Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1166510.32607/actanaturae.11665Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleEffect of Additional Amino Acid Replacements on the Properties of Multi-point Mutant Bacterial Formate Dehyderogenase PseFDH SM4SВлияние дополнительных аминокислотных замен на свойства многоточечной мутантной бактериальной формиатдегидрогеназы PseFDH SM4SPometunAnastasiya A.ПометунАнастасия Александровна
Russian Federation
vitishkov@gmail.comParshinPavel D.ПаршинПавел Дмитриевич
Russian Federation
vitishkov@gmail.comGalanichevaNatalia P.ГаланичеваНаталья Павловна
Russian Federation
vitishkov@gmail.comShaposhnikovLeonid A.ШапошниковЛеонид Александрович
Russian Federation
vitishkov@gmail.comAtroshenkoDenis L.АтрошенкоДенис Леонидович
Russian Federation
vitishkov@gmail.comPometunEugeniy V.ПометунЕвгений Владимирович
Russian Federation
vitishkov@gmail.comBurmakinVladislav V.БурмакинВладислав Васильевич
Russian Federation
vitishkov@gmail.comKleymenovSergey Yu.КлейменовСергей Юрьевич
Russian Federation
vitishkov@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-0788-2507SavinSvyztoslav S.СавинСвятослав Сергеевич
Russian Federation
vitishkov@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-6997-7229TishkovVladimir I.ТишковВладимир Иванович
Russian Federation
vitishkov@gmail.comBach Institute of Biochemistry, Federal Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of SciencesИнститут биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАНLomonosov Moscow State University, Department of ChemistryМосковский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультетInnovations and High Technologies MSU Ltd.ООО «Инновации и высокие технологии МГУ»Sechenov First Moscow State Medical UniversityПервый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)Koltzov Institute of Developmental Biology of the Russian Academy of SciencesИнститут биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН1005202214182911712202111022022Copyright ©; 2022, Pometun A.A., Parshin P.D., Galanicheva N.P., Shaposhnikov L.A., Atroshenko D.L., Pometun E.V., Burmakin V.V., Kleymenov S.Y., Savin S.S., Tishkov V.I.Copyright ©; 2022, Пометун А.А., Паршин П.Д., Галаничева Н.П., Шапошников Л.А., Атрошенко Д.Л., Пометун Е.В., Бурмакин В.В., Клейменов С.Ю., Савин С.С., Тишков В.И.2022Pometun A.A., Parshin P.D., Galanicheva N.P., Shaposhnikov L.A., Atroshenko D.L., Pometun E.V., Burmakin V.V., Kleymenov S.Y., Savin S.S., Tishkov V.I.Пометун А.А., Паршин П.Д., Галаничева Н.П., Шапошников Л.А., Атрошенко Д.Л., Пометун Е.В., Бурмакин В.В., Клейменов С.Ю., Савин С.С., Тишков В.И.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/11665

Formate dehydrogenase from Pseudomonas sp. 101 bacterium (PseFDH, EC 1.2.1.2) is a research model for the elucidation of the catalytic mechanism of 2-oxyacid D-specific dehydrogenases enzyme superfamily. The enzyme is actively used for regeneration of the reduced form of NAD(P)H in chiral synthesis with oxidoreductases. A multi-point mutant PseFDH SM4S with an improved thermal and chemical stability has been prepared earlier in this laboratory. To further improve the properties of the mutant, additional single-point replacements have been introduced to generate five new PseFDH mutants. All new enzymes have been highly purified, and their kinetic properties and thermal stability studied using analysis of thermal inactivation kinetics and differential scanning calorimetry. The E170D amino acid change in PseFDH SM4S shows an increase in thermal stability 1.76- and 10-fold compared to the starting mutant and the wild-type enzyme, respectively.

Формиатдегидрогеназа из бактерий Pseudomonas sp. 101 (PseFDH, КФ 1.2.1.2) является модельным объектом для изучения закономерностей механизма действия ферментов суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-оксикислот. Этот фермент активно используется для регенерации восстановленной формы NAD(P)H в процессах хирального синтеза с помощью оксидоредуктаз. Ранее в нашей лаборатории был получен многоточечный мутант PseFDH SM4S, обладающий повышенной температурной и химической стабильностью. C целью улучшения свойств этого мутанта в его последовательность были введены дополнительные точечные замены, что позволило получить пять новых мутантных PseFDH. Все эти ферменты выделены в высокоочищенном виде, изучены их кинетические свойства и температурная стабильность, охарактеризованная по кинетике термоинактивации и с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Показано, что введение в PseFDH SM4S замены E170D приводит (при сохранении кинетических свойств) к увеличению температурной стабильности в 1.76 и 10 раз по сравнению с исходным мутантом и ферментом дикого типа соответственно.

formate dehydrogenasePseudomonas sp. 101catalytic propertiesthermal stabilitysite-directed mutagenesisформиатдегидрогеназаPseudomonas sp. 101каталитические свойстватемпературная стабильностьсайт-направленный мутагенезГрант Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - докторов наук (Конкурс - МД-2021)Grant of the President of the Russian FederationМД-349.2021.1.4Egorov A.M., Avilova T.V., Dikov M.M., Popov V.O., Rodionov Y.V., Berezin I.V. // Eur. J. Biochem. 1979. V. 99(3), P. 569–576. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1979.tb13289.xEgorov A.M., Avilova T.V., Dikov M.M., Popov V.O., Rodionov Y.V., Berezin I.V. // Eur. J. Biochem. 1979. V. 99. № 3. P. 569–576. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1979.tb13289.x.Tishkov V.I., Galkin A.G., Egorov A.M. // Dokl. USSR Acad. Sci. 1991. V. 317. № 3. P. 745–748.Tishkov V.I., Galkin A.G., Marchenko G.N., Tsygankov Y.D., Egorov A.M. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1993. V. 18. P. 201–207. DOI: 10.1111/j.1470-8744.1993.tb00266.xPometun A.A., Kleymenov S.Yu., Zarubina S.A., Kargov I.S., Parshin P.D., Sadykhov E.G., Savin S.S., Tishkov V.I. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2018. V. 73. № 2. P. 80–84. DOI: 10.3103/S002713141802013XTishkov V.I., Popov V.O. // Biomol. Eng. 2006. V. 23. № 2–3. P. 89–110. DOI: 10.1016/j.bioeng.2006.02.003Tishkov V.I., Pometun A.A., Stepashkina A.V., Fedorchuk V.V., Zarubina S.A., Kargov I.S., Atroshenko D.L., Parshin P.D., Kovalevski R.P., Boiko K.M., et al. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2018. V. 73. № 2. P. 1–6. DOI: 10.3103/S0027131418020153Pometun A.A., Boyko K.M., Yurchenko T.S., Nikolaeva A.Yu., Atroshenko D.L., Savin S.S., Popov V.O., Tishkov V.I. // Biochemistry (Moscow). 2020. V. 85. № 6. P. 689–696. DOI: 10.1134/S0006297920060061Tishkov V.I., Matorin A.D., Rojkova A.M., Fedorchuk V.V., Savitsky A.P., Dementieva L.A., Lamzin V.S., Mezentzev A.V., Popov V.O. // FEBS Lett. 1996. V. 390. № 1. P. 104–108. DOI: 10.1016/0014-5793(96)00641-2Galkin A.G., Kutsenko A.S., Bajulina N.P., Esipova N.G., Lamzin V.S., Mezentzev A.V., Shelukho D.V., Tikhonova T.V., Tishkov V.I., Ustinnikova T.B., et al. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1594. № 1. P. 136–149. DOI: 10.1016/s0167-4838(01)00297-7Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., Tishkov V.I. // FEBS Lett. 1999. V. 445. № 1. P. 183–188. DOI: 10.1016/S0014-5793(99)00127-1Alekseeva A.A., Fedorchuk V.V., Zarubina S.A., Sadykhov E.G., Matorin A.D., Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae 2015. V. 7. № 1(24). P. 60–69. DOI: 10.32607/20758251-2015-7-3-55-64Alekseeva A.A., Fedorchuk V.V., Zarubina S.A., Sadykhov E.G., Matorin A.D., Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae. 2015. V. 7. № 1(24). P. 60–69. DOI: https://doi.org/10.32607/20758251-2015-7-3-55-64Alekseeva A.A., Petrov A.S., Fedorchuk V.V., Fedorchuk E.A., Osipova T.A., Tishkov V.I. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2014. V. 69. № 2. P. 73–79. DOI: 10.3103/S0027131414020023Pometun A.A., Parshin P.D., Galanicheva N.P., Uporov I.V., Atroshenko D.L., Savin S.S., Tishkov V.I. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2020. V. 75. № 4. P. 250–257. DOI: 10.3103/S0027131420040057Odintseva E.R., Popova A.S., Rozhkova A.M., Tishkov V.I. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2002. V. 43. № 6. P. 356–359 (rus).Одинцева Е.Р., Попова А.С., Рожкова А.М., Тишков В.И. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2002. Т. 43. № 6. С. 356–359.Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae 2010. V. 2. № 1(4). P. 97–101. DOI: 10.32607/20758251-2010-2-1-97-101Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae. 2010. V. 2. № 1(4). P. 97–101. DOI: 10.32607/20758251-2010-2-1-97-101Alekseeva A.A., Kargov I.S., Kleimenov S.Yu., Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae 2015. V. 7. № 3(26). P. 55–64. DOI: 10.32607/20758251-2015-7-3-55-64Alekseeva A.A., Kargov I.S., Kleimenov S.Yu., Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae. 2015. V. 7. № 3(26). P. 55–64. DOI: 10.32607/20758251-2015-7-3-55-64Tishkov V.I., Goncharenko K.V., Alekseeva A.A., Kleymenov S.Yu., Savin S.S. // Biochemistry (Moscow). 2015. V. 80. № 13. P. 1690–1700. DOI: 10.1134/S000629791513005Voinova N.S., Savin S.S., Alekseeva A.A., Skirgello O.E., Tishkov V.I. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2008. V. 63. № 2. P. 60–62. DOI: 10.3103/S0027131408020028Fedorchuk V.V., Galkin A.G., Yasny I.E., Kulakova L.B., Rojkova A.M., Filippova A.A., Tishkov V.I. // Biochemistry (Moscow) 2002. V. 67. № 10. P. 1145–1151. DOI: 10.1023/A:1020915324159Fedorchuk V.V., Galkin A.G., Yasny I.E., Kulakova L.B., Rojkova A.M., Filippova A.A., Tishkov V.I. // Biochemistry (Moscow). 2002. V. 67. № 10. P. 1145–1151. DOI: 10.1023/A:1020915324159Munoz V., Serrano L. // J. Mol. Biol. 1995. V. 245. № 3. P. 275–296. DOI: 10.1006/jmbi.1994.0023Golubev I.V., Komarova N.V., Ryzhenkova K.V., Chubar T.A., Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae. 2014. V. 6. № 3(22). P. 76–88. DOI: 10.32607/20758251-2014-6-3-76-88Fedorchuk V.V. Increasing the thermal stability of bacterial formate dehydrogenase by site-directed mutagenesis: PhD thesis. M.: M.V. Lomonosov Moscow State University, 2000.Федорчук В.В. Повышение термостабильности бактериальной формиатдегидрогеназы методом направленного мутагенеза: Дис. … канд. хим. наук. М.: МГУ им М.В. Ломоносова, 2000.Shabalin I.G., Filippova E.V., Polyakov K.M., Sadykhov E.G., Safonova T.N., Tikhonova T.V., Tishkov V.I., Popov V.O. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2009. V. 65. № 12. P. 1315–1325. DOI: 10.1107/S0907444909040773Shabalin I.G., Polyakov K.M., Tishkov V.I., Popov V.O. // Acta Naturae. 2009. V. 1. № 3. P. 89–93. DOI: 10.32607/20758251-2009-1-3-89-93