Putative open reading frames of MD-endonucleases have been identified in Enterobacteria genomes as a result of the search for amino acid sequences homologous to MD-endonuclease BisI. A highly conserved DNA primary structure of these open reading frames in different genera of Enterobacteria (Escherichia, Klebsiella and Cronobacter) has allowed researchers to create primers for PCR screening, which was carried out on Enterobacteria DNA collected from natural sources. The DNA fragment, about 440 bp in length, was amplified by use of the genomic DNA of a wild E.coli LM N17 strain as a template and was inserted into the pMTL22 vector. Endonuclease activity was detected in an E.coli ER 2267 strain transformed with the obtained construction. A new enzyme named ElmI was purified by chromatographic techniques from the recombinant strain biomass. It was discovered that similarly to BisI this enzyme specifically cleaves the methylated DNA sequence 5’-GCNGC- 3’ before the central nucleotide “N” if this sequence contains two 5-methylcytosines. However, unlike BisI, ElmI more efficiently cleaves this sequence if more than two cytosine residues are methylated.
В результате поиска аминокислотных последовательностей, гомологичных последовательности MD-эндонуклеазы BisI, в геномах энтеробактерий выявлены предполагаемые открытые рамки считывания MD-эндонуклеаз. Высокая консервативность нуклеотидных последовательностей данных рамок у энтеробактерий разных родов (Escherichia, Klebsiella и Cronobacter) позволила создать праймеры для проведения ПЦР-скрининга на ДНК энтеробактерий, собранных из природных источников. С использованием геномной ДНК E. coli LM N17 в качестве матрицы амплифицирован и встроен в вектор pMTL22 фрагмент ДНК длиной около 440 п.н. В штамме E. coli ER2267, трансформированном полученной конструкцией, выявлена эндонуклеазная активность. Из биомассы данного штамма хроматографическими методами получен препарат нового фермента ElmI. Оказалось, что ElmI подобно BisI специфично расщепляет метилированную последовательность 5’-GCNGC-3’ перед центральным нуклеотидом «N» при условии, что она содержит два остатка 5-метилцитозина. Однако, в отличие от BisI, ElmI с большей эффективностью расщепляет эту последовательность при наличии в ней более двух метилированных остатков цитозина.