrob. Agents Chemother. 2003. V. 47. № 8. P. 2481–2486.Sung W.S., Park S.H., Lee D.G. // FEBS Lett. 2008. V. 582. № 16. P. 2463–2466.Donaldson G.P., Lee S.M., Mazmanian S.K. // Nat. Rev. Microbiol. 2016. V. 14. № 1. 20–32.Donaldson G.P., Lee S.M., Mazmanian S.K. // Nat. Rev. Microbiol. 2016. V. 14. № 1. P. 20–32.Park S.C., Park Y., Hahm K.S. // Int. J. Mol. Sci. 2011. V. 12. № 9. P. 5971–5992.Huan Y., Kong Q., Mou H., Yi H. // Front. Microbiol. 2020. V. 11. № 582779. P. 1–21.Elliott A.G., Huang J.X., Neve S., Zuegg J., Edwards I.A., Cain A.K., Boinett C.J., Barquist L., Lundberg C.V., Steen J., et al. // Nat. Commun. 2020. V. 11. № 1. P. 3184.Bolintineanu D., Hazrati E., Davis H.T., Lehrer R.I., Kaznessis Y.N. // Peptides. 2010. V. 31. № 1. Р. 1–8.Fahrner R.L., Dieckmann T., Harwig S.S., Lehrer R.I., Eisenberg D., Feigon J. // Chem. Biol. 1996. V. 3. № 7. P. 543–550.Karbalaei M., Rezaee S.A., Farsiani H. // J. Cell. Physiol. 2020. V. 235. № 9. P. 5867–5881.Terekhov S.S., Smirnov I.V., Malakhova M.V., Samoilov A.E., Manolov A.I., Nazarov A.S., Danilov D.V., Dubiley S.A., Osterman I.A., Rubtsova M.P., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018. V. 115. № 38. P. 9551–9556.