Prophylaxis and treatment of inherited clotting disorder hemophilia A requires regular administration of factor VIII. Recombinant factor VIII, which is produced in CHO or BHK cells, is equivalent to the plasma derived one and is prevalent in current clinical practice in developed countries. Development of a biosimilar recombinant FVIII requires the creation of a highly productive clonal cell line and generation of monoclonal antibodies suitable for affinity purification of the product. Methotrexate-driven transgene amplification of genetic cassettes that code full-length and truncated variants of FVIII under the control of the CMV promoter was studied. It was shown that the expression level of the truncated variant of FVIII is 6.5 times higher than that of the full-length molecule. The transgene amplification procedure was sufficient for a twofold increase of the expression level in the transfected cells pool and subsequent selection of the clonal line, stably producing truncated FVIII at the level of 0.52 IU/ml during cultivation in a chemically defined protein-free culture medium. Four generated mouse monoclonal antibodies toward the heavy chain of FVIII were found suitable for binding the truncated variant of FVIII directly from the conditioned medium and elution of the FVIII with a more than 85% yield and normal pro-coagulant activity. The producer cell line and monoclonal antibodies obtained are sufficient for the development of upstream and downstream processes of biosimilar FVIII production. Generation of more productive cell lines by the use of stronger, nonviral promoters and shorter cDNA of FVIII will be the subject of further studies.
Больные гемофилией А - наследственным нарушением свертывания крови - нуждаются в регулярном применении препаратов фактора свертывания крови VIII. Рекомбинантный фактор VIII, продуцируемый в клетках линий СНО или ВНК, эквивалентен природному фактору VIII плазмы крови и широко используется в современной клинической практике. Получение биосимилярного рекомбинантного фактора VIII требует создания высокопродуктивной клональной клеточной линии и получения моноклональных антител, пригодных для аффинной очистки продукта. Изучена возможность амплификации трансгенов полноразмерного и делеционного вариантов фактора VIII, встроенных под контролем цитомегаловирусного промотора в геном трансфицированных клеток, под действием метотрексата. Установлено, что уровень секреции делеционного варианта фактора VIII в 6.5 раза выше, чем природного FVIII. Амплификация трансгена позволила удвоить уровень секреции делеционного варианта фактора VIII, продуцируемого в поликлональной клеточной популяции, и получить клональную клеточную линию, стабильно секретирующую делеционный вариант фактора VIII (до 0.52 МЕ/мл) при суспензионном культивировании в среде определенного химического состава, не содержащей продуктов животного происхождения. Получены четыре моноклональных антитела, узнающие тяжелую цепь фактора VIII и пригодные для адсорбции делеционного варианта фактора VIII непосредственно из культуральной среды и последующей элюции биологически активного фактора VIII с выходом более 85%. Полученные линия-продуцент и моноклональные антитела могут использоваться для разработки схемы промышленного культивирования и очистки рекомбинантного фактора VIII. В дальнейшем планируется получить более продуктивные клеточные линии при помощи невирусных промоторов и укороченной кДНК фактора VIII.