Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1042210.32607/20758251-2016-8-4-82-90Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleA Cascade of Thermophilic Enzymes As an Approach to the Synthesis of Modified NucleotidesКаскад термофильных ферментов как инструмент создания модифицированных нуклеотидовEsipovR. S.ЕсиповР. С.
Russian Federation
esipov@mx.ibch.ruAbramchikYu. A.АбрамчикЮ. A.
Russian Federation
esipov@mx.ibch.ruFateevI. V.ФатеевИ. В.
Russian Federation
esipov@mx.ibch.ruKonstantinovaI. D.КонстантиноваИ. Д.
Russian Federation
esipov@mx.ibch.ruKostrominaM. A.КостроминаM. A.
Russian Federation
esipov@mx.ibch.ruMuravyovaT. I.МуравьеваT. И.
Russian Federation
esipov@mx.ibch.ruArtemovaK. G.АртемоваK. Г.
Russian Federation
esipov@mx.ibch.ruMiroshnikovA. I.МирошниковA. И.
Russian Federation
esipov@mx.ibch.ruShemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic ChemistryИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН1512201684VOL 8, NO4 (2016)ТОМ 8, №4 (2016)829017012020Copyright ©; 2016, Esipov R.S., Abramchik Y.A., Fateev I.V., Konstantinova I.D., Kostromina M.A., Muravyova T.I., Artemova K.G., Miroshnikov A.I.Copyright ©; 2016, Есипов Р.С., Абрамчик Ю.A., Фатеев И.В., Константинова И.Д., Костромина M.A., Муравьева T.И., Артемова K.Г., Мирошников A.И.2016Esipov R.S., Abramchik Y.A., Fateev I.V., Konstantinova I.D., Kostromina M.A., Muravyova T.I., Artemova K.G., Miroshnikov A.I.Есипов Р.С., Абрамчик Ю.A., Фатеев И.В., Константинова И.Д., Костромина M.A., Муравьева T.И., Артемова K.Г., Мирошников A.И.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10422

We propose a new approach for the synthesis of biologically important nucleotides which includes a multi-enzymatic cascade conversion of D-pentoses into purine nucleotides. The approach exploits nucleic acid exchange enzymes from thermophilic microorganisms: ribokinase, phosphoribosylpyrophosphate synthetase, and adenine phosphoribosyltransferase. We cloned the ribokinase gene from Thermus sp. 2.9, as well as two different genes of phosphoribosylpyrophosphate synthetase (PRPP-synthetase) and the adenine phosphoribosyltransferase (APR-transferase) gene from Thermus thermophilus HB27 into expression vectors, generated high-yield E. coli producer strains, developed methods for the purification of the enzymes, and investigated enzyme substrate specificity. The enzymes were used for the conversion of D-pentoses into 5-phosphates that were further converted into 5-phospho-α-D-pentofuranose 1-pyrophosphates by means of ribokinase and PRPP-synthetases. Target nucleotides were obtained through the condensation of the pyrophosphates with adenine and its derivatives in a reaction catalyzed by APR-transferase. 2-Chloro- and 2-fluoroadenosine monophosphates were synthesized from D-ribose and appropriate heterobases in one pot using a system of thermophilic enzymes in the presence of ATP, ribokinase, PRPP-synthetase, and APR-transferase.

Предложена новая стратегия биосинтеза биологически важных нуклеотидов, заключающаяся в мультиферментативном каскадном превращении D-пентоз в пуриновые нуклеотиды c использованием ферментов нуклеинового обмена термофильных микроорганизмов (рибокиназы, фосфорибозилпиро- фосфатсинтетазы и аденин-фосфорибозилтрансферазы). Клонирован ген рибокиназы термофильного микроорганизма Thermus sp. 2.9, два разных гена фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP-cинтетазы) и ген аденин-фосфорибозилтрансферазы (APR-трансферазы) из Thermus thermophilus HB27. Получены высокопродуктивные штаммы-продуценты Escherichia coli, разработаны методы выделения упомянутых ферментов, изучена их субстратная специфичность. Показана возможность использования этих фер- ментов для превращения D-пентоз в 5-фосфаты, а затем под действием рибокиназы и PRPP-cинтетаз - в 5-фосфо-α-D-пентофуранозо-1-пирофосфаты, конденсация которых с аденином и рядом его структурных аналогов, катализируемая APR-трансферазой, приводила к получению искомых нуклеотидов. На примере 2-хлор(фтор)-аденозинмонофосфата (2Cl-AMP и 2F-AMP) показана возможность использования системы термофильных ферментов в одном реакционном объеме для получения биологически активных нуклеотидов из D-рибозы и соответствующих гетерооснований в присутствии ATP, рибокиназы, PRPP-cинтетазы и APR-трансферазы.

enzymatic nucleotide synthesisribokinasephosphoribosylpyrophosphate synthetaseadenine phosphoribosyltransferasethermophilic microorganismssubstrate propertiesаденин-фосфорибозилтрансфераза термофильных микроорганизмоврибокиназасубстратные свойстваферментативный синтез нуклеотидовфосфорибозилпирофосфатсинтетазаThe authors express gratitude the Russian Science Foundation (RSF project No. 14-50-00131) for the financial support of the work.Авторы выражают благодарность Российскому научному фонду (РНФ проект № 14-50-00131) за финансовую поддержку работы.[1] Nelson D.L., Cox M.M. // Nucleotides and Nucleic Acids. // Nucleotides and Nucleic Acids. Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd ed. N.Y.: Worth Publ., 2000. 1255 p. 2000[2] Bruce A. // Molecular Biology of the Cell // Molecular Biology of the Cell. N. Y.: Garland Publ., 2000. 974 p. 2000[3] Schärer O.D. // Angew Chem. Int. Ed. Engl. 2003, V.42, №26, P.2946-2974[4] Jordheim L.P., Durantel D., Zoulim F., Dumontel C. // Nat. Rev. Drug Discov. 2013, V.12, №6, P.447-464[5] De Clercq E. // Rev. Med. Virol. 2009, V.19, №5, P.287-299[6] Diop-Frimpong B., Prakash T.P., Rajeev K.G., Manoharan M., Egli M. // Nucleic Acids Research 2005, V.33, №16, P.5297-5307[7] Famulok M., Hartig J.S., Mayer G. // J. Chem. Rev. 2007, V.107, №9, P.3715-3743[8] Peng C.G., Damha M.J. // Nucleic Acids Research 2007, V.35, №15, P.4977-4988[9] Golden J., Motea E., Zhang X., Choi J.S., Feng Y., Xu Y., Lee I., Berdis A.J. // ACS Chem. Biol. 2013, V.8, №11, P.2452-2465[10] Lakshman M.K. // Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine. // Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine. Weinheim: Wiley-VCH, 2008. 684 c. 2008[11] De Clercq E. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2011, V.51, P.1-24[12] Cen Y., Sauve A.A. // Nucleos. Nucleotides. Nucleic Acids 2010, V.29, №2, P.113-122[13] Mikhailopulo I.A., Miroshnikov A.I. // Mendeleev Commun. 2011, V.21, P.57-68[14] Vineyard D., Zhang X., Donnelly A., Lee I., Berdis A.J. // Org. Biomol. Chem. 2007, V.5, №22, P.3623-3630[15] Stein C.A., Cheng Y.C. // Science. 1993, V.261, №5124, P.1004-1012[16] Motea E.A., Lee I., Berdis A.J. // Nucleic Acids Research 2012, V.40, №5, P.2357-2367[17] Mikhailopulo I.A. // Curr. Org. Chem. 2007, V.11, №4, P.317-335[18] Wintersberger E. // Biochem. Soc. Trans. 1997, V.25, №1, P.303-308[19] Tesmer J.J., Klem T.J., Deras M.L., Davisson V.J., Smith J.L. // Nat. Struct. Biol. 1996, V.3, №1, P.74-86[20] Kim M.J., Whitesides G.M. // Appl. Biochem. Biotech. 1987, V.1, №6, P.95-108[21] Scism R.A., Stec D.F., Bachmann B.O. // Org. Lett. 2007, V.9, №21, P.4179-4182[22] Scism R.A., Bachmann B.O. // ChemBioChem. 2010, V.11, №1, P.67-70[23] Nagy M., Ribet A.M. // Eur. J. Biochem. 1977, V.77, №1, P.77-85[24] Lee D., Moffatt B.A. // Physiologia Plantarum. 1993, V.87, №4, P.483-492[25] Zhou X., Mikhailopulo I.A., Cruz-Bournazou N., Neubauer P. // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2015, V.115, P.119-127[26] Zhou X., Szeker K., Jiao L.Y., Oestreich M., Mikhailopulo I.A., Neubauer P. // Adv. Synthesis & Catalysis. 2015, V.357, №6, P.1237-1244[27] Taran S.A., Verevkina K.N., Feofanov S.A., Miroshnikov A.I. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2009, V.35, №6, P.739-745[28] Laemmli U.K. // Nature 1970, V.227, №5259, P.680-685[29] Bradford M.M. // Anal. Biochem. 1976, V.72, P.248-254[30] Park J., van Koeverden P., Singh B., Gupta R.S. // FEBS Lett. 2007, V.581, №17, P.3211-3216[31] Kadziola A., Jepsen C.H., Johansson E., McGuire J., Larsen S., Hove-Jensen B. // J. Mol. Biol. 2005, V.354, №4, P.815-828