The complete decipherment of the functions and interactions of the elements of the riboflavin biosynthesis operon (rib operon) of Bacillus subtilis are necessary for the development of superproducers of this important vitamin. The function of its terminal ribT gene has not been established to date. In this work, a search for homologs of the hypothetical amino acid sequence of the gene product through databases, as well as an analysis of the homolgs, was performed; the distribution of secondary structure elements was theoretically predicted; and the tertiary structure of the RibT protein was proposed. The ribT gene nucleotide sequence was amplified and cloned into the standard high-copy expression vector pET15b and then expressed after induction with IPTG in E. coli BL21 (DE3) strain cells containing the inducible phage T7 RNA polymerase gene. The ribT gene expression was confirmed by SDS-PAGE. The protein product of the expression was purified by affinity chromatography. Therefore, the real possibility of RibT protein production in quantities sufficient for further investigation of its structure and functional activity was demonstrated.
Полная расшифровка функций и взаимодействия элементов оперона биосинтеза рибофлавина (rib-оперон) у Bacillus subtilis необходима для создания сверхпродуцентов этого важнейшего витамина. Функция гена ribT, замыкающего оперон, до сих пор не определена. В представленной работе проведен поиск гомологов гипотетической аминокислотной последовательности продукта этого гена в базах данных, а также анализ гомологий, теоретически предсказано распределение элементов вторичной структуры, предложена третичная структура белка RibT. Нуклеотидная последовательность гена ribT была амплифицирована и клонирована в стандартный мультикопийный экспрессионный вектор pET15b, а затем экспрессирована после индукции ИПТГ в клетках Escherichia coli BL21(DE3), содержавших индуцибельный ген РНК-полимеразы фага Т7. Экспрессия гена ribT подтверждена электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE). Белковый продукт экспрессии очищен с помощью аффинной хроматографии. Таким образом, показана принципиальная возможность получения белка RibT в количествах, достаточных для дальнейшего изучения его структуры и функциональной активности.