Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1107010.32607/actanaturae.11070Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleGLAD-PCR assay of R(5mC)GY sites in the regulatory region of tumor-suppressor genes associated with gastric cancerGLAD-ПЦР-анализ сайтов метилирования ДНК в регуляторных областях генов-онкосупрессоров при раке желудкаMalyshevBoris S.МалышевБорис Сотиволдиевич
Russian Federation
malyshevb@vector.nsc.ruNetesovaNina A.НетесоваНина Александровна
Russian Federation
ninanet@vector.nsc.ruSmetannikovaNatalia A.СметанниковаНаталья Анатольевна
Russian Federation
smetannikova@vector.nsc.ruAbdurashitovMurat A.АбдурашитовМурат Абдурашитович
Russian Federation
abd@sibenzyme.ruAkishevAlexander G.АкишевАлександр Григорьевич
Russian Federation
aki@sibenzyme.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3384-8406DubininEvgeny V.ДубининЕвгений Викторович
Russian Federation

Business development manager, PhD

зам.директора по развитию, к.э.н.

evgeny.dubinin@epigene.ruAzanovArtur Z.АзановАртур Закирчанович
Russian Federation
05-guz-okod@kuzdrav.ruVihlyanovIgor V.ВихляновИгорь Владиславович
Russian Federation
akod@akod22.ruNikitinMaxim K.НикитинМаксим Константинович
Russian Federation
privet_com@mail.ruKarpovAndrey B.КарповАндрей Борисович
Russian Federation
andrey.karpov@remhc.orghttps://orcid.org/0000-0003-1920-80237006512820DegtyarevSergey Kh.ДегтяревСергей Харитонович
Russian Federation

PhD, Professor

Доктор биологических наук, Профессор

degt@sibenzyme.comState Research Center of Virology and Biotechnology «Vector»Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» РоспотребнадзораEpiGene LLCООО «ЭпиДжин»EpiGene LLC2ООО «ЭпиДжин»Regional Clinical Oncology CenterОбластной клинический онкологический диспансерAltai Regional Oncology CenterАлтайский краевой онкологический диспансерSeversk Biophysical Research CentreСеверский биофизический научный центр ФМБА России271020201231241330307202024072020Copyright ©; 2020, Malyshev B.S., Netesova N.A., Smetannikova N.A., Abdurashitov M.A., Akishev A.G., Dubinin E.V., Azanov A.Z., Vihlyanov I.V., Nikitin M.K., Karpov A.B., Degtyarev S.K.Copyright ©; 2020, Малышев Б.С., Нетесова Н.А., Сметанникова Н.А., Абдурашитов М.А., Акишев А.Г., Дубинин Е.В., Азанов А.З., Вихлянов И.В., Никитин М.К., Карпов А.Б., Дегтярев С.Х.2020Malyshev B.S., Netesova N.A., Smetannikova N.A., Abdurashitov M.A., Akishev A.G., Dubinin E.V., Azanov A.Z., Vihlyanov I.V., Nikitin M.K., Karpov A.B., Degtyarev S.K.Малышев Б.С., Нетесова Н.А., Сметанникова Н.А., Абдурашитов М.А., Акишев А.Г., Дубинин Е.В., Азанов А.З., Вихлянов И.В., Никитин М.К., Карпов А.Б., Дегтярев С.Х.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/11070

At early stages of carcinogenesis, the regulatory regions of some tumor suppressor genes become aberrantly methylated at RCGY sites, which are substrates of DNA methyltransferase Dnmt3. Identification of aberrantly methylated sites in tumor DNA is considered to be the first step in the development of epigenetic PCR test systems for early diagnosis of cancer. Recently, we have developed a GLAD-PCR assay, a method for detecting the R(5mC)GY site in the genome position of interest even at significant excess of DNA molecules with a non-methylated RCGY site in this location. The aim of the present work is to use the GLAD-PCR assay to detect the aberrantly methylated R(5mC)GY sites in the regulatory regions of tumor suppressor genes (brinp1, bves, cacna2d3, cdh11, cpeb1, epha7, fgf2, galr1, gata4, hopx, hs3st2, irx1, lrrc3b, pcdh10, rprm, runx3, sfrp2, sox17, tcf21, tfpi2, wnt5a, zfp82, and znf331) in DNA samples obtained from gastric cancer (GC) tissues. The study of the DNA samples derived from 29 tumor and 25 normal gastric tissue samples demonstrated a high diagnostic potential of the selected RCGY sites in the regulatory regions of the irx1, cacna2d3, and epha7 genes; the total indices of sensitivity and specificity for GC detection being 96.6% and 100%, respectively.

На ранних стадиях канцерогенеза опухолевая ДНК подвергается аберрантному метилированию регуляторных областей ряда генов-онкосупресcоров по сайтам RCGY, служащих субстратом для ДНК-метилтрансферазы Dnmt3. Выявление аберрантно метилированных сайтов в ДНК различных опухолей считается первым шагом в создании эпигенетических ПЦР тест-систем для ранней диагностики онкозаболеваний. Ранее мы разработали метод GLAD-ПЦР, позволяющий определять сайт R(5mC)GY в конкретной позиции генома человека даже в условиях значительного избытка молекул ДНК с неметилированным сайтом RCGY в этой позиции. Цель настоящей работы состояла в определении аберрантно метилированных сайтов R(5mC)GY в регуляторных областях генов-онкосупрессоров (brinp1, bves, cacna2d3, cdh11, cpeb1, epha7, fgf2, galr1, gata4, hopx, hs3st2, irx1, lrrc3b, pcdh10, rprm, runx3, sfrp2, sox17, tcf21, tfpi2, wnt5a, zfp82 и znf331) в препаратах ДНК из тканей рака желудка с помощью GLAD-ПЦР-анализа. На образцах ДНК из операционного материала опухолей (n = 29) и морфологически неизмененных тканей (n = 25) показан высокий диагностический потенциал панели эпигенетических онкомаркеров рака желудка, состоящей из сайтов R(5mC)GY в регуляторных участках генов irx1, cacna2d3 и epha7: суммарные показатели чувствительности и специфичности составляют 96.6 и 100.0% соответственно.

gastric cancertumor suppressor genesDNA methylationGLAD-PCR assaymethyl-directed DNA endonuclease GlaIрак желудкагены-онкосупрессорыметилирование ДНКGLAD-ПЦР-анализметилзависимая сайт-специфичная ДНК-эндонуклеаза GlaISkolkovo FoundationФонд СколковоIARC, Stewart BW, Wild CP, ed. World Cancer Report 2014. Geneva: WHO Press; 2014.IARC. / Eds Stewart B.W., Wild C.P. World Cancer Report 2014. Geneva: WHO Press, 2014.IARC. Press release N 263. WHO, Geneva, Switzerland; 2018. https://www.who.int/cancer/PRGlobocanFinal.pdf. Accessed 25 Sep 2019.IARC. Press release № 263. WHO, Geneva, Switzerland, 2018. https://www.who.int/cancer/PRGlobocanFinal.pdf. Accessed 25 Sep 2019.Siegel R., Ma J., Zou Z., Jemal A. // CA Cancer J Clin. 2014. V. 64. № 1. P. 9–29.Siegel R., Ma J., Zou Z., Jemal A. // CA Cancer J. Clin. 2014. V. 64. № 1. P. 9–29.Cancer.net. Doctor-Approved Patient Information from ASCO. https://www.cancer.net/cancer-types/stomach-cancer/statistics. Accessed 25 Sep 2019.Cancer.net. Doctor-approved patient information from ASCO. https://www.cancer.net/cancer-types/stomach-cancer/statistics. Accessed 25 Sep. 2019.International medical center ONCLINIC. https://www.onclinic.ru/articles/zabolevaniya/ onkologiya/vyzhivaemost_pri_rake_zheludka. Accessed 25 Sep 2019.International medical center ONCLINIC. https://www.onclinic.ru/articles/za bolevaniya/ onkologiya/vyzhivaemost_pri_rake_zheludka. Accessed 25 Sep. 2019.American Cancer Society. https://www.cancer.org/cancer/stomach-cancer/detection-diagnosis-staging/survival-rates.html. Accessed 25 Sep 2019.American Cancer Society. https://www.cancer.org/cancer/stomach-cancer/detection-diagnosis-staging/survival-rates.html. Accessed 25 Sep. 2019.de Cáceres I., Cairns P. // Clin Transl Oncol. 2007. V. 9. № 7. P. 429–437.de Cáceres I., Cairns P. // Clin. Transl. Oncol. 2007. V. 9. № 7. P. 429–437.Langevin S.M., Kratzke R.A., Kelsey K.T. // Transl Res. 2015. V. 165. № 1. P. 74–90.Langevin S.M., Kratzke R.A., Kelsey K.T. // Transl. Res. 2015. V. 165. № 1. P. 74–90.Handa V., Jeltsch A. // J Mol Biol. 2005. V. 348. № 5. P. 1103–1112.Handa V., Jeltsch A. // J. Mol. Biol. 2005. V. 348. № 5. P. 1103–1112.Tarasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S.K. // BMC Mol Biol. 2008. V. 9. P. 7.Tarasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S.K. // BMC Mol. Biol. 2008. V. 9. P. 7.Kuznetsov V.V., Akishev A.G., Abdurashitov M.A., Degtyarev S.K. // Patent RU 2525710 (in Russian). IPC C12Q 1/68 (2006.01). 2014.Кузнецов В.В., Акишев А.Г., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Патент № 2525710 РФ. МПК C12Q 1/68 (2006.01). 2014.Evdokimov A.A., Netesova N.A., Smetannikova N.A., Abdurashitov M.A., Akishev A.G., Davidovich E.S., Ermolaev Yu.D., Karpov A.B., Sazonov A.E., Tahauov R.M. et al. // Prob Oncol (Voprosy Onkologii, in Russian). 2016. V. 62. P. 117–121.Евдокимов А.А., Нетесова Н.А., Сметанникова Н.А., Абдурашитов М.А., Акишев А.Г., Давидович Е.С., Ермолаев Ю.Д., Карпов А.Б., Сазонов А.Э., Тахауов Р.М. и др. // Вопросы онкологии. 2016. Т. 62. С. 117–121.Evdokimov A.A., Netesova N.A., Smetannikova N.A., Abdurashitov M.A., Akishev A.G., Malyshev B.S., Davidovich E.S., Fedotov V.V., Kuznetsov V.V., Ermolaev Yu.D. et al. // Biol Med (Aligarh). 2016. V. 8. P. 342.Evdokimov A.A., Netesova N.A., Smetannikova N.A., Abdurashitov M.A., Akishev A.G., Malyshev B.S., Davidovich E.S., Fedotov V.V., Kuznetsov V.V., Ermolaev Yu.D., et al. // Biol. Med. (Aligarh). 2016. V. 8. P. 342.Smith K., Klko S., Cantor Ch. Genome analysis. Methods. Davis K, ed. (in Russian) Moscow: Mir, 1990. 244 p.Смит К., Клко С., Кантор Ч. Анализ генома. Методы. / Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990. 244 с.Pepe M.S. The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction. New York: Oxford, 2003. 320 p.Pepe M.S. The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction. Oxford: Oxford University Press, 2003. 320 с.Sepulveda J.L., Gutierrez-Pajares J.L., Luna A., Yao Y., Tobias J.W., Thomas S. Woo Y., Giorgi F., Komissarova E.V., et al // Mod Pathol. 2016. V. 29. № 2. P. 182–193.Sepulveda J.L., Gutierrez-Pajares J.L., Luna A., Yao Y., Tobias J.W., Thomas S. Woo Y., Giorgi F., Komissarova E.V., et al // Mod. Pathol. 2016. V. 29. № 2. P. 182–193.Lim B., Kim J.H., Kim M., Kim S.Y. // World J Gastroenterol. 2016. V. 22. № 3. P. 1190–1201.Lim B., Kim J.H., Kim M., Kim S.Y. // World J. Gastroenterol. 2016. V. 22. № 3. P. 1190–1201.Yuasa Y., Nagasaki H., Akiyama Y., Hashimoto Y., Takizawa T., Kojima K., Kawano T., Sugihara K., Imai K., Nakachi K. // Int. J. Cancer. 2009. V. 124. № 11. P. 2677–2682.Caldeira J., Simoes-Correia J., Paredes J., Pinto M.T., Sousa S., Corso G., Marrelli D., Roviello F., Pereira P.S., Weil D., et al. // Gut. 2012. V. 61. № 8. P. 1115–1123.Akiyama Y., Watkins N., Suzuki H., Jair K.W., van Engeland M., Esteller M., Sakai H., Ren C.Y., Yuasa Y., Herman J.G., et al. // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. № 23. P. 8429–8439.Ooki A., Yamashita K., Kikuchi S., Sakuramoto S., Katada N., Kokubo K., Kobayashi H., Kim M.S., Sidransky D., Watanabe M. // Oncogene. 2010. V. 29. P. 3263–3275.Kim M., Kim J.H., Jang H.R., Kim H.M., Lee C.W., Noh S.M., Song K.S., Cho J.S., Jeong H.Y., Hahn Y., et al. // Cancer Res. 2008. V. 68. P. 7147–7155.Yu J., Cheng Y.Y., Tao Q., Cheung K.F., Lam C.N., Geng H., Tian L.W., Wong Y.P., Tong J.H., Ying J.M., et.al. // Gastroenterology. 2009. V. 136. № 2. P. 640–651.Yu J., Cheng Y.Y., Tao Q., Cheung K.F., Lam C.N., Geng H., Tian L.W., Wong Y.P., Tong J.H., Ying J.M., et al. // Gastroenterology. 2009. V. 136. № 2. P. 640–651.Wang H., Zheng Y., Lai J., Luo Q., Ke H., Chen Q. // PLoS One. 2016. V. 11. № 12. P. e0168635.Wang H., Zheng Y., Lai J., Luo Q., Ke H., Chen Q. // PLoS One. 2016. V. 11. № 12. e0168635.Oishi Y., Watanabe Y., Yoshida Y., Sato Y., Hiraishi T., Oikawa R., Maehata T., Suzuki H., Toyota M., Niwa H., et.al. // Tumour Biol. 2012. V. 33. № 2. P. 383–393.Oishi Y., Watanabe Y., Yoshida Y., Sato Y., Hiraishi T., Oikawa R., Maehata T., Suzuki H., Toyota M., Niwa H., et al. // Tumour Biol. 2012. V. 33. № 2. P. 383–393.Yang Z., Li D.M., Xie Q., Dai D.Q. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2015. V. 141. № 2. P. 211–220.Jee C.D., Kim M.A., Jung E.J., Kim J., Kim W.H. // Eur. J. Cancer. 2009. V. 45. № 7. P. 1282–1293.Yu J., Liang Q.Y., Wang J., Cheng Y., Wang S., Poon T.C., Go M.Y., Tao Q., Chang Z., Sung J.J. // Oncogene. 2013. V. 32. № 3. P. 307–317.Wang S., Cheng Y., Du W., Lu L., Zhou L., Wang H., Kang W., Li X., Tao Q., Sung J.J., et.al. // Gut. 2013. V. 62. № 6. P. 833–841.Wang S., Cheng Y., Du W., Lu L., Zhou L., Wang H., Kang W., Li X., Tao Q., Sung J.J., et al. // Gut. 2013. V. 62. № 6. P. 833–841.Qu Y., Dang S., Hou P. // Clin. Chim. Acta. 2013. V. 424. P. 53–65.Tamkovich S.N., Vlasov V.V., Laktionov P.P. // Mol. Biol. 2008. V. 42. № 1. P. 12–23.Тамкович С.Н., Власов В.В., Лактионов П.П. // Молекуляр. биология. 2008. Т. 42. № 1. С. 12–23.