Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1052610.32607/20758251-2014-6-4-60-66Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleHuman SLURP-1 and SLURP-2 Proteins Acting on Nicotinic Acetylcholine Receptors Reduce Proliferation of Human Colorectal Adenocarcinoma HT-29 CellsБелки человека SLURP-1 и SLURP-2, действующие на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, замедляют пролиферацию клеток колоректальной аденокарциномы HT-29LyukmanovaE. N.ЛюкмановаЕ. Н.
Russian Federation
ekaterina-lyukmanova@yandex.ruShulepkoM. A.ШулепкоМ. А.
Russian Federation
ekaterina-lyukmanova@yandex.ruBychkovM. L.БычковМ. Л.
Russian Federation
ekaterina-lyukmanova@yandex.ruShenkarevZ. O.ШенкаревЗ. О.
Russian Federation
ekaterina-lyukmanova@yandex.ruParamonovA. S.ПарамоновА. С.
Russian Federation
ekaterina-lyukmanova@yandex.ruChugunovA. O.ЧугуновА. О.
Russian Federation
ekaterina-lyukmanova@yandex.ruArsenievA. S.АрсеньевА. С.
Russian Federation
ekaterina-lyukmanova@yandex.ruDolgikhD. A.ДолгихД. А.
Russian Federation
ekaterina-lyukmanova@yandex.ruKirpichnikovM. P.КирпичниковМ. П.
Russian Federation
ekaterina-lyukmanova@yandex.ruShemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic ChemistryИнститут биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАНLomonosov Moscow State UniversityМосковский государственный университет им. М.В. ЛомоносоваMoscow Institute of Physics and Technology (State University)Московский физико-технический институт (Государственный университет)1512201464VOL 6, NO4 (2014)ТОМ 6, №4 (2014)606617012020Copyright ©; 2014, Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Bychkov M.L., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Chugunov A.O., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P.Copyright ©; 2014, Люкманова Е.Н., Шулепко М.А., Бычков М.Л., Шенкарев З.О., Парамонов А.С., Чугунов А.О., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П.2014Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Bychkov M.L., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Chugunov A.O., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P.Люкманова Е.Н., Шулепко М.А., Бычков М.Л., Шенкарев З.О., Парамонов А.С., Чугунов А.О., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10526

Human secreted Ly-6/uPAR related proteins (SLURP-1 and SLURP-2) are produced by various cells, including the epithelium and immune system. These proteins act as autocrine/paracrine hormones regulating the growth and differentiation of keratinocytes and are also involved in the control of inflammation and malignant cell transformation. These effects are assumed to be mediated by the interactions of SLURP-1 and SLURP-2 with the α7 and α3β2 subtypes of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), respectively. Available knowledge about the molecular mechanism underling the SLURP-1 and SLURP-2 effects is very limited. SLURP-2 remains one of the most poorly studied proteins of the Ly-6/uPAR family. In this study, we designed for the first time a bacterial system for SLURP-2 expression and a protocol for refolding of the protein from cytoplasmic inclusion bodies. Milligram quantities of recombinant SLURP-2 and its 13С-15N-labeled analog were obtained. The recombinant protein was characterized by NMR spectroscopy, and a structural model was developed. A comparative study of the SLURP-1 and SLURP-2 effects on the epithelial cell growth was conducted using human colorectal adenocarcinoma HT-29 cells, which express only α7-nAChRs. A pronounced antiproliferative effect of both proteins was observed. Incubation of cells with 1 μM SLURP-1 and 1 μM SLURP-2 during 48 h led to a reduction in the cell number down to ~ 54 and 63% relative to the control, respectively. Fluorescent microscopy did not reveal either apoptotic or necrotic cell death. An analysis of the dose-response curve revealed the concentration-dependent mode of the SLURP-1 and SLURP-2 action with EC50 ~ 0.1 and 0.2 nM, respectively. These findings suggest that the α7-nAChR is the main receptor responsible for the antiproliferative effect of SLURP proteins in epithelial cells.

Белки человека SLURP-1 и SLURP-2, принадлежащие семейству Ly-6/uPAR, секретируются различными клетками, включая эпителиальные и иммунные. Эти белки действуют как ауто/паракринные гормоны, регулирующие рост и дифференцировку кератиноцитов, а также участвуют в контроле воспалительных процессов и злокачественной трансформации клеток. Предполагаемой мишенью SLURP-1 и SLURP-2 являются никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) типа α7 и α3β2 соответственно. Детальные молекулярные механизмы, лежащие в основе действия SLURP-1 и SLURP-2, остаются в настоящее время не охарактеризованными. SLURP-2 - один из наименее изученных белков семейства Ly-6/uPAR. В представленной работе разработаны система продукции SLURP-2 в клетках Escherichia coli и протокол ренатурации белка из цитоплазматических телец включения. Получены миллиграммовые количества рекомбинантного SLURP-2 и его 13С-15N-меченого аналога. Рекомбинантный белок охарактеризован методом ЯМР-спектроскопии, построена модель пространственной структуры SLURP-2. На клетках колоректальной аденокарциномы человека НТ-29, экспрессирующих нАХР только типа α7, проведено сравнительное исследование действия рекомбинантных белков SLURP-1 и SLURP-2. Показано, что SLURP-1 и SLURP-2 оказывают антипролиферативный эффект, вызывая значительное снижение популяции клеток в течение 48 ч, при этом методами флуоресцентной микроскопии не выявлено ни апоптотической, ни некротической гибели клеток. Полуэффективные концентрации (ЕС50) составили ~ 0.1 и 0.2 нМ для SLURP-1 и SLURP-2 соответственно. Максимальный эффект (~ 54 и 63% живых клеток относительно контроля) наблюдали при концентрации SLURP-1 и SLURP-2, равной 1 мкМ. Полученные данные указывают на нАХР типа α7 как на главный рецептор, ответственный за антипролиферативный эффект белков SLURP в эпителиальных клетках человека.

nicotinic acetylcholine receptorbacterial expressionrefoldingLynxcolon cancerбактериальная экспрессияникотиновый ацетилхолиновый рецепторренатурациярак кишечникаLynxThe development of the system for recombinant SLURP-2 production, the production of recombinant SLURP-2, and the structural and functional studies of SLURP-2 were performed with the financial support of the Russian Science Foundation (agreement #14-14- 00255). The production of recombinant SLURP-1 and its functional studies were performed with the support of the Russian Academy of Sciences (“Molecular and Cell Biology” program) and the Russian Foundation for Basic Research (grant #12-04-01639).Разработка системы рекомбинантной продукции SLURP-2, получение рекомбинантного препарата SLURP-2 и структурно-функциональные исследования SLURP-2 выполнены при финансовой поддержке РНФ (соглашение № 14-14-00255). Продукция рекомбинантного препарата SLURP-1 и его функциональные исследования выполнены при поддержке РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология») и РФФИ (грант № 12-04-01639-а).[1] Papke R.L. // Biochem. Pharmacol. 2014, V.89, №1, P.1-11[2] Sharma G., Vijayaraghavan S. // J. Neurobiol. 2002, V.53, №4, P.524-534[3] Miwa J.M., Ibanez-Tallon I., Crabtree G.W., Sánchez R., Sali A., Role L.W., Heintz N. // Neuron. 1999, V.23, №1, P.105-114[4] Tekinay A.B., Nong Y., Miwa J.M., Lieberam I., Ibanez-Tallon I., Greengard P., Heintz N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009, V.106, P.4477-4482[5] Chimienti F., Hogg R.C., Plantard L., Lehmann C., Brakch N., Fischer J., Huber M., Bertrand D., Hohl D. // Human Molecular Genetics 2003, V.12, P.3017-3024[6] Arredondo J., Chernyavsky A.I., Jolkovsky D.L., Webber R.J., Grando S.A. // J. Cell. Physiol. 2006, V.208, P.238-245[7] Darvas M., Morsch M., Racz I., Ahmadi S., Swandulla D., Zimmer A. // Eur. Neuropsychopharmacol. 2009, V.19, P.670-681[8] Tsetlin V., Utkin Y., Kasheverov I. // Biochem. Pharmacol. 2009, V.78, P.720-731[9] Moriwaki Y., Watanabe Y., Shinagawa T., Kai M., Miyazawa M., Okuda T., Kawashima K., Yabashi A., Waguri S., Misawa H. // Neurosci. Res. 2009, V.64, P.403-412[10] Moriwaki Y., Yoshikawa K., Fukuda H., Fujii Y.X., Misawa H., Kawashima K. // Life Sci. 2007, V.80, P.2365-2368[11] Arredondo J., Chernyavsky A.I., Webber R.J., Grando S.A. // J. Invest. Dermatol. 2005, V.125, P.1236-1241[12] Chernyavsky A.I., Galitovskiy V., Shchepotin I.B., Grando S.A. // Biomed. Res. Int. 2014, V.2014, P.609086[13] Chernyavsky A.I., Kalantari-Dehaghi M., Phillips C., Marchenko S., Grando S.A. // Wound Repair Regen. 2012, V.20, №1, P.103-113[14] Arredondo J., Chernyavsky A.I., Grando S.A. // Life Sci. 2007, V.80, P.2243-2247[15] Arredondo J., Chernyavsky A.I., Grando S.A. // Biochem. Pharmacol. 2007, V.74, №8, P.1315-1319[16] Chernyavsky A.I., Marchenko S., Phillips C., Grando S.A. // Dermatoendocrinol. 2012, V.4, №3, P.324-330[17] Pettersson A., Nylund G., Khorram-Manesh A., Nordgren S., Delbro D.S. // Auton. Neurosci. 2009, V.148, P.97-100[18] Summers A.E., Whelan C.J., Parsons M.E. // Life Sci. 2003, V.72, №18-19, P.2091-2094[19] Shulepko M.A., Lyukmanova E.N., Paramonov A.S., Lobas A.A., Shenkarev Z.O., Kasheverov I.E., Dolgikh D.A., Tsetlin V.I., Arseniev A.S., Kirpichnikov M.P. // Biochemistry (Mosc). 2013, V.78, P.204-211[20] Webb B., Sali A. // Current Protocols in Bioinformatics. 2014, V.47, №5-6, P.1-32[21] Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Tikhonov R.V., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Wulfson A.N., Kasheverov I.E., Ustich T.L., Utkin Y.N., Arseniev A.S. // Biochemistry (Mosc). 2009, V.74, P.1142-1149[22] Shulepko M.A., Lyukmanova E N., Kasheverov I.E., Dolgikh D.A., Tsetlin V.I., Kirpichnikov M.P. // Russian J. Bioorg. Chem. 2011, V.37, P.43-549[23] Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Shulepko M.A., Mineev K.S., D’Hoedt D., Kasheverov I.E., Filkin S., Janickova H., Dolezal V., Dolgikh D.A. // J. Biol.Chem. 2011, V.286, P.1061-810627[24] Grando S.A. // J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 1997, V.2, №1, P.41-48