The TATA-binding protein (ТВР) is a key part of the transcription complex of RNA polymerase II. Alone or as a part of the basal transcription factor TFIID, TBP binds the TATA box located in the core region of the TATA-containing promoters of class II genes. Previously, we studied the effects of single nucleotide polymorphisms (SNPs) on ТВР/ТАТА-box interactions using gel retardation assay. It was demonstrated that most SNPs in the ТАТА boxes of some human gene promoters cause a 2- to 4-fold decrease in ТВР/ТАТА affinity, which is associated with an increased risk of hereditary diseases, such as β thalassemias of diverse severity, hemophilia B Leyden, myocardial infarction, thrombophlebitis, lung cancer, etc. In this work, the process of ТВР/ТАТА complex formation has been studied in real time by a stopped-flow technique using recombinant human TBP and duplexes, which were identical to the TATA box of the wild-type and a SNP-containing triosephosphate isomerase gene promoter and were fluorescently labeled by the Cy3/Cy5 FRET pair. It has been demonstrated for the first time that real-time binding of ТВР to the TATA box of the TPI gene promoter is complete within 10 s and is described by a single-stage kinetic model. The complex formation of ТВР with the wild-type TATA box occurs 5.5 times faster and the complex dissociation occurs 31 times slower compared with the SNPcontaining TATA box. Within the first seconds of the interaction, ТВР binds to and simultaneously bends the TATA box. Importantly, the TATA box of the wild-type TPI gene promoter requires lower TBP concentrations compared to the TATA box containing the -24Т → G SNP, which is associated with neurological and muscular disorders, cardiomyopathy, and other diseases.
ТАТА-связывающий белок (TATA-Binding Protein, ТВР) - ключевой компонент транскрипционного комплекса РНК-полимеразы II. Самостоятельно или в составе базального фактора транскрипции TFIID ТВР связывает ТАТА-бокс, расположенный в коровой области ТАТА-содержащих промоторов генов II-го класса. Ранее методом «задержки ДНК в геле» мы изучали влияние однонуклеотидных полиморфизмов (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) на взаимодействие ТВР с ТАТА-боксом. Показано, что большинство SNPs в ТАТА-боксах ряда промоторов генов человека вызывают снижение в 2-4 раза сродства ТВР/ТАТА, ассоциированное с повышенным риском возникновения таких наследственных заболеваний, как β-талассемии различной тяжести, гемофилия В Лейдена, инфаркт миокарда, рак легкого и др. В представленной работе, используя рекомбинантный ТВР человека и флуоресцентно меченные FRET-парой флуорофоров Cy3- и Cy5-дуплексы, идентичные ТАТА-боксу промотора нормального гена триозофосфатизомеразы (TPI) человека и ТАТА-боксу, содержащему SNP -24T > G, методом «остановленной струи» в режиме реального времени исследован процесс образования комплекса ТВР/ТАТА. Впервые показано, что связывание ТВР с ТАТА-боксом промотора гена TPI происходит в течение 10 с и описывается одностадийной кинетической моделью. Образование комплексов ТВР с нормальным ТАТА-боксом происходит в 5.5 раза быстрее, а диссоциация - в 31 раз медленнее, чем в случае ТАТА-бокса, содержащего SNP. В первые секунды взаимодействия ТВР связывает и одновременно изгибает ТАТА-бокс, причем для промотора гена TPI дикого типа требуются меньшие концентрации ТВР, чем для SNP-содержащего ТАТА-бокса, ассоциирован ного с неврологическими и мышечными нарушениями, кардиомиопатией и другими заболеваниями.