Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1047810.32607/20758251-2015-7-3-55-64Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleAdditivity of the Stabilization Effect of Single Amino Acid Substitutions in Triple Mutants of Recombinant Formate Dehydrogenase from the Soybean Glycine maxАддитивность стабилизирующего эффекта единичных аминокислотных замен в тройных мутантах рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои Glycine maxAlekseevaA. A.АлексееваA. A.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comKargovI. S.КарговИ. С.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comKleimenovS. Yu.КлейменовС. Ю.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comSavinS. S.СавинС. С.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comTishkovV I.ТишковВ. И.
Russian Federation
vitishkov@gmail.comA.N.Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of SciencesИнститут биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАНООО «Инновации и высокие технологии МГУ»Innovations and High Technologies MSU LtdM.V. Lomonosov Moscow State UniversityООО «Инновации и высокие технологии МГУ»Московский государственный университет им. М.В. ЛомоносоваA.N.Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of SciencesN.K. Koltsov Institute of Developmental Biology of the Russian Academy of SciencesИнститут биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАНИнститут биологии развития им. Н.К. Кольцова РАНA.N.Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of SciencesInnovations and High Technologies MSU LtdИнститут биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАНМосковский государственный университет им. М.В. Ломоносова1509201573VOL 7, NO3 (2015)ТОМ 7, №3 (2015)556417012020Copyright ©; 2015, Alekseeva A.A., Kargov I.S., Kleimenov S.Y., Savin S.S., Tishkov V.I.Copyright ©; 2015, Алексеева A.A., Каргов И.С., Клейменов С.Ю., Савин С.С., Тишков В.И.2015Alekseeva A.A., Kargov I.S., Kleimenov S.Y., Savin S.S., Tishkov V.I.Алексеева A.A., Каргов И.С., Клейменов С.Ю., Савин С.С., Тишков В.И.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10478

Recently, we demonstrated that the amino acid substitutions Ala267Met and Ala267Met/Ile272Val (Alekseeva et al., Biochemistry, 2012), Phe290Asp, Phe290Asn and Phe290Ser (Alekseeva et al., Prot. Eng. Des. Select, 2012) in recombinant formate dehydrogenase from soya Glycine max (SoyFDH) lead to a significant (up to 30-100 times) increase in the thermal stability of the enzyme. The substitutions Phe290Asp, Phe290Asn and Phe290Ser were introduced into double mutant SoyFDH Ala267Met/Ile272Val by site-directed mutagenesis. Combinations of three substitutions did not lead to a noticeable change in the catalytic properties of the mutant enzymes. The stability of the resultant triple mutants was studied through thermal inactivation kinetics and differential scanning calorimetry. The thermal stability of the new mutant SoyFDHs was shown to be much higher than that of their precursors. The stability of the best mutant SoyFDH Ala267Met/Ile272Val/Phe290Asp turned out to be comparable to that of the most stable wild-type formate dehydrogenases from other sources. The results obtained with both methods indicate a great synergistic contribution of individual amino acid substitutions to the common stabilization effect.

Ранее нами было показано, что аминокислотные замены в рекомбинантной формиатдегидрогеназе сои Glycine max (SoyFDH) Ala267Met и Ala267Met/Ile272Val (Алексеева и соавт., Биохимия, 2012), Phe290Asp, Phe290Asn и Phe290Ser (Alekseeva et al., Prot. Eng. Des. Select, 2012) приводят к значительному (до 30-100 раз) увеличению термостабильности фермента. Методом направленного мутагенеза в двойной мутант SoyFDH Ala267Met/Ile272Val были введены замены Phe290Asp, Phe290Asn и Phe290Ser. Объединение трех замен не привело к заметному изменению каталитических свойств мутантного фермента. Стабильность полученных тройных мутантов изучали по кинетике термоинактивации и с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Показано, что термостабильность новых мутантных SoyFDH намного выше, чем у их предшественников. По стабильности лучшая форма SoyFDH - Ala267Met/Ile272Val/Phe290Asp - оказалась сравнимой с наиболее стабильными формиатдегидрогеназами дикого типа из других источников. Результаты, полученные обоими методами, свидетельствуют о большом синергическом вкладе отдельных аминокислотных замен в стабилизацию фермента.

protein engineeringmulti-point mutantsrational designstabilizationstabilitysynergistic effectformate dehydrogenaseGlycine maxбелковая инженериямноготочечные мутантырациональный дизайнстабилизациястабильностьсинергический эффектформиатдегидрогеназаGlycine maxThis work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (grants No. 14-04-01625-a and 14-04-01665-a).Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 14-04-01625-a и 14-04-01665-a).[1] Tishkov V.I., Popov V.O. // Biochemistry(Moscow). 2004, V.69, №11, P.1252-1267[2] Tishkov V.I., Popov V.O. // Biomol. Eng. 2006, V.23, №1, P.89-110[3] Alekseeva A.A., Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae. 2011, V.3, №4(11), P.38-54[4] Alekseeva A.A., Savin S.S., Kleimenov S.Yu., Uporov I.V., Pometun E.V., Tishkov V.I. // Biochemistry(Moscow) 2012, V.77, №10, P.1199-1209[5] Alekseeva A.A., Serenko A.A., Kargov I.S., Kleimenov S.Y., Savin S.S., Tishkov V.I. // Protein Eng. Des. Sel. 2012, V.25, №11, P.781-788[6] Kargov I.S., Kleimenov S.Y., Savin S.S., Tishkov V.I., Alekseeva A.A. // Protein Eng. Des. Sel. 2015, V.28, №6, P.171-178[7] Romanova E.G., Alekseeva A.A., Pometun E.V., Tishkov V.I. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2010, V.65, №3, P.127-130[8] Sadykhov I.O., E.G. I.O., Serov I.O., A.E. I.O., Yasnyi I.O., I.E. I.O., Voinova I.O., N.S I.O., Alekseeva I.O., A.A. I.O., Petrov I.O., A.S. I.O., Tishkov I.O., V.I. I.O. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2006, V.47, №1, P.20-24[9] Andreadeli A., Flemetakis E., Axarli I., Dimou M., Udvardi M. K., Katinakis P., Labrou N.E. // Biochim. Biophys. Acta. 2009, V.1794, P.976-984[10] Slusarczyk H., Felber S., Kula M.R., Pohl M. // Eur. J. Biochem. 2000, V.267, P.1280-1289[11] Felber S. // Optimierung der NAD+-abhängigen Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii für den Einsatz in der Biokatalyse. // Ph.D. Thesis. Heinrich-Heine University of Duesseldorf, 2001. 2001, url http://diss.ub.uni-duesseldorf.de/ebib/diss/file?dissid=78[12] Cornish-Bowden A. // Fundamentals of Enzyme Kinetics. 4th Ed. Wiley-Blackwell, 2012. 510 p. 2012[13] Tishkov V.I., Uglanova S.V., Fedorchuk V.V., Savin S.S. // Acta Naturae. 2010. V. 2. №. 2(5). 2010, V.2, №2(5), P.82-87[14] Serov A.E., Tishkov V.I. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2006, V.47, №2, P.1-5[15] Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., Tishkov V.I. // FEBS Lett. 1999, V.445, №1, P.183-188[16] Serov A.E., Odintseva E.R., Uporov I.V., Tishkov V.I. // Biochemistry (Moscow). 2005, V.70, №4, P.804-808[17] Sadykhov E.G., Serov A.E., Voynova N.S., Uglanova S.V., Petrov A.S., Alekseeva A.A., Kleimenov S.Yu., Popov V.O., Tishkov V.I. // Appl. Biochem. Microbiol. 2006, V.42, №3, P.236-240