Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1051310.32607/20758251-2015-7-1-60-69Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleThe Role of Ala198 in the Stability and Coenzyme Specificity of Bacterial Formate DehydrogenasesРоль остатка Ala198 в стабильности и коферментной специфичности бактериальных формиатдегидрогеназAlekseevaA. A.АлексееваA. A.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comFedorchukV. V.ФедорчукВ. В.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comZarubinaS. A.ЗарубинаС. A.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comSadykhovE. G.СадыховE. Г.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comMatorinA. D.МаторинA. Д.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comSavinS. S.СавинС. С.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comTishkovV. I.ТишковВ. И.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comA.N. Bach Institute of BiochemistryИнститут биохимии им. А.Н. Баха РАНInnovations and High Technologies MSU LtdООО «Инновации и высокие технологии МГУ»M.V. Lomonosov Moscow State UniversityМосковский государственный университет им. М.В. Ломоносова1503201571VOL 7, NO1 (2015)ТОМ 7, №1 (2015)606917012020Copyright ©; 2015, Alekseeva A.A., Fedorchuk V.V., Zarubina S.A., Sadykhov E.G., Matorin A.D., Savin S.S., Tishkov V.I.Copyright ©; 2015, Алексеева A.A., Федорчук В.В., Зарубина С.A., Садыхов E.Г., Маторин A.Д., Савин С.С., Тишков В.И.2015Alekseeva A.A., Fedorchuk V.V., Zarubina S.A., Sadykhov E.G., Matorin A.D., Savin S.S., Tishkov V.I.Алексеева A.A., Федорчук В.В., Зарубина С.A., Садыхов E.Г., Маторин A.Д., Савин С.С., Тишков В.И.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10513

It has been shown by an X-ray structural analysis that the amino acid residues Ala198, which are located in the coenzyme-binding domain of NAD+-dependent formate dehydrogenases (EC 1.2.1.2., FDH) from bacteria Pseudomonas sp.101 and Moraxella sp. C-1 (PseFDH and MorFDH, respectively), have non-optimal values of the angles ψ and φ. These residues were replaced with Gly by site-directed mutagenesis. The mutants PseFDH A198G and MorFDH A198G were expressed in E.coli cells and obtained in active and soluble forms with more than 95% purity. The study of thermal inactivation kinetics showed that the mutation A198G results in a 2.5- fold increase in stability compared to one for the wild-type enzymes. Kinetic experiments indicate that A198G replacement reduces the K M NAD+ value from 60 to 35 and from 80 to 45 μM for PseFDH and MorFDH, respectively, while the K M HCOO- value remains practically unchanged. Amino acid replacement A198G was also added to the mutant PseFDH D221S with the coenzyme specificity changed from NAD + to NADP +. In this case, an increase in thermal stability was also observed, but the influence of the mutation on the kinetic parameters was opposite: KM increased from 190 to 280 μM and from 43 to 89 mM for NADP + and formate, respectively. According to the data obtained, inference could be drawn that earlier formate dehydrogenase from bacterium Pseudomonas sp. 101 was specific to NADP +, but not to NAD +.

Согласно данным рентгеноструктурного анализа, остаток Ala198, расположенный в коферментсвязывающем домене NAD+-зависимых формиатдегидрогеназ [КФ 1.2.1.2] (ФДГ) из бактерий Pseudomonas sp. 101 и Moraxella sp. C-1 (PseFDH и MorFDH соответственно), имеет неоптимальные значения углов ψ и φ. Методом направленного мутагенеза этот остаток был заменен на остаток Gly. Мутантные PseFDH A198G и MorFDH A198G экспрессировали в клетках Escherichia coli и получили в высокоочищенном (> 95% чистоты) виде. Исследование кинетики термоинактивации показало, что PseFDH A198G и MorFDH A198G в 2.5 раза более стабильны, чем соответствующие ферменты дикого типа. Анализ кинетических свойств свидетельствует, что введение замены A198G в PseFDH и MorFDH приводит к уменьшению величины Км по NAD+ с 60 до 35 и с 80 до 45 мкМ соответственно, в то время как величина Км по формиату остается неизменной. Замена A198G была введена также в мутантную PseFDH D221S, коферментная специфичность которой была изменена от NAD+ к NADP+. В этом случае также наблюдалось увеличение термостабильности, однако эффект на кинетические параметры был противоположным – константа Михаэлиса по NADP+ увеличилась с 190 до 280 мкМ, а по формиату возросла с 43 до 89 мМ. Полученные данные позволяют с высокой вероятностью предположить, что ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101 ранее была NADP+-, а не NAD+-зависимым ферментом.

site-directed mutagenesisthermal stabilitycoenzyme specificitykinetic parametersкинетические параметрыкоферментная специфичностьнаправленный мутагенезсубстратная специфичностьтермостабильностьформиатдегидрогеназаThis study was supported by the grant of a President of Russian Federation for State support of young Russian scientists (MK-2304.2014.4).Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых-кандидатов наук (МК-2304.2014.4).[1] Wierenga R.W., Hol W.G.J. // Nature 1983, V.302, №5911, P.842-844[2] Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Harutyunyan E.H., Wilson K.S. // J. Mol. Biol. 1994, V.236, №3, P.759-785[3] Filippova E.V., Polyakov K.M., Tikhonova T.V., Stekhanova T.N., Boiko K.M., Sadykhov E.G., Tishkov V.I., Popov I.O., V.O. I.O., Labrou I.O., N. I.O. // Crystallography Reports. 2006, V.51, №4, P.627-631[4] Shabalin I.G., Filippova E.V., Polyakov K.M., Sadykhov E.G., Safonova T.N., Tikhonova T.V., Tishkov V.I., Popov V.O. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2009, V.65, №12, P.1315-1325[5] Shabalin I.G., Polyakov K.M., Tishkov V.I., Popov V.O. // Acta Naturae. 2009, V.1, №3, P.89-93[6] Matorin A.D. // Mechanism of substrate and coenzyme specificity of bacterial formate dehydrogenase. // Ph.D. Thesis. M.V.Lomonosov Moscow State University, Moscow, 2000, 2000[7] Alekseeva A.A., Dolina I.A., Zarubina S.A., Matorin A.D., Sadykhov E.G., Savin S.S., Tishkov V.I. // Biochimie. 2015. submitted for publication. 2015[8] Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., Tishkov V.I. // FEBS Lett. 1999, V.445, №1, P.183-188[9] Rao S.T., Rossmann M.G. // J. Mol. Biol. 1973, V.76, №2, P.241-256[10] Lesk A.M. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1995, V.5, №6, P.775-783[11] Tishkov V.I., Popov V.O. // Biomol. Eng. 2006, V.23, №1, P.89-110[12] Cornish-Bowden A. // Fundamentals of Enzyme Kinetics. 4th Ed. Wiley-Blackwell, 2012. 2012[13] Serov A.E., Odintzeva E.R., Uporov I.V., Tishkov V.I. // Biochemistry (Moscow). 2005, V.70, №4, P.804-808[14] Tishkov V.I., Popov V.O. // Biochemistry (Moscow). 2004, V.69, №11, P.1252-1267[15] Hatrongjit R., Packdibamrung K. // Enz. Microbial Technol. 2010, V.46, №7, P.557-561[16] Gul-Karaguler N., Sessions R.B., Clarke A.R., Holbrook J.J. // Biotechnol. Lett. 2001, V.23, №4, P.283-287[17] Andreadeli A., Platis D., Tishkov V., Popov V., Labrou N.E. // FEBS J. 2008, V.275, №15, P.3859-3869[18] Serov A.E., Popova A.S., Fedorchuk V.V., Tishkov V.I. // Biochem. J. 2002, V.367, №3, P.841-847[19] Tishkov V.I., Galkin A.G., Egorov A.M. // Biochimie. 1989, V.71, №4, P.551-557[20] Serov A.E., Popova A.S., Tishkov V.I. // Dokl. Biochem. Biophys. 2002, V.382, №1-3, P.26-30