Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1160310.32607/actanaturae.11603Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch Article3D Models of Cellular Spheroids As a Universal Tool for Studying the Cytotoxic Properties of Anticancer Compounds In VitroМетод получения трехмерных клеточных сфероидов: универсальный инструмент для изучения цитотоксических свойств противоопухолевых соединений in vitroSogomonyanAnna S.СогомонянАнна Самвеловна
Russian Federation
viktoriya.shipunova@phystech.eduShipunovaVictoria O.ШипуноваВиктория Олеговна
Russian Federation
viktoriya.shipunova@phystech.eduSolovievVladislav D.СоловьевВладислав Денисович
Russian Federation
viktoriya.shipunova@phystech.eduLarionovVladislav I.ЛарионовВладислав Игоревич
Russian Federation
viktoriya.shipunova@phystech.eduKotelnikovaPolina A.КотельниковаПолина Александровна
Russian Federation
viktoriya.shipunova@phystech.eduDeyevSergey M.ДеевСергей Михайлович
Russian Federation
viktoriya.shipunova@phystech.eduShemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of SciencesИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАНMEPhI (Moscow Engineering Physics Institute), Institute of Engineering Physics for Biomedicine, (PhysBio)Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ»Sirius University of Science and TechnologyНаучно-технологический университет «Сириус»Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University)Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University)Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ»10052022141921002309202111022022Copyright ©; 2022, Sogomonyan A.S., Shipunova V.O., Soloviev V.D., Larionov V.I., Kotelnikova P.A., Deyev S.M.Copyright ©; 2022, Согомонян А.С., Шипунова В.О., Соловьев В.Д., Ларионов В.И., Котельникова П.А., Деев С.М.2022Sogomonyan A.S., Shipunova V.O., Soloviev V.D., Larionov V.I., Kotelnikova P.A., Deyev S.M.Согомонян А.С., Шипунова В.О., Соловьев В.Д., Ларионов В.И., Котельникова П.А., Деев С.М.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/11603

The aim of this work is to develop a 3D cell culture model based on cell spheroids for predicting the functional activity of various compounds in vivo. Agarose gel molds were made using 3D printing. The solidified agarose gel is a matrix consisting of nine low-adhesive U-shaped microwells of 2.3 × 3.3 mm for 3D cell spheroid formation and growth. This matrix is placed into a single well of a 12-well plate. The effectiveness of the cell culture method was demonstrated using human ovarian carcinoma SKOVip-kat cells stably expressing the red fluorescent protein Katushka in the cytoplasm and overexpressing the membrane-associated tumor marker HER2. The SKOVip-kat cell spheroids were visualized by fluorescence microscopy. The cell concentration required for the formation of same-shape and same-size spheroids with tight intercellular contacts was optimized. To verify the developed model, the cytotoxicity of the targeted immunotoxin anti-HER2 consisting of the anti-HER2 scaffold DARP 9_29 and a fragment of the Pseudomonas aeroginosa exotoxin, DARP-LoPE, was studied in 2D and 3D SKOVip-kat cell cultures. The existence of a difference in the cytotoxic properties of DARP-LoPE between the 2D and 3D cultures has been demonstrated: the IC50 value in the 3D culture is an order of magnitude higher than that in the monolayer culture. The present work describes a universal tool for 3D cultivation of mammalian cells based on reusable agarose gel molds that allows for reproducible formation of multicellular spheroids with tight contacts for molecular and cell biology studies.

Разработан метод 3D-культивирования клеток с образованием сфероидов для прогнозирования функциональной активности различных соединений in vivo. Для формирования и роста объемных клеточных сфероидов использовали агарозный гель, представляющий собой матрицу, состоящую из 9 низкоадгезивных U-образных микроячеек размером 2.3 × 3.3 мм, помещаемую в лунку 12-луночного планшета. Формы для заливки агарозного геля созданы методом 3D-печати. Эффективность метода показана на примере клеточной линии карциномы яичников человека SKOVip-kat со стабильной цитоплазматической экспрессией красного флуоресцентного белка Katushka и сверхэкспрессией мембраноассоциированного онкомаркера HER2. Сфероиды линии SKOVip-kat визуализированы методом флуоресцентной микроскопии. Концентрации клеток оптимизированы для формирования сфероидов с одинаковой формой, размером и плотными межклеточными контактами. Для валидации разработанной модели оценена цитотоксичность адресного анти-HER2 иммунотоксина на основе анти-HER2 каркасного белка DARP 9_29 и фрагмента экзотоксина Pseudomonas aerиginosa – DARP-LoPE – на 2D- и 3D-культурах клеток SKOVip-kat. Выявлено различие цитотоксических свойств DARP-LoPE в 2D- и 3D-культуре: значение IC50 в 3D-культуре на порядок выше, чем в монослойной культуре. Описан универсальный метод 3D-культивирования клеток млекопитающих на основе многоразовых форм для заливки агарозного геля, позволяющий воспроизводимо получать мультиклеточные сфероиды с плотными контактами для задач молекулярной и клеточной биологии.

3D printing3D cell culture modelsDARPinTurboFP6353D-печать3D-клеточные моделиDARPinTurboFP635РФФИRFBR19-29-04012 мкРНФRussian Science Foundation17-74-20146The study was supported by the RFBR grant No. 19-29-04012 MK (the development of a 3D model of ErbB2-positive tumors) and the Russian Science Foundation grant No. 17-74-20146 (isolation and purification of targeted immunotoxin, determination of cytotoxicity).Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РФФИ № 19-29-04012 мк (разработка 3D модели ErbB2-положительных опухолей) и РНФ № 17-74-20146 (выделение и очистка адресного иммунотоксина, определение цитотоксичности).1.Harrison R.G. // Exp. Biol. Med. 1906. V. 4. № 1. P. 140–143.Harrison R.G. // Exp. Biol. Med. 1906. V. 4. № 1. P. 140–143.2.Yao T., Asayama Y. // Reprod. Med. Biol. 2017. V. 16. № 2. P. 99–117.Yao T., Asayama Y. // Reprod. Med. Biol. 2017. V. 16. № 2. P. 99–117.3.Grebenik E.A., Kostyuk A.B., Deyev S.M. // Russ. Chem. Rev. 2016. V. 85. № 12. P. 1277–1296.Grebenik E.A., Kostyuk A.B., Deyev S.M. // Russ. Chem. Rev. 2016. V. 85. № 12. P. 1277–1296.4.Shipunova V.O., Sogomonyan A.S., Zelepukin I.V., Nikitin M.P., Deyev S.M. // Molecules. 2021. V. 26. № 13. P. 3955. doi: 10.3390/molecules26133955.Shipunova V.O., Sogomonyan A.S., Zelepukin I.V., Nikitin M.P., Deyev S.M. // Molecules. 2021. V. 26. № 13. Р. 3955. doi: 10.3390/molecules26133955.5.Shramova E., Proshkina G., Shipunova V., Ryabova A., Kamyshinsky R., Konevega A., Schulga A., Konovalova E., Telegin G., Deyev S. // Cancers (Basel). 2020. V. 12. № 10. P. 3014. doi: 10.3390/cancers12103014.Shramova E., Proshkina G., Shipunova V., Ryabova A., Kamyshinsky R., Konevega A., Schulga A., Konovalova E., Telegin G., Deyev S. // Cancers (Basel). 2020. V. 12. № 10. Р. 3014. doi: 10.3390/cancers12103014.6.Shipunova V.O., Komedchikova E.N., Kotelnikova P.A., Zelepukin I.V., Schulga A.A., Proshkina G.M., Shramova E.I., Kutscher H.L., Telegin G.B., Kabashin A.V., et al. // ACS Nano. 2020. V. 14. № 10. P. 12781–12795.Shipunova V.O., Komedchikova E.N., Kotelnikova P.A., Zelepukin I.V., Schulga A.A., Proshkina G.M., Shramova E.I., Kutscher H.L., Telegin G.B., Kabashin A.V., et al. // ACS Nano. 2020. V. 14. № 10. P. 12781–12795.7.Shipunova V.O., Kolesnikova O.A., Kotelnikova P.A., Soloviev V.D., Popov A.A., Proshkina G.M., Nikitin M.P., Deyev S.M. // ACS Omega. 2021. V. 6. № 24. P. 16000–16008.Shipunova V.O., Kolesnikova O.A., Kotelnikova P.A., Soloviev V.D., Popov A.A., Proshkina G.M., Nikitin M.P., Deyev S.M. // ACS Omega. 2021. V. 6. № 24. P. 16000–16008.8.Zelepukin I.V., Popov A.A., Shipunova V.O., Tikhonowski G.V., Mirkasymov A.B., Popova-Kuznetsova E.A., Klimentov S.M., Kabashin A.V., Deyev S.M. // Mater. Sci. Eng. C. 2021. V. 120. P. 111717.Zelepukin I.V., Popov A.A., Shipunova V.O., Tikhonowski G.V., Mirkasymov A.B., Popova-Kuznetsova E.A., Klimentov S.M., Kabashin A.V., Deyev S.M. // Mater. Sci. Eng. C. 2021. V. 120. P. 111717.9.Kabashin A.V., Kravets V.G., Wu F., Imaizumi S., Shipunova V.O., Deyev S.M., Grigorenko A.N. // Adv. Funct. Mater. 2019. V. 29. № 26. P. 1902692.Kabashin A.V., Kravets V.G., Wu F., Imaizumi S., Shipunova V.O., Deyev S.M., Grigorenko A.N. // Adv. Funct. Mater. 2019. V. 29. № 26. P. 1902692.Kapałczyńska M., Kolenda T., Przybyła W., Zajączkowska M., Teresiak A., Filas V., Ibbs M., Bliźniak R., Łuczewski Ł., Lamperska K. // Arch. Med. Sci. 2016. V. 14. № 4. P. 910–919.Zanoni M., Piccinini F., Arienti C., Zamagni A., Santi S., Polico R., Bevilacqua A., Tesei A. // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 19103.12.Liao W., Wang J., Xu J., You F., Pan M., Xu X., Weng J., Han X., Li S., Li Y., et al. // J. Tissue Eng. 2019. V. 10. P. 2041731419889184. doi: 10.1177/2041731419889184.Liao W., Wang J., Xu J., You F., Pan M., Xu X., Weng J., Han X., Li S., Li Y., et al. // J. Tissue Eng. 2019. V. 10. Р. 2041731419889184. doi: 10.1177/2041731419889184.13.Białkowska K., Komorowski P., Bryszewska M., Miłowska K. // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 17. P. 6225. doi: 10.3390/ijms21176225.Białkowska K., Komorowski P., Bryszewska M., Miłowska K. // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 17. Р. 6225. doi: 10.3390/ijms21176225.Andersen T., Auk-Emblem P., Dornish M. // Microarrays. 2015. V. 4. № 2. P. 133–161.Zhang C., Yang Z., Dong D.-L., Jang T.-S., Knowles J.C., Kim H.-W., Jin G.-Z., Xuan Y. // J. Tissue Eng. 2020. V. 11. P. 1–17.Balalaeva I.V., Sokolova E.A., Puzhikhina A.D., Brilkina A.A., Deyev S.M. // Acta Naturae. 2017. V. 9. № 1. P. 38–44.Zanoni M., Cortesi M., Zamagni A., Arienti C., Pignatta S., Tesei A. // J. Hematol. Oncol. 2020. V. 13. № 1. P. 97.Sant S., Johnston P.A. // Drug Discov. Today Technol. 2017. V. 23. P. 27–36.Godugu C., Patel A.R., Desai U., Andey T., Sams A., Singh M. // PLoS One. 2013. V. 8. № 1. P. e53708.20.Sokolova E.A., Shilova O.N., Kiseleva D.V., Schulga A.A., Balalaeva I.V., Deyev S.M. // Int. J. Mol. Sci. 2019. V. 20. № 10. P. 2399. doi: 10.3390/ijms20102399.Sokolova E.A., Shilova O.N., Kiseleva D.V., Schulga A.A., Balalaeva I.V., Deyev S.M. // Int. J. Mol. Sci. 2019. V. 20. № 10. Р. 2399. doi: 10.3390/ijms20102399.Proshkina G.M., Kiseleva D.V., Shilova O.N., Ryabova A.V., Shramova E.I., Stremovskiy O.A., Deyev S.M. // Mol. Biol. 2017. V. 51. № 6. P. 865–873.Mosmann T. // J. Immunol. Methods. 1983. V. 65. № 1–2. P. 55–63.Zdobnova T., Sokolova E., Stremovskiy O., Karpenko D., Telford W., Turchin I., Balalaeva I., Deyev S. // Oncotarget. 2015. V. 6. № 31. P. 30919–30928.Shcherbo D., Merzlyak E.M., Chepurnykh T.V., Fradkov A.F., Ermakova G.V., Solovieva E.A., Lukyanov K.A., Bogdanova E.A., Zaraisky A.G., Lukyanov S., et al. // Nat. Methods. 2007. V. 4. № 9. P. 741–746.Shin S., Ikram M., Subhan F., Kang H.Y., Lim Y., Lee R., Jin S., Jeong Y.H., Kwak J.-Y., Na Y.-J., et al. // RSC Adv. 2016. V. 6. № 52. P. 46952–46965.Tang Y., Liu J., Chen Y. // Microelectron. Eng. 2016. V. 158. P. 41–45.Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci M.C., Grignani F., Riccardi C. // J. Immunol. Methods. 1991. V. 139. № 2. P. 271–279.Arndt-Jovin D.J., Jovin T.M. // J. Histochem. Cytochem. 1977. V. 25. № 7. P. 585–589.Purschke M., Rubio N., Held K.D., Redmond R.W. // Photochem. Photobiol. Sci. 2010. V. 9. № 12. P. 1634–1639.Krishnamurti U., Silverman J.F. // Adv. Anat. Pathol. 2014. V. 21. № 2. P. 100–107.31.Carlsson J., Nordgren H., Sjöström J., Wester K., Villman K., Bengtsson N.O., Ostenstad B., Lundqvist H., Blomqvist C. // Br. J. Cancer. 2004. V. 90. № 12. P. 2344–2348.Carlsson J., Nordgren H., Sjöström J., Wester K., Villman K., Bengtsson N.O., Ostenstad B., Lundqvist H., Blomqvist C. // Br. J. Cancer. 2004. V. 90. № 12. P. 2344–2348.32.Murphy C.G., Modi S. // Biologics. 2009. V. 3. P. 289–301.Murphy C.G., Modi S. // Biologics. 2009. V. 3. P. 289–301.Iqbal N., Iqbal N. // Mol. Biol. Int. 2014. V. 2014. P. 852748.Mitri Z., Constantine T., O’Regan R. // Chemother. Res. Pract. 2012. V. 2012. P. 743193.Stepanov A.V., Belogurov A.A., Ponomarenko N.A., Stremovskiy O.A., Kozlov L.V., Bichucher A.M., Dmitriev S.E., Smirnov I.V., Shamborant O.G., Balabashin D.S., et al. // PLoS One. 2011. V. 6. № 6. P. e20991.Pastan I., Hassan R., FitzGerald D.J., Kreitman R.J. // Annu. Rev. Med. 2007. V. 58. P. 221–237.Boersma Y.L., Plückthun A. // Curr. Opin. Biotechnol. 2011. V. 22. № 6. P. 849–857.Dreier B., Honegger A., Hess C., Nagy-Davidescu G., Mittl P.R.E., Grütter M.G., Belousova N., Mikheeva G., Krasnykh V., Plückthun A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. № 10. P. E869–877.Plückthun A. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2015. V. 55. P. 489–511.40.de Dios-Figueroa G.T., Aguilera-Marquez J.D.R., Camacho-Villegas T.A., Lugo-Fabres P.H. // Biomedicines. 2021. V. 9. № 6. P. 602. doi: 10.3390/biomedicines9060602.de Dios-Figueroa G.T., Aguilera-Marquez J.D.R., Camacho-Villegas T.A., Lugo-Fabres P.H. // Biomedicines. 2021. V. 9. № 6. Р. 602. doi: 10.3390/biomedicines9060602.41.Jensen C., Teng Y. // Front. Mol. Biosci. 2020. V. 7. P. 33.Jensen C., Teng Y. // Front. Mol. Biosci. 2020. V. 7. P. 33.42.Nakayama Y., Takewa Y., Sumikura H., Yamanami M., Matsui Y., Oie T., Kishimoto Y., Arakawa M., Ohmuma K., Tajikawa T., et al. // J. Biomed. Mater. Res. B. 2015. V. 103. № 1. P. 1–11.Nakayama Y., Takewa Y., Sumikura H., Yamanami M., Matsui Y., Oie T., Kishimoto Y., Arakawa M., Ohmuma K., Tajikawa T., et al. // J. Biomed. Mater. Res. B. 2015. V. 103. № 1. P. 1–11.43.Kun K. // Procedia Eng. 2016. V. 149. № 2. P. 203–211.Kun K. // Procedia Eng. 2016. V. 149. № 2. P. 203–211.44.Nicholas P., Rossi G., Williams E., Bennett M., Schork T. // Int. J. Archit. Comput. 2020. V. 18. № 4. P. 371–384.Nicholas P., Rossi G., Williams E., Bennett M., Schork T. // Int. J. Archit. Comput. 2020. V. 18. № 4. P. 371–384.Murphy S.V., Atala A. // Nat. Biotechnol. 2014. V. 32. № 8. P. 773–785.46.Wang L., Pumera M. // Trends Analyt. Chem. 2021. V. 135. P. 116151.Wang L., Pumera M. // Trends Analyt. Chem. 2021. V. 135. P. 116151.Tolmachev V.M., Chernov V.I., Deyev S.M. // Russ. Chem. Rev. 2022. V. 91. RCR5034. https://doi.org/10.1070/RCR5034Shipunova V.O., Deyev S.M. // Acta Naturae. 2022. V. 14. № 1(52). P. 54–72.