Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1049810.32607/20758251-2015-7-2-64-73Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleModified Method of rRNA Structure Analysis Reveals Novel Characteristics of Box C/D RNA AnaloguesМодифицированный метод анализа структуры рРНК позволил выявить новые свойства аналогов C/D-бокс-РНКFilippovaJu. A.ФилипповаЮ. A.
Russian Federation
filippova@niboch.nsc.ruStepanovG. A.СтепановГ. A.
Russian Federation
filippova@niboch.nsc.ruSemenovD. VСеменовД. В.
Russian Federation
filippova@niboch.nsc.ruKovalO. A.КовальO. A.
Russian Federation
filippova@niboch.nsc.ruKuliginaE. V.КулигинаE. В.
Russian Federation
filippova@niboch.nsc.ruRabinovI. V.РабиновИ. В.
Russian Federation
filippova@niboch.nsc.ruRichterV. A.РихтерВ. A.
Russian Federation
filippova@niboch.nsc.ruInstitute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of SciencesИнститут химической биологии и фундаментальной медицины СО РАНNovosibirsk State UniversityНовосибирский государственный университет1506201572VOL 7, NO2 (2015)ТОМ 7, №2 (2015)647317012020Copyright ©; 2015, Filippova J.A., Stepanov G.A., Semenov D.V., Koval O.A., Kuligina E.V., Rabinov I.V., Richter V.A.Copyright ©; 2015, Филиппова Ю.A., Степанов Г.A., Семенов Д.В., Коваль O.A., Кулигина E.В., Рабинов И.В., Рихтер В.A.2015Filippova J.A., Stepanov G.A., Semenov D.V., Koval O.A., Kuligina E.V., Rabinov I.V., Richter V.A.Филиппова Ю.A., Степанов Г.A., Семенов Д.В., Коваль O.A., Кулигина E.В., Рабинов И.В., Рихтер В.A.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10498

Ribosomal RNA (rRNA) maturation is a complex process that involves chemical modifications of the bases or sugar residues of specific nucleotides. One of the most abundant types of rRNA modifications, ribose 2’-O-methylation, is guided by ribonucleoprotein complexes containing small nucleolar box C/D RNAs. Since the majority of 2’-O-methylated nucleotides are located in the most conserved regions of rRNA that comprise functionally important centers of the ribosome, an alteration in a 2’-O-methylation profile can affect ribosome assembly and function. One of the key approaches for localization of 2’-O-methylated nucleotides in long RNAs is a method based on the termination of reverse transcription. The current study presents an adaptation of this method for the use of fluorescently labeled primers and analysis of termination products by capillary gel electrophoresis on an automated genetic analyzer. The developed approach allowed us to analyze the influence of the synthetic analogues of box C/D RNAs on post-transcriptional modifications of human 28S rRNA in MCF-7 cells. It has been established that the transfection of MCF-7 cells with a box C/D RNA analogue leads to an enhanced modification level of certain native sites of 2’-O-methylation in the target rRNA. The observed effect of synthetic RNAs on the 2’-O-methylation of rRNA in human cells demonstrates a path towards targeted regulation of rRNA post-transcriptional maturation. The described approach can be applied in the development of novel diagnostic methods for detecting diseases in humans.

Созревание рибосомных РНК (рРНК) представляет собой сложный процесс, в ходе которого отдельные нуклеотиды подвергаются химическим модификациям по азотистым основаниям или остатку рибозы. Одна из самых распространенных модификаций рРНК - 2’-O-метилирование нуклеотидов - осуществляется рибонуклеопротеидными комплексами, содержащими в своем составе малые ядрышковые C/D-бокс-РНК. Поскольку большая часть 2’-O-метилированных нуклеотидов расположена в наиболее консервативных участках рРНК, формирующих важнейшие функциональные центры рибосом, то изменения в профиле 2’-O-метилирования могут приводить к нарушениию сборки и функционирования рибосом. Один из основных методов выявления положений 2’-O-метилированных нуклеотидов в протяженных РНК - метод терминации обратной транскрипции. В настоящей работе этот метод адаптирован к использованию флуоресцентно меченных праймеров и анализу продуктов терминации капиллярным гель-электрофорезом на автоматическом генном анализаторе. С помощью разработанного подхода проанализировано действие синтетических аналогов C/D-бокс-РНК на посттранскрипционные модификации 28S рРНК человека в клетках линии MCF-7. Установлено, что трансфекция клеток MCF-7 аналогом C/D-бокс-РНК приводит к увеличению глубины модификации отдельных сайтов 2’-O-метилирования в рРНК-мишени. Наблюдаемый эффект воздействия синтетических РНК на 2’-O-метилирование нуклеотидов рРНК в клетках человека указывает на возможность направленной регуляции посттранскрипционного созревания рРНК. Представленный подход может найти применение в разработке методов выявления заболеваний человека.

small nucleolar box C/D RNAsRNA post-transcriptional modificationsRNA 2’-O-methylationreverse transcription terminationмалые ядрышковые C/D-бокс-РНКпосттранскрипционные модификации нуклеотидов РНК2’-O-метилирование РНКтерминация обратной транскрипцииThis work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (grants No. 13-04-01058 and 14-04-31468) and the Interdisciplinary Integration Project of SB RAS No. 84 (2012–2014).Работа поддержана РФФИ (гранты № 13-04-01058 и 14-04-31468) и Междисциплинарным интеграционным проектом СО РАН № 84 (2012–2014 гг.).[1] Lapeyre B. // Top. Curr. Genet. 2005, V.12, P.85-91[2] Baxter-Roshek J.L., Petrov A.N., Dinman J.D. // PLoS One. 2007, V.2, №1, P.e174[3] Piekna-Przybylska D., Decatur W.A., Fournier M.J. // Nucleic Acids Research 2008, V.36, P.D178-D183[4] Decatur W.A., Fournier M.J. // Trends Biochem. Sci. 2002, V.27, №7, P.344-351[5] Liang X.H., Liu Q., Fournier M.J. // Molecular Cell 2007, V.28, №6, P.965-977[6] Esguerra J., Warringer J., Blomberg A. // RNA. 2008, V.14, №4, P.649-656[7] Liang X.H., Liu Q., Fournier M.J. // RNA. 2009, V.15, №9, P.1716-1728[8] Song X., Nazar R.N. // FEBS Lett. 2002, V.523, №1-3, P.182-186[9] Kiss-Laszlo Z., Henry Y., Bachellerie J.P., Caizergues-Ferrer M., Kiss T. // Cell. 1996, V.85, №7, P.1077-1088[10] Makarova J.A., Kramerov D.A. // Molekulyarnaya Biologiya (Mosk.). 2007, V.41, №2, P.246-259[11] Reichow S.L., Hamma T., Ferre´-D’Amare´ A.R., Varani G. // Nucleic Acids Research 2007, V.35, №5, P.1452-1464[12] Su H., Xu T., Ganapathy S., Shadfan M., Long M., Huang T.H., Thompson I., Yuan Z.M. // Oncogene. 2014, V.33, №11, P.1348-1358[13] Marcel V., Ghayad S.E., Belin S., Therizols G., Morel A.P. // Cell. 2013, V.24, №3, P.318-330[14] Belin S., Beghin A., Solano-Gonzalez E., Bezin L., Brunet-Manquat S. // PLoS One. 2009, V.4, №9, P.e7147[15] Teittinen K.J., Laiho A., Uusimaki A., Pursiheimo J.P., Gyenesei A., Lohi O. // Cell. Oncol. (Dordr). 2013, V.36, №1, P.55-63[16] Montanaro L., Trere D., Derenzini M. // Am. J. Pathol. 2008, V.173, №2, P.301-310[17] Freed E.F., Bleichert F., Dutca L.M., Baserga S.J. // Mol. Biosyst. 2010, V.6, №3, P.481-493[18] Stepanov G.A., Semenov D.V., Kuligina E.V., Koval O.A., Rabinov I.V., Kit Y.Y., Richter V.A. // Acta Naturae. 2012, V.4, №1(12), P.34-43[19] Stepanov G.A., Semenov D.V., Savelyeva A.V., Koval O.A., Kuligina E.V., Rabinov I.V., Richter V.A. // Biomed. Res. Int. ID:656158 2013[20] Maden B.E., Corbett M.E., Heeney P.A., Pugh K., Ajuh P.M. // Biochimie. 1995, V.77, №1-2, P.22-29[21] Maden B.E. // Methods. 2001, V.25, №3, P.374-382[22] Cavaille J., Nicoloso M., Bachellerie J.P. // Nature 1996, V.383, №6602, P.732-735[23] Liu B., Fournier M.J. // RNA. 2004, V.10, №7, P.1130-1141[24] Graifer D., Molotkov M., Styazhkina V., Demeshkina N., Bulygin K., Eremina A., Ivanov A., Laletina E., Venyaminova A., Karpova G. // Nucleic Acids Research 2004, V.32, №11, P.3282-3293[25] Bulygin K., Malygin A., Hountondji C., Graifer D., Karpova G. // Biochimie. 2013, V.95, №2, P.195-203[26] Lestrade L., Weber M.J. // Nucleic Acids Research 2006, V.34, P.D158-D162[27] Liu B., Ni J., Fournier M. J. // Methods. 2001, V.23, №3, P.276-286[28] Liu B., Liang X.H., Piekna-Przybylska D., Liu Q., Fournier M.J. // RNA Biol. 2008, V.5, №4, P.249-254[29] Rodriguez-Galan O., Garcia-Gomez J.J., de la Cruz J. // Biochim. Biophys. Acta. 2013, V.1829, №8, P.775-790[30] Williams G.T., Farzaneh F. // Nat. Rev. Cancer. 2012, V.12, №2, P.84-88[31] Mannoor K., Liao J., Jiang F. // Biochim. Biophys. Acta. 2012, V.1826, №1, P.121-128[32] Qu G., van Nues R.W., Watkins N.J., Maxwell E.S. // Mol. Cell. Biol. 2011, V.31, №2, P.365-374