Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1042110.32607/20758251-2016-8-3-77-87Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleBiosynthesis of poly(3-hydroxybutyrateco-3-hydroxy-4-methylvalerate) by Strain Azotobacter chroococcum 7BБиосинтез сополимера поли-3-оксибутират-со-3-окси-4-метилвалерата штаммом Azotobacter chroococcum 7БBonartsevA. P.БонарцевA. П.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruBonartsevaG. A.БонарцеваГ. A.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruMyshkinaV. L.МышкинаВ. Л.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruVoinovaV. V.ВоиноваВ. В.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruMahinaT. K.МахинаT. K.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruZharkovaI. I.ЖарковаИ. И.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruYakovlevS. G.ЯковлевС. Г.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruZernovA. L.ЗерновA. Л.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruIvanovaE. V.ИвановаE. В.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruAkoulinaE. A.АкулинаE. A.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruKuznetsovaE. S.КузнецоваE. С.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruZhuikovV. A.ЖуйковВ. A.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruAlekseevaS. G.АлексееваС. Г.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruPodgorskiiV. V.ПодгорскийВ. В.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruBessonovI. V.БессоновИ. В.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruKopitsynaM. N.КопицынаM. Н.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruMorozovA. S.МорозовA. С.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruMilanovskiyE. Y.МилановскийE. Ю.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruTyugayZ. N.ТюгайЗ. Н.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruBykovaG. S.БыковаГ. С.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruKirpichnikovM. P.КирпичниковM. П.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruShaitanK. V.ШайтанK. В.
Russian Federation
ant_bonar@mail.ruM.V. Lomonosov Moscow State UniversityМосковский государственный университет им. М.В. ЛомоносоваA.N. Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of SciencesФедеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАНJSC «Institute of Plastics»ОАО «Институт пластмасс»Federal Medical Biological AgencyФедеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентстваBauman Moscow State Technical UniversityМосковский государственный технический университет им. Н.Э. Баумана1509201683VOL 8, NO3 (2016)ТОМ 8, №3 (2016)778717012020Copyright ©; 2016, Bonartsev A.P., Bonartseva G.A., Myshkina V.L., Voinova V.V., Mahina T.K., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Zernov A.L., Ivanova E.V., Akoulina E.A., Kuznetsova E.S., Zhuikov V.A., Alekseeva S.G., Podgorskii V.V., Bessonov I.V., Kopitsyna M.N., Morozov A.S., Milanovskiy E.Y., Tyugay Z.N., Bykova G.S., Kirpichnikov M.P., Shaitan K.V.Copyright ©; 2016, Бонарцев A.П., Бонарцева Г.A., Мышкина В.Л., Воинова В.В., Махина T.K., Жаркова И.И., Яковлев С.Г., Зернов A.Л., Иванова E.В., Акулина E.A., Кузнецова E.С., Жуйков В.A., Алексеева С.Г., Подгорский В.В., Бессонов И.В., Копицына M.Н., Морозов A.С., Милановский E.Ю., Тюгай З.Н., Быкова Г.С., Кирпичников M.П., Шайтан K.В.2016Bonartsev A.P., Bonartseva G.A., Myshkina V.L., Voinova V.V., Mahina T.K., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Zernov A.L., Ivanova E.V., Akoulina E.A., Kuznetsova E.S., Zhuikov V.A., Alekseeva S.G., Podgorskii V.V., Bessonov I.V., Kopitsyna M.N., Morozov A.S., Milanovskiy E.Y., Tyugay Z.N., Bykova G.S., Kirpichnikov M.P., Shaitan K.V.Бонарцев A.П., Бонарцева Г.A., Мышкина В.Л., Воинова В.В., Махина T.K., Жаркова И.И., Яковлев С.Г., Зернов A.Л., Иванова E.В., Акулина E.A., Кузнецова E.С., Жуйков В.A., Алексеева С.Г., Подгорский В.В., Бессонов И.В., Копицына M.Н., Морозов A.С., Милановский E.Ю., Тюгай З.Н., Быкова Г.С., Кирпичников M.П., Шайтан K.В.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10421

Production of novel polyhydroxyalkanoates (PHAs), biodegradable polymers for biomedical applications, and biomaterials based on them is a promising trend in modern bioengineering. We studied the ability of an effective strain-producer Azotobacter chroococcum 7B to synthesize not only poly(3-hydroxybutyrate) homopolymer (PHB) and its main copolymer poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV), but also a novel copolymer, poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxy-4-methylvalerate) (PHB4MV). For the biosynthesis of PHB copolymers, we used carboxylic acids as additional carbon sources and monomer precursors in the chain of synthesized copolymers. The main parameters of these polymers’ biosynthesis were determined: strain-producer biomass yield, polymer yield, molecular weight and monomer composition of the synthesized polymers, as well as the morphology of A.repair rolex replica chroococcum 7B bacterial cells. The physico-chemical properties of the polymers were studied using nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), differential scanning calorimetry (DSC), contact angle test, and other methods. In vitro biocompatibility of the obtained polymers was investigated using stromal cells isolated from the bone marrow of rats with the XTT cell viability test. The synthesis of the novel copolymer PHB4MV and its chemical composition were demonstrated by NMR spectroscopy: the addition of 4-methylvaleric acid to the culture medium resulted in incorporation of 3-hydroxy-4-methylvalerate (3H4MV) monomers into the PHB polymer chain (0.6 mol%). Despite the low molar content of 3H4MV in the obtained copolymer, irolex replica deep seats physico-chemical properties were significantly different from those of the PHB homopolymer: it has lower crystallinity and a higher contact angle, i.e. the physico-chemical properties of the PHB4MV copolymer containing only 0.6 mol% of 3H4MV corresponded to a PHBV copolymer with a molar content ranging from 2.5% to 7.8%. In vitro biocompatibility of the obtained PHB4MV copolymer, measured in the XTT test,rolex replica deep sea was not statistically different from the cell growth of PHB and PHBV polymers, rolex datejust real or fake which make its use possible in biomedical research and development.

Получение новых полиоксиалканоатов (ПОА) - биоразлагаемых полимеров биомедицинского на- значения и биоматериалов на их основе - перспективное направление современной биоинженерии. Изучена способность эффективного штамма-продуцента Azotobacter chroococcum 7Б синтезировать не только гомополимер поли-3-оксибутирата (ПОБ) и его основной сополимер поли-3-оксибутират-со-3-оксивалерат (ПОБВ), но и новый сополимер поли-3-оксибутират-со-3-окси-4-метилвалерат (ПОБ4МВ). Для биосинтеза сополимеров ПОБ мы использовали карбоновые кислоты в качестве дополнительных источников углерода и предшественников мономеров в цепи синтезируемых сополимеров. Определены основные параметры биосинтеза полимеров: урожай биомассы штамма-продуцента, продукция полимера, молекулярная масса и мономерный состав синтезируемых полимеров, а также морфология клеток A. chroococcum 7Б. Физико-химические свойства полученных полимеров определены с использованием спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), дифференциально-сканирующей калориметрии (ДСК), измерения контактного угла смачивания и др. Рост клеток на полученных полимерах in vitro оценен с использованием стромальных клеток (СК), выделенных из костного мозга крыс, и теста анализа жизнеспособности клеток ХТТ. Синтез нового сополимера ПОБ4МВ показан путем определения его химического состава методом спектроскопии ЯМР - добавление в культуральную среду 4-метилвалериановой кислоты приводило к включению в полимерную цепь ПОБ мономеров 3-окси-4-метилвалерата (3О4МВ) (0.6 мол. %). Несмотря на малое молярное содержание 3О4МВ в составе сополимера, его физико-химические свойства значительно отличались от свойств гомополимера ПОБ: имел сниженную степень кристалличности и повышенный контактный угол смачивания, т.е. по своим физико-химическим свойствам сополимер ПОБ4МВ с содержанием 3О4МВ всего 0.6 мол. % соответствовал сополимеру ПОБВ с молярным содержанием от 2.5 до 7.8%. Рост СК, определенный по тесту ХТТ, на полученном сополимере ПОБ4МВ in vitro не отличался статистически от их роста на полимерах ПОБ и ПОБВ, что позволяет использовать его в биомедицинских разработках и исследованиях.

Azotobacter chroococcum 7Bpoly(3-hydroxybutyrate)poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxy-4-methylvalerate)biosynthesiscrystallinitybiocompatibilitybone marrow stromal cellsAzotobacter chroococcum 7Ббиосинтезбиосовместимостькристалличностьполи-3-оксибутиратполи-3-оксибутират-со-3-окси-4-метилвалератстромальные клетки костного мозгаThis work was supported by a RFBR ofi_m grant, project No. 15-29-04856.Работа поддержана грантом РФФИ офи-м, проект № 15-29-04856.[1] Birmingham Jenkins M. // Biomedical polymers // Biomedical polymers Ed. Jenkins M. Birmingham, UK: University of Birmingham, 2007. 203 p. 2007[2] Shtilman M.I. // Polymer implants // Polymeric biomaterials. Part 1. Polymer implants. VSP: Leiden, Netherlands, 2003. 294 p. 2003[3] Moisenovich M.M., Pustovalova O., Shackelford J., Vasiljeva T.V., Druzhinina T.V., Kamenchuk Y.A., Guzeev V.V., Sokolova O.S., Bogush V.G., Debabov V.G. // Biomaterials. 2012, V.33, №15, P.3887-3898[4] Satyam A., Kumar P., Fan X., Gorelov A., Rochev Y., Joshi L., Peinado H., Lyden D., Thomas B., Rodriguez B. // Advanced Materials. 2014, V.26, №19, P.3024-3034[5] Miroiu F.M., Stefan N., Visan A.I., Nita C., Luculescu C.R., Rasoga O., Socol M., Zgura I., Cristescu R., Craciun D. // Appl. Surface Sci. 2015, V.355, P.1123-1131[6] Baradaran-Rafii A., Biazar E., Heidari-Keshel S. // ASAIO J. 2015, V.61, №5, P.605-612[7] Bondar O.V., Saifullina D.V., Shakhmaeva I.I., Mavlyutova I.I., Abdullin T.I. // Acta Naturae. 2012, V.4, №1, P.78-81[8] Ulasov A.V., Khramtsov Y.V., Trusov G.A., Rosenkranz A.A., Sverdlov E.D., Sobolev A.S. // Mol. Therapy. 2011, V.19, №1, P.103-112[9] Kolotova E.S., Egorova S.G., Ramonova A.A., Bogorodski S.E., Popov V.K., Agapov I.I., Kirpichnikov M.P. // Acta Naturae. 2012, V.4, №1, P.101-106[10] Agrawal C.M., Athanasiou K.A. // J. Biomed. Mater. Res. 1997, V.38, P.105-114[11] Stevanovic M., Pavlovic V., Petkovic J., Filipic M., Uskokovic D. // Express Polymer. Lett. 2011, V.5, №11, P.996-1008[52] Kireev V.V. // High molecular weight compounds // Kireev V.V., High molecular weight compounds. Moscow: Vysshaya Schkola, 1992. 512 p. 1992[13] Volova T., Shishatskaya E., Mogilnaya O., Sevastianov V., Efremov S. // Biochem. Engin. J. 2003, V.16, №2, P.125-133[14] Sevastianov V.I., Perova N.V., Shishatskaya E.I., Kalacheva G.S., Volova T.G. // J. Biomat. Sci. Polymer Ed. 2003, V.14, №10, P.1029-1042[15] Bonartsev A.P., Bonartseva G.A., Shaitan K.V., Kiprichnikov M.P. // Biomed. Khimiya. 2011, V.57, №4, P.374-391[16] Singh M., Kumar P., Ray S., Kalia V.C. // Ind. J. Microbiol. 2015, V.55, №3, P.235-249[17] Shtukenberg A.G., Punin Y.O., Gunn E., Kahr B. // Chem. Rev. 2012, V.112, №3, P.1805-1838[18] Chardron S., Bruzaud S., Lignot B., Elain A., Sire O. // Polymer Testing. 2010, V.29, №8, P.966-971[19] Bonartsev A.P., Boskhomodgiev A.P., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A., Rebrov A.V., Makhina T.K., Myshkina V.L., Yakovlev S.A., Filatova E.A., Ivanov E.A. // Mol. Crystals Liquid Crystals. 2012, V.556, №1, P.288-300[20] Engelberg I., Kohn J. // Biomater. 1991, V.12, P.292-304[21] Prudskova T.N., Kirillovich V.I., Zakovryashina N.A., Erimilina N.I., Andreeva T.I., Bonartseva G.A., Bonartsev A.P., Iordanskii A.L., Makhina T.K., Myshkina V.L., Popov V.O. // RF Patent for invention № 2333962. 17.10.2006. 2006, 2333962[22] Pearce R.P., Marchessault R.H. // Macromol. 1994, V.27, P.3869-3874[23] Pettinari M.J., Vazquez G.J., Silberschmidt D., Rehm B., Steinbüchel A., Mendez B.S. // Appl. Environ. Microbiol. 2001, V.67, №11, P.5331-5334[24] Lau N.S., Tsuge T., Sudesh K. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, V.89, №5, P.1599-1609[25] Saika A., Watanabe Y., Sudesh K., Tsuge T. // J. Biosci. Bioeng. 2014, V.117, №6, P.670-675[26] Ling S.C., Tsuge T., Sudesh K. // J. Appl. Microbiol. 2011, V.111, №3, P.559-571[27] Tanadchangsaeng N., Tsuge T., Abe H. // Biomacromolecules. 2010, V.11, №6, P.1615-1622[28] Myshkina V.L., Nikolaeva D.A., Makhina T.K., Bonartsev A.P., Bonartseva G.A. // Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2008, V.44, №5, P.533-538[29] Myshkina V.L., Ivanov E.A., Nikolaeva D.A., Makhina T.K., Bonartsev A.P., Filatova E.V., Ruzhitskii A.O., Bonartseva G.A. // Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2010, V.46, №3, P.1-8[30] Bonartsev A.P., Yakovlev S.G., Zharkova I.I., Boskhomdzhiev A.P., Bagrov D.V., Myshkina V.L., Makhina T.K., Kharitonova E.P., Samsonova O.V., Voinova V.V. // BMC Biochem. 2013, V.14, P.12[31] Bonartsev A.P., Yakovlev S.G., Boskhomdzhiev A.P., Zharkova I.I., Bagrov D.V., Myshkina V.L., Mahina T.K., Charitonova E.P., Samsonova O.V., Zernov A.L. // PLoS One 2013, V.8, №2, e57200[32] Savenkova L., Gercberga Z., Bibers I., Kalnin M. // Proc. Biochem. 2000, V.36, №5, P.445-450[33] Zheng Z., Bei F.F., Tian H.L., Chen G.Q. // Biomaterials. 2005, V.26, №17, P.3537-3548[34] Barham P.J., Keller A., Otun E.L., Holmes P.A. // J. Materials Sci. 1984, V.19, №9, P.2781-2794[35] Maniatopoulos C., Sodek J., Melcher A.H. // Cell Tissue Res. 1998, V.254, №2, P.317-330[36] Sutherland M.W., Learmonth B.A. // Free Rad. Res. 1997, V.27, №3, P.283-289[37] Senior P.J., Dawes E.A. // Biochem. J. 1973, V.134, P.225-238[38] Madison L.L., Huisman G.W. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999, V.63, №1, P.21-53[39] Ren Q., Sierro N., Kellerhals M., Kessler B., Witholt B. // Appl. Environ. Microbiol. 2000, V.66, №4, P.1311-1320[40] Elsayed N.S., Aboshanab K.M., Aboulwafa M.M., Hassouna N.A. // African J. Microbiol. Res. 2013, V.7, №43, P.5025-5035[41] Pramanik N., Mukherjee K., Nandy A., Mukherjee S., Kundu P.P. // J. Appl. Polym. Sci. 2014, V.131, №22, 41080[42] Xin J., Zhang Y., Dong J., Song H., Xia C.G. // African J. Biotechnol. 2011, V.10, №36, P.7078-7087[43] Karthikeyan O.P., Chidambarampadmavathy K., Nadarajan S., Lee P.K., Heimann K. // Chemosphere. 2015, V.141, P.235-242[44] Zhu C., Chiu S., Nakas J.P., Nomura C.T. // J. Appl. Polym. Sci. 2013, V.130, №1, P.1-13[45] Pena C., Castillo T., Garcia A., Millán M., Segura D. // Microbial Biotechnol. 2014, V.7, №4, P.278-293[46] Pena C., Lopez S., Garcia A., Espín G., Romo-Uribe A., Segura D. // Ann. Microbiol. 2014, V.64, №1, P.39-47[47] Eisenstark A., McMahon K.J., Eisenstark R. // Journal of Bacteriology 1950, V.59, №1, P.75-81[48] Vela G.R., Rosenthal R.S. // Journal of Bacteriology 1972, V.111, №1, P.260-266[49] Dominguez-Diaz M., Meneses-Acosta A., Romo-Uribe A., Pena C., Segura D., Espin G. // European Polymer J. 2015, V.63, P.101-112[50] Choi G.G., Kim H.W., Rhee Y.H. // J. Microbiol. 2004, V.42, №4, P.346-352[51] Andreeva N.V., Bonartsev A.P., Zharkova I.I., Makhina T.K., Myshkina V.L., Kharitonova E.P., Voinova V.V., Bonartseva G.A., Shaitan K.V., Belyavskii A.V. // Bull. Exp. Biol. Med. 2015, V.159, №4, P.567-571[52] Bonartsev A.P., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Makhina T.K., Zernov A.L., Kudryashova K.S., Feofanov A.V., Akulina E.A., Ivanova E.V. // J. Biomaterials Tissue Engin. 2016, V.6, №1, P.42-52