Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1171310.32607/actanaturae.11713Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleIsolation and Biochemical Characterization of Recombinant Transketolase from Mycobacterium tuberculosisВыделение и биохимическая характеристика рекомбинантной транскетолазы Mycobacterium tuberculosisShcherbakovaTatiana A.ЩербаковаТатьяна Анатольевна
Russian Federation
vytas@belozersky.msu.ruBaldinSemen M.БалдинСемен Михайлович
Russian Federation
vytas@belozersky.msu.ruShumkovMikhail S.ШумковМихаил Сергеевич
Russian Federation
vytas@belozersky.msu.ruGushchinaIrina V.ГущинаИрина Владимировна
Russian Federation
vytas@belozersky.msu.ruNilovDmitry K.НиловДмитрий Константинович
Russian Federation
vytas@belozersky.msu.ruŠvedasVytas K.ШвядасВитаутас Каятоно
Russian Federation
vytas@belozersky.msu.ruLomonosov Moscow State University, Belozersky Institute of Physicochemical BiologyМосковский государственный университет имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. БелозерскогоFederal Research Centre «Fundamentals of Biotechnology», Russian Academy of SciencesФедеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наукLomonosov Moscow State UniversityМосковский государственный университет имени М.В. Ломоносова2107202214293973003202224052022Copyright ©; 2022, Shcherbakova T.A., Baldin S.M., Shumkov M.S., Gushchina I.V., Nilov D.K., Švedas V.K.Copyright ©; 2022, Щербакова Т.А., Балдин С.М., Шумков М.С., Гущина И.В., Нилов Д.К., Швядас В.К.2022Shcherbakova T.A., Baldin S.M., Shumkov M.S., Gushchina I.V., Nilov D.K., Švedas V.K.Щербакова Т.А., Балдин С.М., Шумков М.С., Гущина И.В., Нилов Д.К., Швядас В.К.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/11713

Transketolase, an enzyme of the pentose phosphate pathway, plays an important role in the functioning of mycobacteria. Using plasmid pET-19b carrying the Rv1449c gene of transketolase from Mycobacterium tuberculosis and an additional histidine tag, we isolated and purified recombinant transketolase and determined the conditions for obtaining the apoform of the protein. The Michaelis constants were evaluated for the thiamine diphosphate cofactor in the presence of magnesium and calcium ions. We found that the affinity of mycobacterial transketolase for thiamine diphosphate is by three orders of magnitude lower than that of the human enzyme. Analysis of the structural organization of the active centers of homologous enzymes showed that this difference is due to a replacement of lysine residues by less polar amino acid residues.

Фермент пентозофосфатного пути транскетолаза играет важную роль в жизнедеятельности микобактерий. С использованием плазмиды, несущей ген транскетолазы Mycobacterium tuberculosis с дополнительным гистидиновым тагом, проведены выделение и очистка препарата рекомбинантной бактериальной транскетолазы, определены условия получения апоформы белка. Определены значения константы Михаэлиса для кофактора тиаминдифосфата в присутствии ионов магния и кальция. Обнаружено, что сродство транскетолазы микобактерий к тиаминдифосфату на три порядка ниже, чем у фермента человека. Анализ структурной организации активных центров гомологичных ферментов показал, что данное отличие обусловлено заменой остатков лизина на менее полярные аминокислотные остатки.

transketolasethiamine diphosphatexylulose 5-phosphateribose 5-phosphatemycobacteriaтранскетолазатиаминдифосфатксилулозо-5-фосфатрибозо-5-фосфатмикобактерииРоссийский научный фондRussian Science Foundation15-14-00069-ПCole S.T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S.V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C.E. 3rd, et al. // Nature. 1998. V. 393. P. 537–544.Schenk G., Duggleby R.G., Nixon P.F. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1998. V. 30. P. 1297–1318.Sevostyanova I.A., Selivanov V.A., Yurshev V.A., Solovjeva O.N., Zabrodskaya S.V., Kochetov G.A. // Biochemistry (Mosc.). 2009. V. 74. P. 789–792.Севостьянова И.А., Селиванов В.А., Юршев В.А., Соловьева О.Н., Забродская С.В., Кочетов Г.А. // Биохимия. 2009. Т. 74. С. 972–976.Kochetov G.A., Solovjeva O.N. // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1844. P. 1608–1618.Wolucka B.A. // FEBS J. 2008. V. 275. P. 2691–2711.Fullam E., Pojer F., Bergfors T., Jones T.A., Cole S.T. // Open Biol. 2012. V. 2. P. 110026.Laemmly U.K., Favre M. // J. Mol. Biol. 1973. V. 80. P. 575–599.Kochetov G.A. // Methods Enzymol. 1982. V. 90. P. 209–223.Meshalkina L.E., Solovjeva O.N., Khodak Y.A., Drutsa V.L., Kochetov G.A. // Biochemistry (Mosc.). 2010. V. 75. P. 873–880.Мешалкина Л.Е., Соловьева О.Н., Ходак Ю.А., Друца В.Л., Кочетов Г.А. // Биохимия. 2010. Т. 75. С. 992–1000.Nilsson U., Meshalkina L., Lindqvist Y., Schneider G. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 1864–1869.Mitschke L., Parthier C., Schröder-Tittmann K., Coy J., Lüdtke S., Tittmann K. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. P. 31559–31570.Menke M., Berger B., Cowen L. // PLoS Comput. Biol. 2008. V. 4. P. e10.Humphrey W., Dalke A., Schulten K. // J. Mol. Graph. 1996. V. 14. P. 33–38.Kochetov G.A., Philippov P.P. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1970. V. 38. P. 930–933.Datta A.G., Racker E. // J. Biol. Chem. 1961. V. 236. P. 617–623.Kochetov G.A. // Biochemistry (Mosc.). 1986. V. 51. P. 2010–2029.Кочетов Г.А. // Биохимия. 1986. Т. 51. С. 2010–2029.Sprenger G.A., Schörken U., Sprenger G., Sahm H. // Eur. J. Biochem. 1995. V. 230. P. 525–532.Sprenger G.A., Schörken U., Sprenger G., Sahm H. // Eur. J. Biochem. 1995. V. 230. Р. 525–532.Esakova O.A., Meshalkina L.E., Golbik R., Hübner G., Kochetov G.A. // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 4189–4194.Solov’eva O.N., Meshalkina L.E., Kovina M.V., Selivanov V.A., Bykova I.A., Kochetov G.A. // Biochemistry (Mosc.). 2000. V. 65. P. 1202–1205.Соловьева О.Н., Мешалкина Л.Е., Ковина М.В., Селиванов В.А., Быкова И.А., Кочетов Г.А. // Биохимия. 2000. Т. 65. С. 1421–1424.Kochetov G.A., Sevostyanova I.A. // IUBMB Life. 2010. V. 62. P. 797–802.