Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1124210.32607/actanaturae.11242Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleCitrobacter freundii Methionine γ-Lyase: The Role of Serine 339 in the Catalysis of γ- and β-Elimination ReactionsCitrobacter freundii метионин–γ-лиаза: роль серина 339 в катализе реакций γ- и β-элиминированияAnufrievaNatalya V.АнуфриеваНаталья Валерьевна
Russian Federation

tvdemidkina@yandex.ruMorozovaElena A.МорозоваЕлена Андреевна
Russian Federation

elmorozova@yahoo.comRevtovichSvetlana V.РевтовичСветлана Владимировна
Russian Federation

tvdemidkina@yandex.ruBazhulinaNatalia P.БажулинаНаталия Павловна
Russian Federation
tvdemidkina@yandex.ruTimofeevVladimir P.ТимофеевВладимир Петрович
Russian Federation
tvdemidkina@yandex.ruTkachevYaroslav V.ТкачёвЯрослав Владимирович
Russian Federation
tvdemidkina@yandex.ruFaleevNikolai G.ФалеевНиколай Григорьевич
Russian Federation
tvdemidkina@yandex.ruNikulinAleksey D.НикулинАлексей Донатович
Russian Federation
tvdemidkina@yandex.ruDemidkinaTatyana V.ДемидкинаТатьяна Викторовна
Russian Federation

tvdemidkina@yandex.ruEngelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of SciencesИнститут молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАНNesmeyanov Institute of Organoelement Compounds of the Russian Academy of SciencesИнститут элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАНInstitute of Protein Research of the Russian Academy of SciencesИнститут белка РАН2107202214250612210202022032021Copyright ©; 2022, Anufrieva N.V., Morozova E.A., Revtovich S.V., Bazhulina N.P., Timofeev V.P., Tkachev Y.V., Faleev N.G., Nikulin A.D., Demidkina T.V.Copyright ©; 2022, Ануфриева Н.В., Морозова Е.А., Ревтович С.В., Бажулина Н.П., Тимофеев В.П., Ткачёв Я.В., Фалеев Н.Г., Никулин А.Д., Демидкина Т.В.2022Anufrieva N.V., Morozova E.A., Revtovich S.V., Bazhulina N.P., Timofeev V.P., Tkachev Y.V., Faleev N.G., Nikulin A.D., Demidkina T.V.Ануфриева Н.В., Морозова Е.А., Ревтович С.В., Бажулина Н.П., Тимофеев В.П., Ткачёв Я.В., Фалеев Н.Г., Никулин А.Д., Демидкина Т.В.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/11242

Serine 339 of the active site of Citrobacter freundii methionine γ-lyase (MGL) is a conserved amino acid in most pyridoxal 5’-phosphate-dependent enzymes of the cystathionine β-lyase subclass, to which MGL belongs. The reaction mechanism of the MGL-catalyzed γ-elimination reaction is poorly explored. We replaced serine 339 with alanine using site-directed mutagenesis. The replacement of serine 339 with alanine led to a significant (by two orders of magnitude) decrease in efficiency in the catalysis of the γ- and β-elimination reactions by the mutant form of the enzyme. The exchange rates of the C-α- and C-β-protons in the amino acids in complexes consisting of the enzyme and competitive inhibitors decreased by one-two orders of magnitude. The spectral characteristics of the mutant form indicated that the replacement did not lead to significant changes in the conformation and tautomerism of MGL internal aldimine. We crystallized the holoenzyme and determined its spatial structure at 1.7 Å resolution. The replacement of serine 339 with alanine did not affect the overall course of the polypeptide chain of the MGL subunit and the tetrameric enzyme structure. An analysis of the obtained kinetic and spectral data, as well as the known spatial structures of C. freundii MGL, indicates that serine 339 is necessary for efficient catalysis of γ- and β-elimination reactions at the stage of C-α-proton abstraction from the external aldimine, the γ-elimination reaction at the stages of coenzyme C4’-atom protonation, and C-β-proton abstraction from a ketimine intermediate.

Остаток активного центра Citrobacter freundii метионин–γ-лиазы (МГЛ) серин 339 является консервативным у большинства пиридоксаль-5’-фосфат-зависимых ферментов структурного подкласса цистатионин–β-лиазы, к которому принадлежит МГЛ. Механизм реакции γ-элиминирования, катализируемой МГЛ, изучен недостаточно. Методом сайт-направленного мутагенеза серин 339 был заменен на аланин. Замена серина 339 на аланин привела к существенному (на два порядка) снижению эффективности катализа мутантной формой фермента реакций γ- и β-элиминирования. Скорости обмена С-α- и C-β-протонов аминокислот в комплексах фермента с конкурентными ингибиторами снизились на один-два порядка. Спектральные характеристики мутантной формы фермента свидетельствуют, что замена не приводит к существенным изменениям конформации и таутомерии внутреннего альдимина МГЛ. Получены кристаллы холофермента и его пространственная структура определена c разрешением 1.7 Å. Замена серина 339 на аланин не повлияла на общий ход полипептидной цепи субъединицы МГЛ и тетрамерную организацию молекулы фермента. Анализ кинетических, спектральных данных и известных пространственных структур C. freundii МГЛ свидетельствует, что остаток серина 339 необходим для эффективного катализа реакций γ- и β-элиминирования на стадии отрыва С-α-протона внешнего альдимина и в реакции γ-элиминирования на стадиях протонирования С4’-атома кофермента и отрыва С-β-протона в кетиминном интермедиате.

methionine γ-lyasepyridoxal 5’-phosphateSer339mutant formkinetic parametersspectral characteristicsspaial structureметионин–γ-лиазапиридоксаль-5’-фосфатSer339мутантная формакинетические параметрыспектральные характеристикипространственная структураПрограмма фундаментальных исследований государственных академий наукProgram for Basic Research of State Academies of Sciences01201363820Российский фонд фундаментальных исследованийRussian Foundation for Basic Research14-04-00349Российский фонд фундаментальных исследованийRussian Foundation for Basic Research14-04-31398Fundamental research program of state academies of sciences (№ 01201363820); Russian Foundation for Basic Research (projects № 14-04-00349 and № 14-04-31398).Программа фундаментальных исследований государственных академий наук (№01201363820); Российский фонд фундаментальных исследований (проекты № 14-04-00349 и № 14-04-31398).Onuffer J.J., Kirsch J.F. // Protein Sci. 1995. V. 4. № 9. P. 1750–1757.Vacca R.A., Giannattasio S., Capitani G., Marra E., Christen P. // BMC Biochem. 2008. V. 9. Р. 17.Golinelli-Pimpaneau B., Lüthi C., Christen P. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 33. P. 23969–23977.Belogurov A. Jr., Kozyr A., Ponomarenko N., Gabibov A. // Bioessays. 2009. V. 31. № 11. P. 1161–1171.Durova O.M., Vorobiev I.I., Smirnov I.V., Reshetnyak A.V., Telegin G.B., Shamborant O.G., Orlova N.A., Genkin D.D., Bacon A., Ponomarenko N.A., et al. // Mol. Immunol. 2009. V. 47. № 1. P. 87–95.Tanaka H., Esaki N., Soda K. // Enzyme Microb. Technol. 1985. V. 7. P. 530–537.Faleev N.G., Troitskaya M.V., Ivoylov V.S., Karpova V.V., Belikov V.M. // Applied Biochemistry and Microbiology. 1994. V. 30. № 3. P. 458–463.Фалеев Н.Г., Троицкая М.В., Ивойлов В.С., Карпова В.В., Беликов В.М. // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. № 3. С. 458–463.Tokoro M., Asai T., Kobayashi S., Takeuchi T., Nozaki T. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 43. P. 42717–42727.Lockwood B., Coombs G. // Biochem. J. 1991. V. 279. № 3. P. 675–682.Kreis W., Hession C. // Cancer Res. 1973. V. 33. № 8. P. 1862–1865.Yoshimura M., Nakano Y., Yamashita Y., Oho T., Saito T., Koga T. // Infection Immunity. 2000. V. 68. № 12. P. 6912–6916.Nakayama T., Esaki N., Lee W.-J., Tanaka I., Tanaka H., Soda K. // Agric. Biol. Chem. 1984. V. 48. P. 2367–2369.Revtovich S.V., Morozova E.A., Anufrieva N.V., Kotlov M.I., Bely Yu.F., Demidkina T.V. // Proceedings of the Russian Academy of Sciences. 2012. V. 445. № 2. P. 214–220.Ревтович С.В., Морозова Е.А., Ануфриева Н.В., Котлов М.И., Белый Ю.Ф., Демидкина Т.В. // ДАН. 2012. Т. 445. № 2. С. 214–220.Kulikova V.V., Morozova E.A., Revtovich S.V., Kotlov M.I., Anufrieva N.V., Bazhulina N.P., Raboni S., Faggiano S., Gabellieri E., Cion, P., et al. // IUBMB Life. 2017. V. 69. № 9. P. 668–676.Kulikova V.V., Morozova E.A., Revtovich S.V., Kotlov M.I., Anufrieva N.V., Bazhulina N.P., Raboni S., Faggiano S., Gabellieri E., Cion P., et al. // IUBMB Life. 2017. V. 69. № 9. P. 668–676.El-Sayed A.S. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 86. № 2. P. 445–467.Goyer A., Collakova E., Shachar-Hill Y., Hanson A.D. // Plant Cell Physiol. 2007. V. 48. № 2. P. 232–242.Morozova E.A., Revtovich S.V., Anufrieva N.V., Kulikova V.V., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2014. V. 70. № 11. P. 3034–3042.Anufrieva N.V., Morozova E.A., Kulikova V.V., Bazhulina N.P., Manukhov I.V., Degtev D.I., Gnuchikh E.Yu., Rodionov A.N., Zavilgelsky G.B., Demidkina T.V. // Acta Naturae. 2015. V. 7. № 4 (27). P. 141–148.Ануфриева Н.В., Морозова Е.А., Куликова В.В., Бажулина Н.П., Манухов И.В., Дёгтев Д.И., Гнучих Е.Ю., Родионов А.Н., Завильгельский Г.Б., Демидкина Т.В. // Acta Naturae. 2015. Т. 7. № 4 (27). С. 141–148.Kulikova V.V., Anufrieva N.V., Revtovich S.V., Chernov A.S., Telegin G.B., Morozova E.A., Demidkina T.V. // IUBMB Life. 2016. V. 68. № 10. P. 830–835.Morozova E.A., Kulikova V.V., Rodionov A.N., Revtovich S.V., Anufrieva N.V., Demidkina T.V. // Biochimie. 2016. V. 128–129. P. 92–98.Kulikova V.V., Chernukha M.Yu., Morozova E.A., Revtovich S.V., Rodionov A.N., Koval V.S., Avetisyan L.R., Kulyastova D.G., Shaginyan I.A., Demidkina T.V. // Acta Naturae. 2018. V. 10. № 3 (38). P. 83–87.Куликова В.В., Чернуха М.Ю., Морозова Е.А., Ревтович С.В., Родионов А.Н., Коваль В.С., Аветисян Л.Р., Кулястова Д.Г., Шагинян И.А., Демидкина Т.В. // Acta Naturae. 2018. T. 10. № 3 (38). C. 83–87.Yoshioka T., Wada T., Uchida N., Maki H., Yoshida H., Ide N., Kasai H., Hojo K., Shono K., Maekawa R., et al. // Cancer Res. 1998. V. 58. № 12. P. 2583–2587.Miki K., Al-Refaie W., Xu M., Jiang P., Tan Y., Bouvet M., Zhao M., Gupta A., Chishima T., Shimada H., et al. // Cancer Res. 2000. V. 60. № 10. P. 2696–2702.Tan Y., Xu M., Hoffman R.M. // Anticancer Res. 2010. V. 30. № 4. P. 1041–1046.Hoffman R.M. // Expert Opin. Biol. Ther. 2015. V. 15. № 1. P. 21–31.Käck H., Sandmark J., Gibson K., Schneider G., Lindqvist Y. // J. Mol. Biol. 1999. V. 291. № 4. P. 857–876.Mamaeva D.V., Morozova E.A., Nikulin A.D., Revtovich S.V., Nikonov S.V., Garber M.B., Demidkina T.V. // Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 2005. V. 61. № 6. P. 546–549.Nikulin A., Revtovich S., Morozova E., Nevskaya N., Nikonov S., Garber M., Demidkina T. // Acta Crystallogr. Sect. D. 2008. V. D64. № 2. P. 211–218.Revtovich S.V., Faleev N.G., Morozova E.A., Anufrieva N.V., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // Biochimie. 2014. V. 101. P. 161–167.Kuznetsov N.A., Faleev N.G., Kuznetsova A.A., Morozova E.A., Revtovich S.V., Anufrieva N.V., Nikulin A.D., Fedorovа O.S., Demidkina T.V. // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. № 1. P. 671–681.Revtovich S.V., Morozova E.A., Kulikova V.V., Anufrieva N.V., Osipova T.I., Koval V.S., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // BBA-Proteins Proteom. 2017. V. 1865. № 9. P. 1123–1128.Revtovich S.V., Morozova E.A., Khurs E.N., Zakomyrdina L.N., Nikulin A.D., Demidkina T.V., Khomutov R.M. // Biochemistry (Moscow). 2011. V. 76. №. 5. P. 690–698.Ревтович С.В., Морозова Е.А., Хурс Е.Н., Закомырдина Л.Н., Никулин А.Д., Демидкина Т.В., Хомутов Р.М. // Биохимия. 2011. Т. 76. № 5. С. 690–698.Nagai S., Flavin M. // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. № 17. P. 3884–3895.Morneau D.J.K., Abouassaf E., Skanes J.E., Aitken S.M. // Anal. Biochem. 2012. V. 423. № 1. P. 78–85.Manukhov I.V., Mamaeva D.V., Morozova E.A., Rastorguev S.M., Faleev N.G., Demidkina T.V., Zavilgelsky G.B. // Biochemistry (Moscow). 2006. V. 71. № 4. P. 454–463.Манухов И.В., Мамаева Д.В., Морозова Е.А., Расторгуев С.М., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В., Завильгельский Г.Б. // Биохимия. 2006. Т. 71. № 4. С. 454–463.Morozova E.A., Bazhulina N.P., Anufrieva N.V., Tkachev Ya.V., Streltsov S.A., Timofeev V.P., Faleev N.G., Demidkina T.V. // Biochemistry (Moscow). 2010. V. 75. № 10. P. 1435–1445.Морозова Е.А., Бажулина Н.П., Ануфриева Н.В., Ткачев Я.В., Стрельцов С.А., Тимофеев В.П., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В. // Биохимия. 2010. Т. 75. № 10. С. 1435–1445.Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680–685.Cleland W.W. // Methods Enzymol. 1979. V. 63. P. 103–138.Faleev N.G., Ruvinov S.B., Bakhmutov V.I., Demidkina T.V., Myagkikh I.V., Belikov V.M. // Mol. Biol. 1987. V. 21. P. 1636–1644.Фалеев Н.Г., Рувинов С.Б., Бахмутов В.И., Демидкина Т.В., Мягких И.В., Беликов В.М. // Молекуляр. биология. 1987. Т. 21. С. 1636–1644.Koulikova V.V., Zakomirdina L.N., Gogoleva O.I., Tsvetikova M.A., Morozova E.A., Komissarov V.V., Tkachev Y.V., Timofeev V.P., Demidkina T.V., Faleev N.G. // Amino Acids. 2011. V. 41. № 5. P. 1247–1256.Kainosho M., Ajisaka K., Kamisaku M., Murai A., Kyogoku Y. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 64. № 1. P. 425–432.Morino Y., Snell E.E. // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. № 23. P. 5591–5601.Peterson E.A., Sober H.A. // J. Am. Chem. Soc. 1954. V. 76. P. 169–175.Osterman A.L., Brooks H.B., Rizo J., Phillips M.A. // Biochemistry. 1997. V. 36. № 15. P. 4558–4567.Scatchard G. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1949. V. 51. P. 660–672.Kabsch W. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2010. V. 66. № 2. P. 125–132.Winn M.D., Ballard C.C., Cowtan K.D., Dodson E.J., Emsley P., Evans P.R., Keegan R.M., Krissinel E.B., Leslie A.G., McCoy A., et al. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2011. V. 67. № 2. P. 235–242.Adams P.D., Grosse-Kunstleve R.W., Hung L.-W., Ioerger T.R., McCoy A.J., Moriarty N.W., Read R.J., Sacchettini J.C., Sauter N.K., Terwilliger T.C. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2002. V. 58. № 11. P. 1948–1954.Emsley P., Lohkamp B., Scott W., Cowtan K. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2010. V. 66. № 4. P. 486–501.Brzovic P., Holbrook E.L., Greene R.C., Dunn M.F. // Biochemistry. 1990. V. 29. № 2. P. 442–451.Clausen T., Huber R., Laber B., Pohlenz H.D., Messerschmidt A. // J. Mol. Biol. 1996. V. 262. № 2. P. 202–224.Davis L., Metzler D. The Enzymes. 3rd Edn. V. 7 / Еd. Boyer P.D. N.Y.: Acad. Press, 1972. Р. 33–74. https://www.elsevier.com/books/the-enzymes/boyer/978-0-12-122707-4Clausen T., Huber R., Prade L., Wahl M.C., Messerschmidt A. // EMBO J. 1998. V. 17. № 23. P. 6827–6838.Messerschmid, A., Worbs M., Steegborn C., Wahl M. C., Huber R., Laber B., Clausen T. // Biol. Chem. 2003. V. 384. № 3. P. 373–386.Messerschmid A., Worbs M., Steegborn C., Wahl M.C., Huber R., Laber B., Clausen T. // Biol. Chem. 2003. V. 384. № 3. P. 373–386.Inou H., Inagaki K., Adachi N., Tamura T., Esaki N., Soda K., Tanaka H. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. V. 64. № 11. P. 2336–2343.Sato D., Shiba T., Karaki T., Yamagat W., Nozaki T., Nakazawa T., Harada S. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 1. P. 4874.Anufrieva N.V., Faleev N.G., Morozova E.A., Bazhulina N.P., Revtovich S.V., Timofeev V.P., Tkachev Y.V., Nikulin A.D., Demidkina T.V. // Biochim. Biophys. Acta. 2015. V. 1854. № 9. P. 1220–1228.Jaworski A.F., Lodha P.H., Manders A.L., Aitken S.M. // Protein Sci. 2012. V. 21. № 11. P. 1662–1671.Lodha P.H., Aitken S.M. // Biochemistry. 2011. V. 50. № 45. P. 9876–9885.